一种低成本分析类癫痫活动及运动行为的方法 黑腹果蝇

摘要

利用网络摄像头以及免费或低成本的软件组合，可以分析黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的运动模式，以检测其在多种运动活动中速度、距离和时间上的差异。

摘要

视频追踪系统已被广泛用于分析 黑腹果蝇 黑腹果蝇 运动并检测运动行为中的多种异常。尽管这些系统能够提供丰富的行为学信息，但其成本和复杂性可能使许多实验室难以承受。我们开发了一种低成本的检测方法，用于测量运动行为和癫痫样运动 D. 黑腹果蝇该系统利用网络摄像头捕捉图像，并结合廉价且免费的软件对图像进行处理，以追踪在特定时间段内的移动距离、平均移动速度和移动持续时间。为展示该系统的实用性，我们检测了一组 D. 黑腹果蝇 突变体，即对撞击敏感的麻痹突变体（Bang-sensitive, BS），其癫痫样活动（seizure-like activity, SLA）的易感性比野生型果蝇高3至10倍。利用这一新型系统，我们能够检测到BS突变体 毫无意义的打击 (bss在新环境中，该品系果蝇的探索性运动水平低于野生型果蝇。此外，该系统还用于发现临床上常用于治疗2型糖尿病的药物二甲双胍可降低BS突变体中SLA的强度。

引言

由于其生命周期短且拥有强大的遗传学研究工具，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是研究多种疾病病因以及各种生物学过程生理机制的理想模型系统。在许多情况下，检测行为学、遗传学或药理学干预对这类模式生物运动能力的影响具有重要意义^1,2。

目前有多种常用方法用于测量果蝇在二维空间中的运动^3-7。这些系统可同时追踪多只果蝇，能够测量运动速度、记录运动轨迹长度以及记录果蝇处于运动状态的时间百分比。这些方法已被应用于多种情境下的运动研究，包括药物对运动行为的影响以及果蝇运动的性别二态性特征^6-9。这些系统的最主要缺点是追踪系统本身或配套软件与相机的成本较高，在某些情况下，费用可达数千美元。对于仅需有限使用该系统的实验室而言，成本问题尤为突出，例如在对新分离的突变体进行运动模式定量分析时。

一种更简单但稳健性较差的方法是使用记录果蝇穿过封闭管中央红外光束路径次数的系统来监测其运动^10,11。尽管此类系统可提供有关运动及睡眠-觉醒周期的有价值信息，但由于无法捕捉果蝇的实际运动轨迹，可能导致对运动程度的高估或低估。例如，果蝇若在管子两端进行大量活动，该系统会将其记录为低运动个体，尽管已有研究采用其他高分辨率方法试图克服这些局限性¹²。

更为简单且廉价的方法是使用测量果蝇向地性（即果蝇向上运动）的攀爬装置，该装置通过单根或一系列管子实现^2,13。尽管此类系统成本低廉且能轻松识别向地性缺陷，但它们无法捕捉研究人员可能感兴趣的其他多种运动特征。

对于许多实验室而言，一种低成本、性能稳健且易于安装和操作的分析系统，将是表征黑腹果蝇（D. melanogaster）品系间行为差异的理想工具。本文介绍一种成本低于两百美元即可搭建的检测方法，能够提供果蝇运动轨迹、速度和持续时间等信息。为验证该检测方法的有效性，我们展示了相关数据，表明该方法可用于识别：1）一种对震荡敏感（Bang-sensitive, BS）且易发生惊厥的突变体所存在的运动缺陷；2）临床上常用于治疗2型糖尿病的药物二甲双胍，能够降低两种BS突变体中类惊厥样活动（SLA）的强度。

方案

1. 运动测定用单只果蝇的制备

1. 轻轻敲击，将果蝇转移至单独的空瓶中，并用棉塞封口。观察前让果蝇静置20–30分钟，期间避免干扰。在行为观察前数小时内切勿对果蝇进行麻醉，因为先前的研究发现，与未麻醉的果蝇相比，麻醉暴露可能改变其行为表现¹⁴。
2. 轻轻敲击果蝇使其离开小瓶，将单只果蝇置于直径5 cm的培养皿盖（高5 mm）下方，皿盖上留有微小缝隙以允许空气流通。从下方照明，并使用安装在培养皿上方的网络摄像头观察果蝇行为。

