已建立一种用于人类内窥镜下颅底重建的小鼠模型，该模型利用鼻黏膜移植物在脑组织与鼻腔之间构建一个半透性界面。此方法可使研究人员研究大分子治疗药物向中枢神经系统的递送，这类药物在全身给药时通常因血脑屏障的存在而无法进入中枢神经系统。
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摘要
摘要
将治疗药物递送至大脑受到血脑屏障（BBB）的阻碍，该屏障限制了极性分子和高分子量化合物从血液进入脑组织。在人类中，已通过植入经颅导管实现了一定程度的直接递送成功；然而，该方法具有高度侵入性，并伴随多种并发症。一种侵入性较小的替代方案是通过外科手术植入的半透膜向大脑给药，例如在人类经鼻内镜肿瘤切除术后用于修复颅底缺损的鼻黏膜。药物通过此膜可有效绕过血脑屏障，直接扩散进入脑组织和脑脊液。受此策略启发，研究人员建立了一种小鼠手术模型，该模型将供体鼻中隔黏膜移植覆盖于颅外手术造成的BBB缺损处。研究表明，该模型可有效促进高分子量化合物进入大脑。由于大量候选药物无法穿越血脑屏障，该模型在神经系统和精神类疾病新型疗法的临床前测试中具有重要价值。
引言
由于血脑屏障（BBB）的存在，神经性和精神性疾病的治疗受到严重阻碍，该屏障阻止了超过95%的潜在药物进入中枢神经系统1-3。例如，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在直接注射到脑内时已被证明对治疗帕金森病有效，但当通过全身给药时则无效，因为它无法穿透血脑屏障4-6。
为解决这一问题，已开发出多种方法。通过使用含有靶向脑毛细血管内皮上转运蛋白的抗体的药物偶联物，已证明可改善神经治疗药物的全身递送效果；然而，该方法尚未被证实适用于广泛范围的药物7,8。此外，渗透法开放血脑屏障已在临床中应用，但该方法存在全身性药物暴露的问题，无法实现对目标脑区的直接递送9。研究人员已投入大量努力优化经鼻递送途径，以期实现对脑组织的直接靶向10-12。尽管已取得一定成功，但目前仅有针对具有内源性受体的药物（如胰岛素）获得了明确结果13,14。此外，经鼻递送的作用机制仍存争议，有证据表明药物可能通过嗅觉神经元摄取或经由血液循环间接进入脑内11。已实现利用可植入导管进行直接的经颅递送，但该操作具有高度侵入性，并伴随多种并发症15,16。迄今为止，尚无一种通用且微创的方法可用于将高分子量化合物递送至脑内。
本文介绍了一种在小鼠中创建与大脑相连的半透性界面的外科手术方法。该方法通过将黏膜组织外植体17移植至小鼠颅骨开窗术造成的颅骨缺损处而实现。研究表明，利用该方法可将分子量高达500 kDa的可溶性化合物以时间和分子量依赖的方式递送至中枢神经系统（包括脑实质及脑脊液）18。这种绕过血脑屏障（BBB）的技术，模拟了人类颅底缺损修复术，后者在经鼻内镜手术后采用带血管的黏膜移植物修复颅骨缺损19,20。
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方案
在手术前，确保所有操作步骤均已获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）及其他相关伦理或法律监管机构的批准，并采用人道的动物处理方法。这包括使用无菌手术环境、采用IACUC批准的方法对小鼠进行麻醉、在手术期间使用兽用眼膏润滑小鼠眼睛，以及提供术后护理。如果对任何操作步骤是否获得批准存有疑问，则不得进行手术。本文所涉及的所有实验程序均已获得波士顿大学机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 动物与手术用品的准备
- 将手术中使用的所有外科器械进行高压灭菌。
- 确保将要实施的所有技术均已获得动物管理机构的批准。
2. 黏膜移植物的获取
- 选择与实验小鼠年龄相近且遗传背景相同的小鼠，并采用经IACUC批准的方法实施安乐死（此处为异氟烷窒息后行颈椎脱位）。
- 使用手术剪去除小鼠头部鼻部周围皮肤，暴露颅骨。
- 使用气动钻头标记三条线，其中两条位于鼻部区域两侧，第三条与眼睛连线平行，并垂直连接前两条线。
- 向腹侧钻入，以分离鼻中隔与周围组织。较宽的切口可避免损伤黏膜，但会增加分离黏膜的难度。建议采用靠近中线的较窄切口。
- 使用剪刀将中隔从附着的组织上完全剪下，并将其保存于无菌生理盐水中。此时可对移植物进行清理，去除任何残留的连接组织。理想状态是鼻中隔软骨两侧均暴露完整无损的黏膜。若黏膜表面积足够覆盖颅骨开窗部位，单个移植物可为两只小鼠提供黏膜。建议尽快使用移植物，并在分离完成后立即进入步骤3。
