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方法文章

MALDI-质谱成像技术用于研究Medicago truncatula根瘤中的代谢物

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DOI：

10.3791/51434

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2014年3月5日

 , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin- Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin- Madison

本文内容

摘要

质谱成像（MSI）是一种强大的工具，可用于在完整组织中发现和鉴定多种化学物质，同时将化合物保留在其原始环境中，从而为生物学过程提供新的见解。本文介绍了一种用于小分子分析的质谱成像方法。 

摘要

研究小分子（如药物或内源性代谢物）的大多数技术均采用组织提取物，这需要对目标组织进行匀浆处理，而该过程可能导致所研究的代谢通路发生变化1。质谱成像（MSI）是一种强大的分析工具，可提供生物组织切片中分析物的空间分布信息1-5。该技术已被广泛用于研究多种化合物，包括蛋白质、多肽、脂质以及内源性代谢物等小分子。利用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）-MSI，可同时检测多种代谢物的空间分布。本文介绍了一种专为豆科植物根部及根瘤开展非靶向代谢组学MSI实验而开发的方法，该方法有助于揭示其中发生的生物学过程。本文所述方法展示了一个典型的MSI工作流程，从样本制备到图像采集，并重点介绍了基质涂布步骤，演示了多种适用于小分子检测的基质应用技术。在生成质谱图像后，进一步讨论并演示了目标代谢物的分析与鉴定过程。此处介绍的标准工作流程可根据不同组织类型、分子种类和仪器设备进行简便调整。

引言

代谢组学这一新兴领域具有诸多重要的生物学应用，包括生物标志物的发现、解析植物及其他生物系统中的代谢通路，以及毒理学谱型分析4,6-10。研究生物系统时面临的一个主要技术挑战是在不干扰代谢过程的前提下对其代谢组通路进行研究11。基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）可实现对完整组织的直接分析，从而在单个器官12,13甚至单个细胞14,15水平上对分析物进行高灵敏度检测。

样品制备是生成可重复且可靠的质谱成像结果的关键步骤。图像质量在很大程度上取决于组织包埋介质、切片厚度、MALDI基质以及基质施加技术等因素。在成像应用中，理想的切片厚度为单个细胞的宽度（根据样本类型不同，约为8–20 µm）。MALDI需要在样品表面沉积一种有机结晶基质化合物，通常为弱酸，以辅助分析物的脱附和离子化过程16。不同的基质会为不同类别的化合物提供不同的信号强度、干扰离子以及离子化效率。

基质施加技术也会影响质谱成像的质量，不同类型的分析物适用于不同的施加方法。本实验方案介绍了三种基质施加方法：喷枪法、自动喷涂仪法和升华法。喷枪法基质施加在MALDI成像中已被广泛使用。其优点是相对快速且操作简便。然而，喷枪法施加基质的质量在很大程度上依赖于操作者的技能，通常可重复性较差，并容易引起分析物扩散，尤其是小分子分析物17。自动喷涂系统与喷枪法具有类似的原理，但其设计旨在消除手动喷枪操作带来的变异性，从而使喷雾更加可重复。该方法有时比传统的喷枪法更耗时。手动喷枪和自动喷涂系统均属于基于溶剂的基质施加方法。升华法是一种干法基质施加技术，由于其能够减少分析物扩散，近年来在代谢物和小分子的质谱成像中越来越受欢迎；然而，该方法缺乏提取和检测高分子量化合物所需的溶剂18。

代谢物的可靠鉴定通常需要精确的质量测定以获得初步鉴定结果，随后通过串联质谱（MS/MS）实验进行验证，并将测得的MS/MS谱图与标准品、文献或理论谱图进行比对。本方案中，采用高分辨（在m/z 400处质量分辨率为60,000）液相色谱-质谱（LC-MS）联用基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI），以Medicago truncatula根部及根瘤为生物模型，同时获取内源性代谢物的空间分布信息和可靠的代谢物鉴定结果。MS/MS实验可直接在组织上通过MALDI-MSI完成，也可在组织提取物上通过LC-MS进行，用于验证代谢物的鉴定结果。

该方案提供了一种简单的方法，用于绘制M. truncatula中内源性代谢物的分布图谱，该方法可经调整后适用于多种组织类型和生物系统中进行小分子的质谱成像（MSI）。

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方案

1. 仪器设备

  1. 基质辅助激光解吸电离飞行时间/飞行时间质谱成像（MALDI-TOF/TOF MSI）。使用配备MALDI源的质谱仪分析小分子（参见材料/设备表）。根据目标分析物选择正离子或负离子模式进行检测。设定目标质荷比范围，在样品表面沿x和y方向以50 µm间距采集每个像素点500次激光脉冲，以生成离子图像。可根据需要调整光栅宽度和激光脉冲次数，以分别获得更高的空间分辨率和最大信号强度。使用涂布于载玻片或直接施加于组织上的DHB基质峰或内标物对质谱数据进行质量校准。
  2. 高分辨液相色谱-质谱（LC-MS）。（参见材料/设备表）根据目标分析物的不同，采用反相（RP）C-18色谱柱或正相（NP）HILIC色谱柱，结合液相色谱-质谱法分析样品提取物。根据具体样品类型选择合适的流动相及梯度程序。根据样品类型选择正离子或负离子模式进行检测。

