本文介绍了检测单个荧光标记的蛋白质分子与悬浮在两个光镊微球之间的单个DNA分子相互作用的仪器设备和方法。
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本文内容
摘要
摘要
本文描述了光镊技术与单分子荧光检测相结合用于研究蛋白质-DNA相互作用的方法。该方法能够在溶液中研究分子间的相互作用（从而避免其他单分子技术中因靠近表面而引起的问题），同时可控制DNA的延伸程度，并追踪相互作用动力学随力学参数和DNA序列的变化。文中阐述了实现单分子有效光捕获和纳米级定位的技术方法。我们展示了在实验条件下，研究标记Atto532的乳糖阻遏蛋白（lacI）与含有特定靶序列（操纵子）的DNA分子之间相互作用的过程。该方法能够观察到蛋白质在操纵子位点上的特异性结合，以及在靶标搜寻过程中沿DNA的一维扩散行为。该技术不仅广泛适用于蛋白质-DNA相互作用的研究，也可应用于分子马达的研究，特别是在需要控制施加于配对轨道聚合物（如肌动蛋白或微管）张力的实验体系中。
引言
单分子（SM）技术在过去三十年中取得了长足发展，旨在克服传统体相溶液测量方法的一些局限性 1-3单个生物分子的操作为测量生物大分子的机械特性提供了机会4 并控制蛋白质-蛋白质的机械参数5 蛋白质-DNA 相互作用6,7单分子荧光检测则是研究蛋白质活性的一种极为通用的工具 体外 和 体内，从而实现以纳米级精度对单个分子进行定位与追踪。事实上，通过将仪器的点扩散函数拟合到单分子图像，其定位精度主要取决于信噪比（SNR），最高可达约一纳米。8,9这些方法在研究运动蛋白的动力学以及DNA结合蛋白靶标搜寻背后的扩散过程方面具有重要应用价值。能够确定扩散系数与DNA序列的关系、蛋白质在靶标上的停留时间，并精确测量一维扩散过程中所探索的DNA长度，这些能力为研究蛋白质-DNA相互作用动力学以及特异性靶标搜寻机制提供了强有力的工具。
最近，这两种技术的结合催生了新一代的实验装置10-14 实现对生物底物（例如肌动蛋白丝或DNA分子）的同时操控，以及对其相互作用伴侣酶（例如肌球蛋白或DNA结合蛋白）的检测与定位。这些技术的主要优势在于能够对被捕获的聚合物施加力学控制，从而研究相互作用动力学与力或扭矩之间的关系。此外，该方法允许在远离表面的环境中测量生化反应，克服了传统单分子方法的主要局限之一。 即， 对被研究分....
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方案
1. 具有纳米级稳定性的光镊装置
实验装置必须提供两个光镊，其指向稳定性需达到纳米级，且捕获激光的强度波动低于1%。在典型张力（1 pN至数十pN）、捕获刚度（0.1 pN/nm）和测量带宽（图像采集速率20 sec-1）条件下，满足上述条件可确保哑铃结构的纳米级稳定性。实验装置示意图见图 1。
- 光镊的设计与构建15,17：
- 将实验装置安装在带有主动隔振系统的光学平台上，以减少机械振动。将显微镜结构安装在弹性隔振器上，以吸收声学噪声及显微镜结构的机械共振。
- 在捕获激光光路中、靠近激光源的位置插入一个光隔离器，以减少因光反馈引起的随机振幅波动。
- 尽可能缩短捕获激光的光路长度，并将整个光路封闭在密闭箱体内，以减少由气流和湍流引起的激光指向波动。
- 通过将单一近红外激光源（Nd:YAG 激光器，波长 1,064 nm）分成两束正交偏振的光束，构建双光镊系统。请勿使用时分复用陷阱，因其会在张力下引起哑铃状结构的振荡12。
- 使用由直接数字频率合成器（DDS）驱动的声光偏转器（AOD），以实现至少一个光阱的精细移动及对DNA张力的精确调控。与压控振荡器（VCO）相比，DDS可提供更优的光阱稳定性。
- 在聚光镜的后焦平面处插入两个....
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结果
在成功的实验中，一个（或多个）标记的蛋白质会在DNA分子上发生结合/解离和/或一维扩散（图3A）。通过定位蛋白质在DNA分子上的位置，可以量化其动力学参数，并将其与DNA序列关联。当采用引起一维扩散的缓冲条件时，可追踪蛋白质的运动轨迹，进而确定例如一维扩散系数D1D等参数。
通过将点扩散函数（PSF）拟合为二维高斯函数，或在处理大量数据集时采用一种更快速的近期发表算法（径向对称中心法，RSC）26,27，可确定每帧图像中单个光斑的精确定位。后一种方法通过确定图像中径向对称性最大的点，实现通常与高斯拟合相当的定位精度。在这两种情况下，均可通过可免费获取的 MATLAB 程序实现追踪27。
图3A 显示了一个典型实验的延时图像，其中单个LacI分子在非特异性DNA序列上扩散，而另一个LacI分子则特异性结合在位于DNA分子中心的一个操纵子上。图3B 显示了两个Lac.......
