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方法文章

Drosophila melanogaster 自发运动活性的测定

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DOI：

10.3791/51449

⸱

2014年4月10日

 ,  , 
1Genetics and Developmental Biology, School of Medicine, University of Connecticut Health Center

本文内容

摘要

Drosophila melanogaster 可用于研究影响自发运动行为等表型的遗传或环境干预。  本文描述了一种利用配备红外光束的监测仪和数据分析软件来定量测定自发运动活性的实验方案。 

摘要

Drosophila melanogaster 被广泛用作研究影响行为的环境和遗传操作的优秀模式生物。其中一种行为是自发性运动活动。本文描述了一种实验方案，该方案利用 Drosophila 群体监测仪和追踪系统，能够连续数天持续监测果蝇的自发性运动活动。该方法简便、可靠且客观，可用于研究衰老、性别、食物热量含量变化、药物添加或模拟人类疾病的遗传操作所产生的影响。

引言

果蝇， 黑腹果蝇被用作研究学习与记忆、社会互动、攻击行为、药物滥用、睡眠、感觉功能、求偶及交配等复杂行为机制的重要模式生物1,2一种通过多种实验方案研究的行为是自发运动活性。负向趋地性是最早开发用于测量该行为的方法之一。 果蝇 活动性，本方案涉及测量果蝇被震落到容器底部后，能够爬升至小瓶特定高度的果蝇所占的百分比1,3.  该方法具有操作简便、成本低廉的优点，且无需任何特殊设备，因此可在任何实验室中进行。该方法已被用作一种有价值的筛选工具，用于研究不同遗传操作对果蝇运动能力的影响。3然而，该方法耗时且劳动强度大，同时由于试管振荡程度不一及人工记录，可能存在偏差。 

通过开发快速迭代负向重力趋性（Rapid Iterative Negative Geotaxis, RING）方法4,5，负向重力趋性实验得到了改进，该方法在将果蝇震落到管底后对果蝇管进行拍照。该方案的优势在于其高灵敏度，并可同时检测大量果蝇管。然而，该方案仍可能存在人为误差，且仅能测量负向重力趋性。其他实验室已采用在培养管中直接观察的方法来测定果蝇的运动活性6。

近年来，已开发出多种用于测量果蝇运动活性的视频记录系统。  一种视频监测方案在开始记录前预留了调整时间7.  斯劳森描述的方法 等 也使用气流脉冲在记录开始前阻止动物运动，这可能会对动物造成应激7.  该方法可提供平均速度、最大速度、运动时间等信息。  另一种三维追踪系统可测量单只果蝇在约0.2秒自由飞行起飞过程中的最大速度8一种三维视频监测方案利用表达GFP的果蝇和配备有荧光检测滤光片的多台相机来确定果蝇的活动能力9在本实验方案中，果蝇倾向于表现出圆柱形的飞行轨迹，这可能是由于 果蝇 培养管10该方法通过使用一种穹顶装置得到改进，该装置可同时测量两只果蝇的自发运动。11一种高通量方法，利用摄像头自动监测并量化个体及社会行为 果蝇 也已有描述12.  邹 等 开发了一种行为监测系统（BMS），该系统利用两台计算机辅助摄像头记录个体实蝇的终生行为和活动，如静止、移动、飞行、进食、饮水及死亡等情况13还有其他几种视频系统已被开发用于监测果蝇的行为活动14,15.  

本文介绍一种利用群体监测仪定量分析Drosophila活动的方法。这些监测仪置于温度与湿度受控的培养箱中，在25 °C条件下维持12小时光照与12小时黑暗的光周期。每台群体监测仪在三个不同高度位置设有环形排列的红外光束。每当果蝇穿过这些环时，便会阻断红外光束，该信号由微处理器记录，微处理器可独立记录并统计试管内果蝇的活动次数。微处理器以用户自定义的时间间隔（可从1秒至60分钟不等）将试管内的总活动量上传至计算机。本方法为果蝇适应新环境提供了充足时间，并可同时测量多达120个果蝇群体的自发运动活动。此外，本文还描述了培养基的制备、果蝇的饲养管理、在温控培养箱中设置活动性群体监测仪的操作步骤，以及可能影响实验结果的多种因素。该方法可用于研究不同环境因素或遗传修饰对果蝇自发运动活动的影响。