2. 组织制备

  1. 从植株上剪下根瘤，保留3-4 mm的根段与根瘤相连。
  2. 解剖后立即用镊子将组织放入冷冻切片杯中，并用明胶（去离子水中100 mg/ml ）覆盖。必须确保组织牢固贴附于杯底 ，且无气泡存在。
  3. 将切片杯置于干冰/乙醇浴中快速冷冻，直至明胶硬化并变为不透明状态。将样品储存于-80 °C直至使用。
  4. 从-80 °C冰箱中取出样品，去除塑料冷冻切片杯，并削去多余的明胶。取约硬币大小的包埋介质（OCT），将包埋组织固定于冷冻切片机的持样头（chuck）上，注意避免OCT直接接触组织。将持样头放入冷冻切片机样品盒中，直至OCT完全凝固。
  5. 将持样头和明胶在冷冻切片机样品盒内（温度设定为-20或-25 °C）平衡约15分钟。
  6. 使用冷冻切片机（见材料与设备表）将组织切成约一个细胞厚度的切片（根据组织类型，厚度为8-20 µm），并通过用手心加热载玻片背面（非ITO涂层面）的方式，将切片解冻贴附至ITO涂层玻璃载玻片上。将加热后的载玻片ITO涂层面向下靠近冷冻组织切片，使切片自然粘附于载玻片表面。将切片在载玻片上紧密排列，有助于在质谱成像（MSI）过程中获得更好的对齐效果。

3. 基质应用

  1. 基质辅助激光解吸电离基质的喷笔涂布
    1. 所有喷笔操作均应在通风橱内进行。
    2. 使用甲醇彻底清洗喷笔的溶液容器和喷嘴（参见材料/设备表），然后将DHB基质溶液（150 mg/ml，溶于50%甲醇/0.1% TFA v/v）注入溶液容器中。
    3. 将喷笔保持在距样品约35 cm的位置，对载玻片表面喷涂10至15层基质，每层喷涂持续10秒，层间干燥30秒。
    4. 操作完成后，再次用甲醇彻底清洗喷笔，以防止基质溶液造成堵塞。
  2. 自动喷涂仪涂布MALDI基质
    1. 按照自动喷涂系统制造商提供的启动说明进行操作。
    2. 在根瘤代谢物的质谱成像（MSI）中，使用40 mg/ml（溶于50%甲醇/0.1% TFA v/v）的DHB作为基质时，设置温度为~80 °C，移动速度为1,250 mm/min，流速为50 µl/min，扫描次数为24次。为获得最佳覆盖效果，建议每次扫描后将喷嘴旋转90°和/或偏移1.5 mm。启动喷涂程序。
      需要说明的是，此处使用的特定喷涂系统会对喷嘴加热以加速溶剂蒸发。随着溶剂蒸发，基质浓度迅速升高。通过喷笔和自动喷涂仪施加的基质浓度具有可比性。
    3. 按照自动喷涂系统制造商提供的关机说明进行操作。
  3. 升华法涂布MALDI基质
    1. 称取300 mg DHB放入升华室底部（参见材料/设备表）。
    2. 使用双面导电胶带将载玻片粘附在冷指（升华室顶部）上，组织切片面朝下。用双面胶带覆盖载玻片背面全部区域，以确保导电均匀，从而实现基质的均匀沉积。
    3. 用C型夹将升华室的上下两部分夹紧。连接真空泵，并在顶部储水槽中加入冰和冷水。
    4. 将升华室置于室温下的加热套中。
    5. 开启真空泵。等待15分钟后，开启加热套。加热套应在10分钟内升温至120 °C。
    6. 10分钟后，关闭加热，关闭真空阀门（使室内保持真空状态），并关闭真空泵。
    7. 让升华室自然冷却至室温，打开阀门释放真空，取出样品。升华室的尺寸将决定升华到载玻片上的基质量。较大的升华室（相当于400 ml烧杯大小）使用约300 mg DHB，而较小的升华室（相当于150 ml烧杯大小）使用约100 mg DHB，且需裁剪载玻片以适配腔体。

4. 图像采集

  1. 使用WiteOut修正液笔在样品的每个角落标记“+”形图案，作为"教学点"。将载玻片放入MALDI载片适配板中，并使用扫描仪获取样品的光学图像。
  2. 使用仪器公司提供的软件设置图像采集文件，光栅步长为50 µm，激光直径等于或小于光栅步长。在该特定仪器上，最小激光设置对应的激光直径约为10 µm，较小激光设置的直径为40–50 µm。
  3. 将光学图像导入软件，并将载片与光学图像对齐。
  4. 在开始采集前，使用常见基质簇离子、内标物或校准混合物对仪器进行校准。
  5. 指定需通过质谱成像（MSI）分析的组织区域，包括载玻片上的一处纯基质点，作为"空白"对照。
  6. 开始采集。