3. 黏膜移植物的手术植入
- 采用标准的无菌小鼠外科手术操作，将小鼠在立体定位框架中麻醉并固定。使用啮齿类动物麻醉机，以纯氧为载体，异氟烷浓度约为 2%。
- 将小鼠固定在立体定位仪上，使用耳杆和鼻夹固定头部。 在眼睛表面涂抹眼用软膏，并用聚维酮碘和 75% 乙醇对头皮进行三轮消毒。 使用剪刀或毛发修剪器去除头部毛发。用剃刀暴露颅骨并调平头部。在将要给药的脑区上方进行开颅手术。例如，当靶向纹状体时，使用气动钻在颅骨上钻出一个直径为 1.25 mm 的圆形孔（中心位置：前-后向 1.00 mm；内-外向 0.88 mm）。用无菌生理盐水润湿钻孔区域，并用剃刀片去除颅骨。
- 使用针尖小心地去除硬脑膜。此外，也可通过在湿润的硬脑膜表面施加少量组织粘合剂实现。待该层凝固后，可用剃刀片尖端进行侧向移动以剥离膜组织。
- 将黏膜移植物置于脑表面之上，操作时需特别注意使上皮面朝向远离伤口的方向。最佳操作方式是用镊子将整个鼻中隔转移至开颅部位附近的颅骨表面。使用手术剪尖端将膜从软骨上拉出，并移至颅骨和脑表面。切勿让膜干燥，或用任何吸水性材料接触。移植物应充分覆盖开颅部位的所有骨边缘。
- 用一块无菌的腈类材料覆盖移植物。这可防止皮肤在愈合过程中与移植物粘连。腈类材料应足够大，以完全覆盖整个黏膜移植物。必要时可修剪多余的膜组织。一旦腈类材料与移植物接触后，应避免任何移动。
- 使用连续的 5-0 无菌缝线关闭皮肤，并让小鼠恢复 3–7 天后再进行下一步操作。在缝合皮肤时，注意不要扰动腈类屏障或黏膜移植物。
4. 给药溶液的施用
- 将麻醉后的小鼠固定在立体定位仪框架中，用剪刀剪开缝合线并去除颅骨周围的多余皮肤。
- 移除腈类隔离膜，清洁颅骨表面。使用无菌生理盐水和棉签擦拭区域，直至移植物清晰可见。如果移植物生长面积超过预期范围，可能需要用剃刀将其修剪。
- 如果实验持续时间超过数天，建议至少植入两枚颅骨螺钉，以增强头部植入物的稳定性。
- 将井状结构置于移植物上方，使其边缘与颅骨接触。在井状结构与颅骨交界处涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂。向井内注入无菌生理盐水，检查是否存在泄漏。井状结构由切割后的注射器针头制成。
- 在颅骨上涂抹骨水泥，以固定井状结构。
- 用移液器将井内的生理盐水吸出。多次冲洗井内空间，确认粘合剂未渗入。加入所需溶液；本实验中使用 50 μl 荧光标记葡聚糖。预期具有相似极性的水溶性化合物行为将与葡聚糖一致。该方法尚未用于疏水性化合物或悬浮液的递送。
- 使用一片圆形腈类材料封住井口，并用氰基丙烯酸酯粘合剂将其固定在顶部。注意确保粘合剂不与井内内容物接触。
5. 穿黏膜递送的分析
- 经过所需时间后，麻醉小鼠，并将孔中液体更换为伊文思蓝染料溶液。该染料用于验证移植物是否完整。
- 30 分钟后，深度麻醉小鼠，移除染料溶液，并通过断头法处死小鼠。
- 手动取出植入物，并使用手术剪刀取出脑组织。注意保持移植物位置不变。
- 取出后，将脑组织置于干冰冷却的异丁烷溶液中进行速冻。
- 将脑组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并切成 50 μm 厚的切片。
- 将所需切片直接置于显微镜载玻片上。
- 待 OCT 包埋剂干燥后，立即使用荧光显微镜对切片进行成像。
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结果
获取足够大的鼻中隔外植体对于后续步骤至关重要。可通过在供体小鼠颅骨上如图1a所示的位置进行钻孔来实现。沿此路径切割可获得如图1b所示足够大小的外植体。若钻孔深度不足，移植物将被截断，难以获得足以覆盖脑表面的大片黏膜。不建议超出推荐路径向更外侧钻孔，否则鼻中隔上会残留更多组织，使下一步操作更加困难。在转移黏膜前，需将鼻中隔表面所有多余的结缔组织清除干净。完成清理后，黏膜应清晰可见于软骨表面。图1c展示了组织清理后的外观。
在转移黏膜之前，需要进行开颅术和硬脑膜切开术以暴露脑表面。只有在硬脑膜切开后出血停止的情况下，才能进行黏膜的转移。图2a展示了在进入下一步之前手术部位应有的状态。将黏膜从软骨转移到脑表面是整个手术过程中技术上最具挑战性的步骤，必须谨慎操作。如果获取的鼻中隔足够大，则黏膜移植物的表面积应足以覆盖脑表面。一旦完成转移，手术区域应类似于图2b所示。重要的是要确保与软骨接触的一面也是与脑表面接触的一面。如果...