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方案

注意：Canton-S 品系是来自布卢明顿果蝇资源中心的标准野生型背景品系。

1. 食物制备及1,000 ml食物的配方

注意：本节描述食物制备的方案。使用大型金属锅一次制备约 18 L 食物。此处描述的方案已按比例缩小，使用 1,000 ml H2O。食物需高压灭菌两次。

  1. 将 113 克蔗糖和 28 克酿酒酵母溶于 643 毫升水中。将混合物置于设定为 25 °C 的加热板上，使用搅拌子持续搅拌 15 分钟。
  2. 将食物溶液高压灭菌 20 分钟。
  3. 将 49 克玉米粉和 8.1 克琼脂溶于 268 毫升水中，并加入第 1.2 步所述的已灭菌食物混合物中。用大勺或打蛋器充分混合。
  4. 将食物混合物再高压灭菌 20 分钟。
  5. 将食物倒入培养皿中，在持续使用搅拌子搅拌的条件下冷却。若需向食物中添加其他溶液（如米非司酮（RU486）），则将食物保持在 60 °C 的加热板上，并在食物达到所需温度时加入该溶液。
  6. 将 2.4 克丙酸甲酯溶于 10.7 毫升 100% 乙醇中，并置于冷板上用搅拌器完全溶解并混合约 15 分钟。
  7. 当食物温度降至 60 °C 时，加入丙酸甲酯溶液并充分混合。
  8. 使用泵或食物分装器将约 10 毫升食物倒入一个广口瓶中。使用食物分装器可一次同时向 100 个广口塑料瓶（1 盘）中分装食物。
  9. 用 Kimwipes 纸和纱布覆盖瓶口，将食物在室温下放置 12–24 小时使其冷却。将食物储存于 4 °C 环境中，并在 3–4 周内使用。使用前需将食物恢复至室温，用于果蝇实验。

2. 玻璃小瓶的准备

  1. 按照步骤1中列出的方案制备食物。
  2. 将5 ml食物分装至每个细口玻璃小瓶中，该体积适合用于种群监测仪。食物量应足够低，以确保低于种群监测仪的最低环位置。
  3. 待食物冷却至室温后，用海绵塞盖住小瓶，并在4 °C下保存最多两周。由于小瓶中的食物量较少，建议在一周至两周内使用完毕，以防止干燥。
  4. 使用前将小瓶恢复至室温。

3. 亲代果蝇的饲养

  1. 将果蝇饲养在装有标准实验室培养基的宽口塑料瓶中，并将瓶子置于温度控制、湿度适宜的环境培养箱中，25 °C 下以 12 小时光照/12 小时黑暗的周期培养。本实验室的光照期从上午 6:00 开始。
  2. 在早晨清除将用于收集亲代果蝇的瓶子中的成虫。
  3. 收集新羽化的果蝇，并在羽化后 8 小时内使用 CO2 垫台按性别分离，以确保雌蝇为处女蝇。果蝇在羽化后约 8 小时开始交配。
  4. 当处女雄蝇和雌蝇年龄介于 5 至 10 天时，将 10 只雄蝇和 10 只雌蝇放入一个装有标准培养基的瓶子中，并在培养基表面添加数粒活性酵母。
    注意：通过使用相同数量的果蝇并在瓶中保留两天，以控制幼虫密度。添加活性酵母可促进产卵。
  5. 将果蝇置于 25 °C、12 小时光照/12 小时黑暗循环的温控培养箱中交配并产卵，持续 2 天。设置 5–10 瓶亲代果蝇。
  6. 每隔一天将果蝇转移至新的塑料瓶中，并将含有卵的瓶子保留在 25 °C 的培养箱中。

4. 实验果蝇的收集

  1. 9天后，果蝇将开始从亲代果蝇产卵的试管中羽化（见步骤3.6）。清除并丢弃第一天羽化的果蝇，然后将试管放回培养箱。第一天羽化的果蝇多为雌性。第二天羽化的果蝇群体在发育阶段上更为同步。
  2. 在24小时内，将新羽化的果蝇置于CO2麻醉垫上，用画笔或金属勺每管收集25只雄蝇和25只雌蝇。使果蝇在CO2垫上停留时间尽可能短，以减少CO2的潜在影响。在试管上标注羽化日期。实验组和对照组均至少准备5个重复试管。
  3. 将试管置于温度可控的环境培养箱中，保持25 °C、12小时光照/12小时黑暗的循环条件。
  4. 每隔一天使用漏斗将果蝇转移至新的塑料试管中。
  5. 继续培养果蝇，直至达到实验所需的年龄。

