小鼠脑部直接给药的异位黏膜移植术

摘要

已建立一种用于人类内窥镜下颅底重建的小鼠模型，该模型利用鼻黏膜移植物在脑组织与鼻腔之间构建一个半透性界面。此方法可使研究人员研究大分子治疗药物向中枢神经系统的递送，这类药物在全身给药时通常因血脑屏障的存在而无法进入中枢神经系统。

摘要

将治疗药物递送至大脑受到血脑屏障（BBB）的阻碍，该屏障限制了极性分子和高分子量化合物从血液进入脑组织。在人类中，已通过植入经颅导管实现了一定程度的直接递送成功；然而，该方法具有高度侵入性，并伴随多种并发症。一种侵入性较小的替代方案是通过外科手术植入的半透膜向大脑给药，例如在人类经鼻内镜肿瘤切除术后用于修复颅底缺损的鼻黏膜。药物通过此膜可有效绕过血脑屏障，直接扩散进入脑组织和脑脊液。受此策略启发，研究人员建立了一种小鼠手术模型，该模型将供体鼻中隔黏膜移植覆盖于颅外手术造成的BBB缺损处。研究表明，该模型可有效促进高分子量化合物进入大脑。由于大量候选药物无法穿越血脑屏障，该模型在神经系统和精神类疾病新型疗法的临床前测试中具有重要价值。

引言

由于血脑屏障（BBB）的存在，神经性和精神性疾病的治疗受到严重阻碍，该屏障阻止了超过95%的潜在药物进入中枢神经系统^1-3。例如，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在直接注射到脑内时已被证明对治疗帕金森病有效，但当通过全身给药时则无效，因为它无法穿透血脑屏障^4-6。

为解决这一问题，已开发出多种方法。通过使用含有靶向脑毛细血管内皮上转运蛋白的抗体的药物偶联物，已证明可改善神经治疗药物的全身递送效果；然而，该方法尚未被证实适用于广泛范围的药物^7,8。此外，渗透法开放血脑屏障已在临床中应用，但该方法存在全身性药物暴露的问题，无法实现对目标脑区的直接递送⁹。研究人员已投入大量努力优化经鼻递送途径，以期实现对脑组织的直接靶向^10-12。尽管已取得一定成功，但目前仅有针对具有内源性受体的药物（如胰岛素）获得了明确结果^13,14。此外，经鼻递送的作用机制仍存争议，有证据表明药物可能通过嗅觉神经元摄取或经由血液循环间接进入脑内¹¹。已实现利用可植入导管进行直接的经颅递送，但该操作具有高度侵入性，并伴随多种并发症^15,16。迄今为止，尚无一种通用且微创的方法可用于将高分子量化合物递送至脑内。

本文介绍了一种在小鼠中创建与大脑相连的半透性界面的外科手术方法。该方法....

方案

在手术前，确保所有操作步骤均已获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）及其他相关伦理或法律监管机构的批准，并采用人道的动物处理方法。这包括使用无菌手术环境、采用IACUC批准的方法对小鼠进行麻醉、在手术期间使用兽用眼膏润滑小鼠眼睛，以及提供术后护理。如果对任何操作步骤是否获得批准存有疑问，则不得进行手术。本文所涉及的所有实验程序均已获得波士顿大学机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 动物与手术用品的准备

1. 将手术中使用的所有外科器械进行高压灭菌。
2. 确保将要实施的所有技术均已获得动物管理机构的批准。

2. 黏膜移植物的获取

1. 选择与实验小鼠年龄相近且遗传背景相同的小鼠，并采用经IACUC批准的方法实施安乐死（此处为异氟烷窒息后行颈椎脱位）。
2. 使用手术剪去除小鼠头部鼻部周围皮肤，暴露颅骨。
3. 使用气动钻头标记三条线，其中两条位于鼻部区域两侧，第三条与眼睛连线平行，并垂直连接前两条线。
4. 向腹侧钻入，以分离鼻中隔与周围组织。较宽的切口可避免损伤黏膜，但会增加分离黏膜的难度。建议采用靠近中线的较窄切口。
5. 使用剪刀将中隔从附着的组织上完全剪下，并将其保存于无菌生理盐水中。此时可对移植物进行清理，去除任何残留的连接组织。理想状态是鼻中隔软骨两侧均暴露完整无损的黏膜。若黏膜表面积....

