方法文章

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

DOI：

10.3791/51454

⸱

2014年6月3日

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1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa

本文内容

摘要

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本文介绍了一种新型拉伸平台，可用于研究单个细胞对复杂各向异性双轴机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

能够对细胞和组织施加机械力，或可量化生物组织机械特性的工具，已极大地推动了基础力学生物学的发展。这些技术已被广泛用于证明多种疾病的起始与进展过程在很大程度上受到机械信号的影响。本文介绍一种多功能双轴拉伸（BAXS）平台，该平台既可用于对单个细胞进行机械刺激，也可用于量化组织的机械刚度。BAXS平台由四个可独立控制的音圈电机组成。单个细胞可培养于柔性基底上，该基底可连接至电机，从而允许将细胞暴露于复杂、动态且空间变化的应变场中。相反，通过集成力传感器，也可在组织经历形变循环时量化其机械特性。在这两种情况下，均需设计并安装合适的夹具至BAXS平台的电机上，以牢固固定柔性基底或目标组织。BAXS平台可安装于倒置显微镜上，以便在拉伸实验过程中同步进行透射光和/或荧光成像，以观察样品的结构或生化响应。本文提供了BAXS平台的设计与使用方法的实验细节，并展示了针对单细胞和完整组织的研究结果。BAXS平台被用于测量单个小鼠成肌细胞在基底应变作用下细胞核的形变，以及测量分离的小鼠主动脉的刚度。BAXS平台是一种多功能工具，可与多种光学显微技术联用，从而在亚细胞、细胞和整体组织水平上提供新颖的力学生物学见解。

引言

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机械微环境在细胞的多种功能（如增殖、迁移和分化）中发挥重要作用，这些功能对组织的发育与稳态以及疾病的发生发展具有深远影响1-6多年来，已有多种实验工具被用于对细胞或组织施加机械刺激，并测量生物组织的力学特性，旨在加深我们对基本力学生物学的理解，并研究疾病的发生与发展过程6-17然而，人们通常需要依赖多种不同的实验设备才能实现特定研究的目标。本文介绍了一种多功能单体式双向拉伸（BAXS）平台，可用于研究机械特性与机械力在从亚细胞到整个组织尺度的生物学过程中的作用。该BAXS平台不仅能够量化分离组织的机械性能，还可对活细胞施加简单、复杂或动态的应变场，从而有助于理解细胞对拉伸刺激的响应 体内BAXS 平台还具备在对细胞和组织进行力学测试及施加扰动的同时，开展活细胞显微成像的能力。

BAXS 平台是一种定制装置，可用于在细胞水平上研究基底变形的影响，并对生物组织进行拉伸测试（图 1A）。该平台配备了一个铝制加热器，可容纳标准的 10 厘米培养皿，并通过温度控制器和聚酰亚胺加热片将任何生理溶液维持在 37 °C（图 1B）。此 BAXS 平台可集成到倒置相差显微镜和/或荧光显微镜上，实现同步成像（图 1C）。简而言之，BAXS 平台由四个线性音圈电机组成，其运动部件安装在沿两个垂直轴方向排列的微型直线运动球轴承滑轨上（

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方案

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1. 单细胞的机械变形

  1. 制备嵌入荧光微珠的PDMS基底
    在制备基底之前，由于PDMS具有疏水性，需将水溶液中的荧光微球重悬于异丙醇中，以增强微珠在PDMS中的混合均匀性。
    1. 用移液器将500 μl荧光微球加入1.5 ml微量离心管中，在16,200 × g条件下离心10分钟。
    2. 弃去上清液，加入500 μl异丙醇，涡旋振荡5分钟。将离心管置于避光处静置过夜，使较大的颗粒聚集体充分沉降。
    3. 次日早晨，小心将上清液转移至洁净的微量离心管中。该微珠溶液可用于制备超过5个基底。注意：该微珠溶液在接下来的3天内会持续沉降，请避免重新悬浮沉淀物。
    4. 使用分析天平称取PDMS试剂盒中提供的固化剂0.5 g，置于1.5 ml微量离心管中。分六次加入共90 μl微珠溶液（每次15 μl），每次加入后涡旋1分钟。完成后静置备用。
    5. 称取10 g PDMS，与含荧光微珠的0.5 g固化剂充分混合，搅拌至少12分钟。
    6. 按照制造商说明，采用标准光刻技术制备SU-8 2050十字形模具。所用模具高度为320 μm，面积为13.4 cm2（图3）。该模具可容纳428 μl或440 mg PDMS。
    7. 用移液管将400 mg含微珠的PDMS注入十字形模具中，在80 °C下固化2小时。固化后，将基底从模具上剥离（图5A<....

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结果

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细胞拉伸

利用BAXS平台研究了暴露于25%基底形变下的单个小鼠成肌细胞（C2C12）细胞核的力学响应。成肌细胞存在于肌肉组织中，在体内持续受到机械拉伸和压缩作用。in vivo研究表明，细胞核的形态和力学特性在基因表达和转录活性的调控中起着重要作用20,21，同时也与多种发育缺陷和疾病相关，如Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）、Emery-Dreifuss肌营养不良症（EDMD）、扩张型心肌病、早衰以及癌症22-25。因此，理解来自外部机械微环境的力如何影响细胞核的结构与功能具有重要意义。本研究使用BAXS平台，通过沿基底主轴或次轴方向拉伸基底，来探究力从微环境向细胞核的传递过程。图7A-F展示了该平台在两个正交方向上诱导基底形变的能力。此外，BAXS平台除了可产生标准的单轴或等双轴应变场外，还可诱导复杂的应变场。图7G-H展示了通过独立控制两个正交方向上的应变场所带来的灵活性，使我们能够产生标.......