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讨论
本文所述操作步骤中最困难的部分是将大小合适的黏膜成功转移至脑表面。如果获取的鼻中隔足够大且清理彻底，则此步骤将显著简化。若鼻中隔腹侧部分被截断，则应重新获取新的移植物。钻孔角度应垂直于小鼠头部，以确保钻头不会损伤黏膜。若钻孔路径宽于推荐尺寸，将更难清除与中隔相连的多余组织。较大的结缔组织应使用锐利的剪刀剪除，而非试图将其撕下。较小的组织碎片可通过剪刀尖刮除，但前提是这些组织未与黏膜相连。清理过程结束时，应暴露出仍附着黏膜的软骨表面。有时，鼻中隔软骨可能会从其背缘所连接的骨组织上脱落。若发生此情况，仍可在下一步中使用该软骨，但会面临两个挑战。首先，骨组织在清理和转移外植体时可作为方便的持握手柄；一旦去除，更纤薄的软骨片则更难操作。其次，软骨与骨的连接处是黏膜最厚且最容易从软骨上剥离的区域。若骨组织与软骨分离，则该部分黏膜将丢失。
在清理鼻中隔移植物并完成颅骨切开术和硬脑膜切开术后，可将黏膜膜放置于暴露的脑表面。最佳操作方式是将移植物置于靠近颅骨切开部位的位置。随后可将膜从软骨上拉出，越过颅骨并覆盖至脑表面。此过程可能发生多种问题：膜可能变干、撕裂、自身折叠或皱缩成团；此外，鼻中隔另一...
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披露
Benjamin S. Bleier 医学博士是涵盖向中枢神经系统递送药物方法的临时专利的主要发明人。
致谢
本研究由帕金森病研究迈克尔·J·福克斯基金会2011年快速响应创新奖项目资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠 | Taconic | C57BL/6 | |
| 异氟烷 | Piramal Healthcare | ||
| 学生用精细剪刀 | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| 气动钻 | MTI Dental | 333-CB | |
| 钻头 | |||
| 镊子 | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 0.9% 氯化钠注射液 USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| 聚苯乙烯培养皿 | Fisher | 08-757-12 | 用于临时存放移植物 |
| 珠式灭菌器 | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 氧气/异氟烷系统 | SurgiVet | V720100 | |
| 温度控制系统 | Physitemp | TCAT-2LV | |
| 小型动物立体定位仪 | KOPF | Model 940 | |
| 眼膏 | |||
| 电动剃须刀 | |||
| 棉签 | Fisher | 23-400-106 | |
| 7.5% 聚维酮碘 | 贝塔碘外科洗手液 | ||
| 70% 乙醇 | |||
| 不锈钢手术刀片 | Feather | 2976#10 | |
| 手术刀柄 - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% 过氧化氢 | 用于清洁颅骨 | ||
| Vetbond 组织粘合剂 | 3M | 1469SB | |
| 针头 | Becton, Dickinson and Company | 305176 | 剪断针尖后用作小孔工具 |
| 注射器 | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| 腈类手套 | Denville Scientific Inc | G4162 | 用于封闭孔洞及保护移植物 |
| 5-0 尼龙缝合线 | |||
| 学生用 Halsey 持针器 | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 | 市售的强力胶 | ||
| 牙科水泥套件，1磅，粉红色不透明 | Stoelting | 51458 | |
| 异丁烷（2-甲基丁烷） | Aldrich | M32631 | 用于干冰浴 |
| 干冰 |
参考文献
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