人血清中分离小非编码RNA

摘要

本方案描述了一种从人血清中提取小RNA的方法。我们已采用该方法从癌症患者血清中分离microRNA，用于DNA芯片和单重定量PCR分析。本方案使用苯酚和硫氰酸胍试剂，并进行了改良，以获得高质量的RNA。

摘要

RNA 及其表达的分析是许多实验室的常规工作。近年来，微小 RNA（如 microRNA）的发现备受关注，这类小 RNA 存在于哺乳动物细胞中。这些小 RNA 是强有力的基因调控因子，控制着生长、发育和细胞死亡等重要通路，因此其在体液中的表达水平引起了广泛研究兴趣。这主要是因为它们在癌症等人类疾病中出现表达失调，并具有作为血清生物标志物的潜在应用价值。然而，血清中 miRNA 表达的分析可能存在困难。通常情况下，血清样本量有限，且其中总 RNA 含量较低，而小 RNA 仅占总 RNA 的 0.4–0.5%¹。因此，从血清中分离出足量且高质量的 RNA 是当前研究人员面临的主要挑战之一。在本技术论文中，我们展示了一种仅需 400 µl 人血清即可获得足量 RNA 的方法，适用于 DNA 芯片或 qPCR 分析。该方法的优势在于操作简便且能获得高质量 RNA。该方法无需专门用于小 RNA 纯化的小柱，仅使用普通实验室常见的通用试剂和设备。我们的方法采用相位锁定凝胶（Phase Lock Gel）以消除苯酚污染，同时保证 RNA 的高质量。此外，我们还引入了一个额外步骤，以在分离过程中进一步去除所有污染物。该方案在从血清中分离总 RNA 时效果显著，RNA 产量可达最高 100 ng/µl，同时也可适用于其他生物组织样本。

引言

近年来，人们越来越重视发现可用于早期检测人类疾病的新颖生物标志物。许多研究集中于利用小RNA（如微小RNA²（miRNA或miR））作为潜在的标志物。这类小RNA存在于血清等体液中，研究表明其对降解具有较强抵抗力，并且在多种不同的环境条件下均保持稳定³。鉴于这些特性，血清或循环miRNA是理想的生物标志物^4,5。目前，从小分子生物液体中分离小RNA主要有两种方法。第一种方法采用基于离心柱的技术来结合并洗脱小RNA⁶，而第二种方法则使用经典的苯酚与硫氰酸胍试剂方案⁷。我们开发了一种简单、高效且无需离心柱的小RNA提取方案，可用于从人血清中分离小RNA。所获得的RNA可直接用于后续实验，包括DNA寡核苷酸芯片分析和RNA测序。

本实验方案的制定源于我们在使用基于苯酚的方法从血清中分离RNA时遇到了若干问题。传统的Chomczynski方法在大多数实验室中被广泛采用，且多数商业供应商均可提供相应的试剂。然而，尽管这些方法应用广泛，但目前尚未建立严格的规范指南，以确保从体液（尤其是血液或血清）中稳定地提取出高质量的RNA。

从血清中分离RNA时常见的问题包括RNA得率低以及分离过程中所用试剂（尤其是苯酚）的污染。我们的方法可消除这些苯酚污染物，从而为下游分析（如定量PCR（qPCR）和RNA测序）提供高质量的RNA。我们进一步在miRNA芯片上对该RNA进行了检测。

方案

注意：来自健康患者或癌症患者的血清样本均在获得知情同意的情况下，根据悉尼皇家阿尔弗雷德亲王医院（Royal Prince Alfred Hospital Sydney）批准的人类伦理协议（编号 X10-0016 和 HREC/10/RPAH/24）以及悉尼科技大学的伦理规范获取。血清样本由悉尼多家医院的患者在手术前采集，并储存于 -80 °C 环境中。