5. 设置移动监测设备

  1. 将种群监测装置置于温度可控的培养箱中。
  2. 使用四线电话线将每个显示器连接到电源供应接口单元（PSIU） 通过 5 路分路器（多线路），可将最多 5 台独立显示器连接至 PSIU 的一个接口。参见 图1A 和 2B.
  3. 将PSIU连接至交流电源插座（100-240 V）。将电源输出连接器插入PSIU的两个配对接口之一。正确连接后，相邻的绿色指示灯将亮起绿光。
  4. 将PSIU连接至通用串行总线（USB）硬件。使用USB线缆将USB硬件与Macintosh或Windows PC连接，用于数据记录。建议使用一台专用于数据采集的计算机，因为数据采集过程可能持续数天之久。
  5. 下载USB软件（PSIUdrivers.zip）。电源供应接口需要使用USB驱动程序软件，且仅需下载一次。该软件可在计算机程序与PSIU/活动监测器之间建立数据连接。在PC上使用COM端口，在Macintosh上使用简单的串行端口。
  6. 根据制造商提供的说明文件 Notes 308.pdf，下载适用于 Macintosh OSX（Intel）或 Windows PC（XP/Vista/7）的计算机程序。
  7. 启动计算机程序，通过点击“首选项”、“光源”或“显示器”来设置程序。程序将持续运行，直至用户选择“退出”以终止程序。如果计算机程序或计算机关闭，显示器将继续计数光束中断次数，但在程序重新启动前，这些计数不会被记录。在此情况下，首次读数将包含自上次PSIU向计算机发送数据以来的所有计数。
  8. 选择“首选项”选项卡，然后选择串行端口，Macintosh 选择 PSIU，PC 选择 COM。
  9. 选择读取间隔，范围可设置为秒、分钟或小时。
  10. 选择显示器：每台显示器都有制造商提供的唯一编号。选择与制造商所给显示器编号相对应的显示器范围。
  11. 灯光盒：确保所有显示器均已正确连接，软件中显示器编号旁的绿灯表示连接正常。红灯表示连接中断，黑框表示系统已关闭或设置不当。

6. 实验设置

  1. 从 4 °C 取出装有食物的玻璃小瓶，使其升至室温。
  2. 在 CO2 垫上按相同年龄分离雄性和雌性果蝇。在衰老研究中，最早可在果蝇出生后 3 天开始进行活动能力研究。
  3. 将 10 只雄性或 10 只雌性果蝇放入每个装有食物的玻璃小瓶中。每种实验组和对照组果蝇，以及每种性别，至少使用三个小瓶。
  4. 将小瓶侧放，直到果蝇从 CO2 麻醉中恢复，以确保果蝇不会陷入食物中。大约在上午 8:00 进行果蝇分离，并在室温下静置约 2 小时，使其从 CO2 麻醉中恢复。
  5. 将小瓶放入培养箱内的群体监测仪中。
  6. 果蝇放入培养箱后的前 24 小时内收集的数据应予以舍弃，以允许果蝇适应新环境。
  7. 在 3 或 4 天后将果蝇转移至新的小瓶，以避免食物干燥。如果果蝇容易死亡或年龄达到 40 天及以上，则应在 2 天后转移果蝇，并使用第 2 天收集的数据。此外，每组应使用超过三个小瓶，以确保有足够的重复。含有死亡果蝇的小瓶数据应予以剔除，不得纳入分析。

7. 运行活动监测仪并计算总自发活动量

  1. 选择偏好设置——数据采集的时间间隔。
    注意：计算机程序允许以从1秒到60分钟不等的时间间隔采集数据。研究发现，10分钟和30分钟的时间间隔能够在避免时间点过多的同时，提供关于活动能力的充分信息。在选定的时间间隔下，程序会将每个监测器的当前累计计数发送至计算机，并从零开始重新计数。计算机程序会将数据存储在由计算机数据系统创建的新文件夹中。每个监测器采集的数据被分别存储，并为每个样品瓶生成独立的文本文件。只要程序持续运行，数据就会持续采集。
  2. 实验结束后，使用适用于 Macintosh OSX（Intel）的 FileScan110X 或适用于 Windows PC（XP/Vista/7）的 SystemMB108 程序扫描数据。
    注意：扫描程序可消除重复读数，并确保记录完整。
  3. 保存在特定时间段内采集的数据。选择一个实验名称，并将文件从计算机数据文件夹复制出来用于分析。
    注意：此时可更改活动时间间隔并转换为其他间隔。原始数据将保留在计算机数据文件夹中，只要未被删除，即可随时调取。