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讨论
在过去十年中，单分子操纵与成像技术在空间和时间分辨率方面取得了显著进展。操纵与成像技术的结合构成了强大仪器的基础，如今可实现对单个生物大分子（如DNA、RNA或细胞骨架丝）机械条件的控制，同时精确定位与同一生物大分子相互作用的单个蛋白质。控制被捕获生物大分子机械条件具有特殊意义。事实上，在活细胞中，核酸会持续受到与其相互作用的酶和蛋白质所引起的机械应力；类似地，由相互作用的蛋白质和分子马达构成的复杂网络会调节细胞骨架丝上的张力。另一方面，检测并精确定位与核酸相互作用的蛋白质的能力，使得能够测量分子相互作用随DNA或RNA序列位置变化的情况。
结合单分子操控与成像技术需要对实验装置和生物构建体进行精心设计。光镊必须提供稳定的支撑，确保悬浮聚合物在纳米级水平上的稳定性。通过仔细隔离实验装置与各种机械噪声源，并尽量减少激光指向和振幅的波动，可实现这种稳定性。利用由直接数字频率合成器（DDS）驱动的声光偏转器（AOD），可实现光镊的精确（亚纳米级）移动。本文中，我们展示了一步步优化并检测光镊在纳米级水平上稳定性的实验方案。
采用配备 .......
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致谢
感谢 Gijs Wuite、Erwin J.G. Peterman 和 Peter Gross 在微流控技术方面的帮助，以及 Alessia Tempestini 在样品制备方面的协助。本研究由欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）资助，资助协议编号为 n° 284464；同时获得意大利教育、大学与研究部 FIRB 2011 RBAP11X42L006、Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2 项目，以及旗舰项目 NANOMAX 框架内的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 弹性体隔振器 | Newport | Newdamp | 根据显微镜重量和共振频率选择合适的 Newdamp 弹性体 |
| 光学隔离器 | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | |
| Nd:YAG 激光器，1,064 nm 波长 | Spectra-Physics | Millennia IR | |
| 声光偏转器 (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | |
| 直接数字频率合成器 | Analog Devices | ||
| 四象限探测光电二极管 | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | |
| DIO 和 FPGA 板 | National Instruments | NI-PCI-7830R | |
| 卤素灯 | Schott | KL 1500 LCD | |
| 聚光镜 | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apochromat | |
| 物镜 | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA 水浸 | |
| 532 nm 激光器 | Coherent | Sapphire | |
| CCD 200X 和 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | |
| 电子倍增 CCD | Hamamatsu | C9100-13 | |
| 纳米精度压电载物台 | Physik Instrumente | P-527.2CL | |
| 发射滤光片 | Chroma Technologies | 600/100m | |
| 二氧化硅微珠 (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | |
| 戊酸戊酯 | Sigma Aldrich | 46022 | 易燃液体和蒸气 (No 1272/2008) |
| 硝化纤维素 | Sigma Aldrich | N8267-5EA | 易燃固体 (No 1272/2008) |
| 加热块 | MPM Instruments Srl | M502-HBD | 带两个可拆卸模块；预热至 120 °C |
| NanoPort 组件 | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | |
| 聚醚醚酮管 | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | |
| 自制金属支架，用于组装由有机玻璃制成的流动室压力储液器 | |||
| 2.5 ml 鲁尔锁头注射器 | Terumo | SS 02LZ1 | |
| 关闭阀 | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | |
| 无法兰接头 | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | |
| 氟化乙烯丙烯管 | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | |
| 两个计算机控制的电磁阀 | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | |
| 压力传感器 | Druck LTD | PTX 1400 | |
| 生物素-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | |
| 末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | |
| ATTO532 马来酰亚胺 | Sigma Aldrich | 68499 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | 可燃液体，经皮肤吸收有害。刺激物，致畸物。H226；H303；H312；H316；H319；H331；H360；P201；P261；P280；P305；P351；P338；P311 |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 还原型 L-谷胱甘肽 (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | 急性毒性，经口（类别 5），H303 |
| Amicon Ultra-15，PLQK Ultracel-PL 膜，10 kDa 截留分子量离心浓缩管 | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 链霉亲和素包被的聚苯乙烯微珠 1.87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 |
参考文献
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L.
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