1. 从血清中分离小RNA 

采用改良的Tri-Reagent RT LS方案从人血清中提取总RNA。

1. 将冻存的血清样本置于冰上解冻，然后取400 µl新鲜解冻的血清转移至已标记的微量离心管中。
2. 用100 µl无RNase的H2O稀释血清₂O，并加入蛋白酶K至终浓度为1 mg/ml。
3. 37 °C 下孵育 20 分钟 以允许蛋白酶K对蛋白质进行消化。
4. 为确保完全溶解，加入1.5倍体积的Tri-Reagent RT LS和100 µl的4-溴苯甲醚。
5. 轻轻倒置匀浆液，重复吹打5秒 并转移至一个标记的2 ml 重型相锁管
6. 将匀浆在12,000 × g离心20分钟 在 4 °C 下。
7. 小心地将至少1 ml的所得水相溶液倒入新的DNA Lobind离心管中。有机相和中间层应被截留在Phase Lock管的白色凝胶层下方。
8. 加入5.0 µl甘油（5 mg/ml）和500 µl 100%异丙醇至水相溶液中，颠倒混匀，于-20 °C过夜孵育。
9. 过夜孵育后 孵育后，将样品以离心机离心20分钟 在4 °C下以12,000 × g离心。
10. 弃去澄清的上清液，并进行一次 "闪光" 离心2分钟 在4 °C、16,000 × g条件下离心。
11. 用移液器小心吸除沉淀物周围的澄清溶液。
12. 用1 ml洗涤沉淀 加入70%乙醇，于10,000 × g离心10分钟。倾去洗涤液，重复洗涤步骤。

2. RNA 重悬 进入溶液

1. 将沉淀重悬于 10 µl 无 RNase 的 H₂O 中，确保沉淀完全溶解。为确保 RNA 完全溶解，可将样品在 55 °C 下加热 5 分钟，并在此期间通过反复吹打混匀样品。为获得更高的总 RNA 产量，可合并来自同一患者的两份 RNA 制备样品。
2. 使用紫外-可见分光光度计定量重悬的 RNA，并利用 2100 Bioanalyzer 评估 RNA 质量。将合并后的 RNA 样品储存于 -80 °C，用于后续实验。

结果

图1 显示了从血清中分离的RNA的典型紫外/可见光吸收光谱。从该图谱中我们观察到，在280 nm处存在蛋白质污染，在270 nm和230 nm处分别存在酚和有机污染物。此外，在260 nm处还检测到残留的硫氰酸胍。为了减少污染物，我们对标准的Tri-Reagent RT-LS操作流程进行了一系列优化步骤。我们添加了5 mg/ml的糖原，以提高总RNA得率并减少污染（黑色线条，图1A）。

进一步观察发现，异丙醇去除后，RNA沉淀周围仍残留约100–300 µl洗涤缓冲液。因此在实验步骤中增加了一次离心，小心移除残留的洗涤液。这一操作使吸光度峰从270 nm shifted至280 nm（红色曲线，图1B）。我们推断，该“瞬时”离心步骤降低了270 nm处的苯酚污染，因此280 nm处的吸收峰更可能是由蛋白质污染所致。

为进一步提高RNA产量并减少蛋白质残留，我们增加了一个Phase Lock Gel步骤。该步骤可实现水相的完全转...

讨论

microRNA 群体约占血清总 RNA 的 0.4-0.5%。此外，人血清中还含有较高含量的蛋白质。为了提高 RNA 的纯度并减少蛋白质和苯酚类污染物，我们在传统 Chomczynski 方法的基础上增加了若干步骤进行了改良⁹。

采用标准的Tri-Reagent RT-LS法（Molecular Research Centre）从血清中分离总RNA，但在本实验室操作时，该方法获得的RNA量较少，且含有多种污染物。

图1 显示了一条紫外分光光度法RNA谱图，在280 nm处显示出蛋白质污染，在270 nm处有苯酚污染，在230 nm处存在其他有机污染物。在260 nm处还检测到了试剂硫氰酸胍。

为了解决血清RNA得率低和减少污染的问题，我们在标准的Tri-Reagent RT-LS流程基础上增加了一系列优化步骤。首先，我们发现将血清按1:5比例稀释可降低蛋白质污染。该步骤已被其他研究推荐¹⁰，并...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Center，美国	TR 118
无RNase水2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
蛋白酶K	Finnzymes，芬兰	EO0491
重相锁管	5PRIME	2302830	2 ml容量
DNA Lobind管	Eppendorf	0030 108.078	1.5 ml容量
糖原	Invitrogen，美国	10814-010	5 mg/ml
RNA级异丙醇	Sigma Aldrich，美国	I9516	100%
冷冻离心机	John Morris
Nanodrop紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher Scientific，美国
RNA级乙醇	Sigma Aldrich，美国	E7023	70%
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent，美国