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讨论

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本文介绍的BAXS平台可支持多种力学生物学研究实验，涵盖从单细胞到整个组织的研究。此外，该平台具有高度灵活性和可配置性，能够开展多种力学刺激实验以及多轴拉伸测试。该平台还能在生理条件下维持细胞和组织的活性，并支持在拉伸实验过程中同步进行显微成像。前文所述的两个实验展示了在使用适当夹具组件时，BAXS平台所具备的多功能性。模块化且可定制的样品固定系统、良好的光学通路，以及附加传感器（例如载荷传感器）的可能性，为开展更多类型的实验提供了广泛的空间。

上述方案包含多个关键步骤，必须妥善执行才能获得最佳结果。在细胞拉伸方案中，将PDMS基底安装到夹具上需要精细而精确的操作。PDMS基底必须相对于四个夹具良好居中，以避免在拉伸过程中基底发生不必要的横向移动。此类横向移动会使拉伸实验期间的细胞追踪变得困难。此外，当基底在培养箱中朝上放置时，在接种细胞过程中需密切监测培养液滴的蒸发情况。根据培养箱门在操作过程中开启的频率，蒸发速率可能会发生变化。在血管拉伸方案中，最关键的步骤是对待测样品的尺寸进行测量。这些尺寸必须尽可能准确，因为它们参与.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DT 获得了魁北克自然科学与技术研究基金会（FQRNT）的博士后奖学金以及 MITACS Elevate 战略研究员项目的支持。CMC 获得了魁北克健康研究基金会（FRSQ）以及渥太华心脏研究所 Ernest 和 Margaret Ford 心脏病学专项研究奖学金的支持。EOB 获得了加拿大卫生研究院（CIHR）项目 MOP80204 和安大略心脏与中风基金会项目 T6335 的运营资助。CIHR 与美敦力公司（Medtronic）共同为 EOB 提供经同行评审的研究讲席（URC #57093）。AEP 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金、NSERC 发现加速补充基金的支持，并承蒙加拿大研究讲席（CRC）计划以及安大略省政府早期研究者奖的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PDMSEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KG本方案中基础剂与交联剂的混合比例为20:1。在层流罩中混合，以防止灰尘污染您的 
FluoSpheres 荧光微球InvitrogenF8810避光保存。
线性音圈电机MoticontLVCM-051-051-01电机由两部分组成（磁体和线圈）。必须安装在滚珠轴承系统上才能正常工作。
滚珠轴承滑轨Edmund OpticsNT37-360微型和小型直线运动滚珠轴承滑轨
线性定位平台Edmund Optics38-960中心驱动1.25" 方形线性位移平台
光学编码器GSI microE systemsMercury II 1600S - 0.5µm 分辨率反射式增量编码器。
运动控制器GalilDMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440四轴控制器配四轴放大器
载荷传感器Honeywell31 low微型载荷传感器，量程为0–150 g
昆虫细针（0.20 mm）Pin Service Austerlitz Insect pins不锈钢针，弯曲成张开的三角形
SU-8 2050Micro ChemSU-8 2050永久性环氧负性光刻胶。避免受热和光照
空气等离子体处理系统GlowresearchAutoglow 氧等离子体系统
大鼠尾胶原蛋白InvitrogenA10483-01Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾来源，5 mg/mL
Hoechst 33342InvitrogenR37605特异性结合DNA的荧光染料。需冷藏保存。
聚酰亚胺薄膜（Kapton）绝缘柔性加热器omega.caKHLV-0504/(10)-P28 V 柔性加热器；可由24 V供电
1/16 DIN 自整定温度与过程控制器omega.caCN63200-R1-LV温度控制器；供电电压24 V。
DMEM 培养基HycloneSH3024301Dulbecco’s 改良Eagle培养基。4 °C 保存
青霉素-链霉素HycloneSV30010原液冷冻保存。工作液于4 °C 保存。
胎牛血清（FBS）HycloneSH3039603C冷冻保存。
0.05% 胰蛋白酶HycloneSH30236.02冷冻保存。用于消化细胞贴壁蛋白以进行传代培养
HepesWisent Inc330-050-ELHEPES缓冲盐溶液 
NaClFisher ScientificBP358-1HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液
KClFisher ScientificBP366-500HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液
MgSO4Fisher ScientificM65-500HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液
CaCl2Fisher ScientificC614-500HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液
葡萄糖Fisher ScientificBP220-1HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液
NaHCO3Fisher ScientificBP328-1Krebs 生理溶液
KH2PO4Fisher ScientificBP362-500Krebs 生理溶液
碳酰气（95% O2/5% CO2）LindleDIN:02154749用于Krebs 生理溶液的氧合
诺考达唑SigmaM1404微管去聚合剂
细胞松弛素DSigmaC8273肌动蛋白丝去聚合剂
抗-α-SMA-FITCSigmaF3777用于染色并定量平滑肌细胞含量
苦味酸天狼星红染色液Fluka43665用于染色并定量胶原蛋白含量

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N.....

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PDMS

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