5. 图像生成

  1. 在供应商提供的商业软件中打开成像文件，并提取离子图像。此外，也可使用其他开源软件进行质谱成像数据处理19。

6. 代谢物鉴定

  1. 使用厂商特定软件（参见材料/设备表）从质谱图中选择感兴趣的特定 m/z 值。当从质谱图中选择分析物峰并生成仅定位于组织切片的离子图像时，可将分析物与基质离子区分开。
  2. 生成目标分析物列表，并进行串联质谱（MS/MS）实验。代表性结果中的表1和表2提供了分析物列表的示例。
  3. 在高分辨质谱仪（或如有条件，高分辨基质辅助激光解吸电离质谱仪）上对目标分析物进行靶向液相色谱-质谱（LC-MS）分析，以获得其精确质量测定值，并进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析以获得特征性碎片模式。
  4. 进行数据库检索，以确定目标分析物的初步鉴定结果。常用的代谢物数据库包括：METLIN、ChemSpider、PubChem、KEGG 和 HMDB。
  5. 为验证基于精确质量数据库检索所得的初步鉴定结果，需将目标分析物的串联质谱（MS/MS）图谱与标准品、文献数据和/或碎片预测软件的 MS/MS 谱图进行比对。

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结果

MSI 实验概述如图1所示。实验最开始的关键步骤是样品制备。将根瘤从植物根部切下并包埋于明胶中。在冷冻过程中，必须将组织紧贴低温恒温器杯底压平，不得产生气泡；这将有助于切片时组织的准确定位与整齐排列。在切片过程中，控制切片厚度至关重要：切片过薄会导致组织撕裂，破坏组织完整性；而切片过厚则会降低从组织中提取和检测到的分析物数量。基质的选择及其涂布方法将决定所检测分析物的种类。采用多种基质组合可获得互补的结果。本文介绍了三种基质涂布技术：喷雾法速度快，但由于分析物扩散，通常不适用于小分子的质谱成像；自动喷涂系统和升华法可形成更小的基质晶体，重现性更好，且分析物扩散更少。图2展示了Medicago truncatula根瘤切片的光学图像。图3分别展示了使用喷雾法、自动喷涂系统和升华法时基质覆盖情况及晶体大小的光学图像示例。

传统的基质（如DHB）会在低质荷比范围（m/z 100–400）内产生大量离子20，这些基质离子可能干扰该范...

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讨论

如上所述，样品制备是质谱成像（MSI）工作流程中最关键的步骤。组织包埋不均匀会导致切片困难，甚至在某些情况下无法进行切片。切片尺寸和充分的平衡时间对于维持组织完整性、避免折叠和撕裂至关重要。基质的选择及其涂布方法将影响可检测分析物的种类、空间分辨率以及结果的重复性。联合使用多种基质或不同的涂布技术可能获得互补的结果。

该方法专为内源性代谢物的非靶向质谱成像而设计 M. truncatula 根瘤组织，但也可轻松适用于其他组织类型和生物学问题。小分子质谱成像（MSI）推荐的基质施加方法为升华法和自动喷涂法。通过调整自动喷涂法增加沉积在组织上的溶剂量，可提高分析物的提取效率，从而有助于检测较高分子量的化合物；若进行脂质、肽类的质谱成像，此方法尤为适用。 等等使用其他类型的组织时，主要调整在于切片厚度。理想情况下，组织应被切成单个细胞的厚度；因此，植物组织可能需要较厚的切片，而动物组织则可能需要较薄的切片。如果出现折叠或撕裂现象，通常需要在切片前延长平衡时间，或采用较厚的切片厚度。在进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）以获得准确质量数时，可根据目标分析...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢威斯康星大学麦迪逊分校农学系的 Jean-Michel Ané 博士提供截形苜蓿（Medicago truncatula）样品。本研究部分由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 CHE-0957784、威斯康星大学研究生院、威斯康星校友研究基金会（WARF）以及 Romnes 教师研究奖学金项目（授予 L.L.）提供支持。E.G. 获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1256259）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
明胶Difco214340加热至溶解
冷冻切片机- HM 550赛默飞世尔科技956564A
氧化铟锡（ITO）镀膜玻璃载片 Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm × 75 mm × 0.8 mm（宽 × 长 × 厚）
2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质 ICN BiomedicalsPI90033
喷枪Paasche Airbrush CompanyTG-100D与75 ml钢制容器联用
自动基质喷涂系统 - TM-SprayerHTX Technologies, LLCHTX.TMSP.H021-U仪器安装时将提供具体的启动和关闭说明
升华装置 Chemglass生命科学CG-3038-01
真空泵 - Alcatel 2008 AIdeal Vacuum ProductsP10976极限压力 = 1 × 10-4 托
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF布鲁克·道尔顿276601
FlexImaging布鲁克·道尔顿269841一个例子是 "特定供应商软件"
MALDI LTQ Orbitrap赛默飞世尔科技IQLAAEGAAPFADBMASZ用于精确质量测定的高分辨率 MALDI 仪器
Q Exactive赛默飞世尔科技IQLAAEGAAPFALGMAZR用于精确质量测定的高分辨率液相色谱-质谱联用仪

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