结果

获取足够大的鼻中隔外植体对于后续步骤至关重要。可通过在供体小鼠颅骨上如图1a所示的位置进行钻孔来实现。沿此路径切割可获得如图1b所示足够大小的外植体。若钻孔深度不足，移植物将被截断，难以获得足以覆盖脑表面的大片黏膜。不建议超出推荐路径向更外侧钻孔，否则鼻中隔上会残留更多组织，使下一步操作更加困难。在转移黏膜前，需将鼻中隔表面所有多余的结缔组织清除干净。完成清理后，黏膜应清晰可见于软骨表面。图1c展示了组织清理后的外观。

在转移黏膜之前，需要进行开颅术和硬脑膜切开术以暴露脑表面。只有在硬脑膜切开后出血停止的情况下，才能进行黏膜的转移。图2a展示了在进入下一步之前手术部位应有的状态。将黏膜从软骨转移到脑表面是整个手术过程中技术上最具挑战性的步骤，必须谨慎操作。如果获取的鼻中隔足够大，则黏膜移植物的表面积应足以覆盖脑表面。一旦完成转移，手术区域应类似于图2b所示。重要的是要确保与软骨接触的一面也是与脑表面接触的一面。如果.......

讨论

本文所述操作步骤中最困难的部分是将大小合适的黏膜成功转移至脑表面。如果获取的鼻中隔足够大且清理彻底，则此步骤将显著简化。若鼻中隔腹侧部分被截断，则应重新获取新的移植物。钻孔角度应垂直于小鼠头部，以确保钻头不会损伤黏膜。若钻孔路径宽于推荐尺寸，将更难清除与中隔相连的多余组织。较大的结缔组织应使用锐利的剪刀剪除，而非试图将其撕下。较小的组织碎片可通过剪刀尖刮除，但前提是这些组织未与黏膜相连。清理过程结束时，应暴露出仍附着黏膜的软骨表面。有时，鼻中隔软骨可能会从其背缘所连接的骨组织上脱落。若发生此情况，仍可在下一步中使用该软骨，但会面临两个挑战。首先，骨组织在清理和转移外植体时可作为方便的持握手柄；一旦去除，更纤薄的软骨片则更难操作。其次，软骨与骨的连接处是黏膜最厚且最容易从软骨上剥离的区域。若骨组织与软骨分离，则该部分黏膜将丢失。

在清理鼻中隔移植物并完成颅骨切开术和硬脑膜切开术后，可将黏膜膜放置于暴露的脑表面。最佳操作方式是将移植物置于靠近颅骨切开部位的位置。随后可将膜从软骨上拉出，越过颅骨并覆盖至脑表面。此过程可能发生多种问题：膜可能变干、撕裂、自身折叠或皱缩成团；此外，鼻中隔另一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠	Taconic	C57BL/6
异氟烷	Piramal Healthcare
学生用精细剪刀	Fine Science Tools	91461-11
气动钻	MTI Dental	333-CB
钻头
镊子	Fine Science Tools	91106-12
0.9% 氯化钠注射液 USP	Abbott Laboratories	4925
聚苯乙烯培养皿	Fisher	08-757-12	用于临时存放移植物
珠式灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
氧气/异氟烷系统	SurgiVet	V720100
温度控制系统	Physitemp	TCAT-2LV
小型动物立体定位仪	KOPF	Model 940
眼膏
电动剃须刀
棉签	Fisher	23-400-106
7.5% 聚维酮碘			贝塔碘外科洗手液
70% 乙醇
不锈钢手术刀片	Feather	2976#10
手术刀柄 - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% 过氧化氢			用于清洁颅骨
Vetbond 组织粘合剂	3M	1469SB
针头	Becton, Dickinson and Company	305176	剪断针尖后用作小孔工具
注射器	Becton, Dickinson and Company	309597
腈类手套	Denville Scientific Inc	G4162	用于封闭孔洞及保护移植物
5-0 尼龙缝合线
学生用 Halsey 持针器	Fine Science Tools	91201-13
氰基丙烯酸酯粘合剂			市售的强力胶
牙科水泥套件，1磅，粉红色不透明	Stoelting	51458
异丁烷（2-甲基丁烷）	Aldrich	M32631	用于干冰浴
干冰