8. 数据分析

  1. 将文本文件中收集的数据复制到 Excel 电子表格的列中，以进行数据分析。该软件收集的数据以列的形式呈现，每列包含由研究者选定时间段内单个监测器记录的总活动量数值。
    注意：每个监测器收集的数据分别存储在独立的文本文件中。每个监测器对应 32 列数据，其中前六列为零值，仅包含数字 0；接下来的三列分别包含底部环、中部和顶部环采集的数据。其余通道可删除，因其不包含有效数据。每个环在每个时间点输出一个单一数值。原始数据的截图见图 2。
  2. 计算每个监测器在指定时间段内的总活动量，该数值代表三个不同高度红外光束探测到的活动量之和。
    注意：时间段可为数小时、24 小时或数天。
  3. 确定代表三个生物学重复的三个监测器之间的平均运动活动量及其标准差。
    注意：可使用多种统计方法对数据进行显著性分析。例如，可采用双尾 Student t 检验、单因素方差分析（ANOVA）以及 Tukey HSD 事后检验，以评估不同环境或遗传干预对 24 小时自发运动活动的影响16。此外，还有多种其他可使用的分析程序，已在先前文献中发表17。

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结果

果蝇的自发运动活动取决于果蝇性别（图3A）、食物的热量含量（图3B）以及光/暗周期。当灯光关闭后，果蝇的活动显著减少。图3A展示了雄性和雌性果蝇24小时内的运动活动记录。横轴上的星号标记了灯光关闭并转入暗周期的时间点。图3B展示了在玉米培养基上饲养的3日龄雄性果蝇，在三台群体监测仪中测得的平均自发运动活动之间的标准差。24小时内记录的自发身体活动数据也可表示为每只果蝇在24小时期间的总活动量，如图3C所示。

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讨论

果蝇的自发运动活动受到多种因素的影响，例如年龄、遗传背景和性别2,13,18,19。此外，环境因素如食物的热量含量、环境温度、添加不同药物以及昼夜光照周期也会影响果蝇的活动。例如，同龄雄性果蝇的自发体力活动高于雌性果蝇（图1）。因此，应将相同年龄和性别的果蝇相互进行比较。在研究特定基因的遗传操作（如基因过表达或功能缺失）对果蝇活动的影响时，实验组和对照组果蝇必须具有相同的遗传背景，以消除不同遗传背景或第二位点修饰因子可能带来的影响。这可以通过将实验组雌性果蝇与w1118或yw雄性果蝇回交10代来实现。  经过10代回交后，可使用w1118或yw果蝇作为遗传对照。另一种控制遗传背景的方法是使用可诱导的GAL4 GeneSwitch（GAL4-GS）-UAS双元系统，该系统允许在喂食添加米非司酮（RU486）的食物的果蝇中，以时间和组织特异性的方式实现目标基因的过表达或下调（RNAi）20,21。RU486是GAL4形成二聚体并结合UAS序...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院资助（AG023088，授予 B.R.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蔗糖 FCC 食品级 100 磅Fisher Scientific MP BiomedicalsICN90471380
Brewer’s 酵母Fisher Scientific MP BiomedicalsICN90331280
Drosophila 细琼脂SciMartDR-820-25F
玉米粉Fisher Scientific MP BiomedicalsICN90141125
对羟基苯甲酸甲酯，tegoseptSigmaH5501-5KG
EtOHPharmco-AAPER111000200
活性干酵母Fisher ScientificICN10140001
果蝇 CO2 垫片LabScientificBGSU-7
体视显微镜OlympusSZ40
Drosophila 二氧化碳（CO2）气罐AirgasUN1013
用于推动果蝇的小型画笔
宽口壳状小瓶Fischer ScientificAS519
宽塑料小瓶用 BuzzplugsFischer ScientificAS275
玻璃小瓶（25 × 95 mm）Fischer Scientific Kimble 60931-8AS-574
玻璃小瓶用海绵塞SciMartDR-750
Drosophila 食物分配器Applied Scientific（Fischer Scientific）AS780Q
DPM Drosophila 种群监测仪Trikinetics 公司
带电源线的直流电源Trikinetics 公司
PSIU9 电源接口单元Trikinetics 公司
电话线缆和五通分路器Trikinetics 公司
通用串行总线（USB）硬件Trikinetics 公司
配备 UCB 端口的 Macintosh 或 Windows 个人电脑
适用于 Macintosh OSX（Intel）的 DAMSystem308X 数据采集软件www.trikinetics.com
适用于 Windows 个人电脑（XP/Vista/7）的 DAMSystem308 数据采集软件www.trikinetics.com
[header]
适用于 Macintosh 的 DAMFileScan108X 软件www.trikinetics.com
适用于 Windows 个人电脑（XP/Vista/7）的 DAMFileScan108X 软件www.trikinetics.com
USB 软件（PSIUdrivers.zip）www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308(http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf

参考文献

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