2. 癫痫检测用单只果蝇的制备

1. 将饲养两天且对惊厥敏感的果蝇喂食标准的酵母/玉米粉/琼脂培养基，或直接混有药物的标准培养基。本实验所展示的数据中，果蝇分别被喂食1 g标准培养基，或1 g标准培养基混合25 mg二甲双胍。
2. 果蝇在培养基或含药物的培养基上进食两天后，通过轻弹将其转移至单独的空试管中，并用棉塞封口。在开始观察前，让果蝇静置20分钟，期间避免干扰。需要注意的是，在行为观察前数小时内不得对果蝇进行麻醉处理，因为先前的研究发现，与未麻醉果蝇相比，麻醉暴露可能改变其行为表现¹⁴。
3. 将装有单只果蝇的试管置于实验室涡旋振荡器上，以最高转速涡旋10秒。随后将已固定的果蝇放置于一张纯白色纸张上，纸张正上方固定有网络摄像头。

3. 视频录制

1. 使用 HandyAvi 软件程序 http://www.azcendant.com/download.htm 记录运动行为或 SLA。该程序利用网络摄像头，根据用户设置捕获图像。
2. 在“捕获”选项卡下选择“延时图像”选项，窗口打开后，选择网络摄像头作为捕获设备。对于大多数实验，640 × 480 的视频帧尺寸已足够。
3. 选择 Intel IYUV 编码器进行压缩，癫痫发作检测选择 0.1 秒/帧，运动检测选择 0.1–0.5 秒/帧。在“高级”选项卡中，勾选“为每次捕获创建一个 .bmp 图像文件”，并选择一个文件夹用于存储程序获取的图像（图像序列）。
4. 将一只死亡的果蝇放置在纸张上。点击“视频设置”框，在“设备设置”选项卡下调整参数，使背景呈现明亮的白色，并与较暗的果蝇形成清晰对比。
5. 点击“开始”按钮以启动录制。录制时间结束后，点击“停止”按钮。此时图像序列应已保存至所选文件夹中。注意：在开始录制前，请确保所选用于存储图像序列的文件夹为空。

4. 使用 ImageJ 进行数据分析

1. 打开美国国立卫生研究院（NIH）提供的免费图像处理软件 ImageJ，该软件可在以下网址下载：http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html。注意：除下载程序外，还必须从 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html 下载并安装 Multitracker 插件。
2. 通过点击 File 选项卡，然后选择 Import → Image sequence，将图像序列导入 ImageJ。
   1. 选择包含图像序列的文件夹，选中其中一张图像后点击打开。此时将弹出“Sequence Options”对话框。勾选“Sort names numerically”，然后点击 OK，图像序列将被加载至 ImageJ 中。
3. 对所有图像进行阈值化处理，使每幅图像均呈现为白色背景，果蝇则转化为一个黑色斑点。开始此过程前，首先在 Image 选项卡下选择 Type → 8 bit，将图像转换为 8 位格式。
   1. 再次点击 Image 选项卡，选择 Adjust → Threshold。此时将打开 Threshold 对话框，可在此调整阈值截断点。
   2. 浏览整个图像序列，检查是否存在额外的黑色斑点，或某帧图像中缺失黑色斑点。若存在此类问题，需调整阈值以解决。通常情况下，程序默认值已足够，无需手动调整阈值。
      注意：图像序列中的每一帧都应仅包含一个黑色斑点，代表果蝇的位置。
   3. 在 Threshold 对话框中点击 Apply，随后将弹出 Convert to Mask 对话框。请勿勾选任何选项，直接点击 OK，完成图像序列的阈值化处理。
4. 完成图像序列的阈值化处理后，在 Plugins 选项卡下选择 Multitracker 插件，以测量果蝇移动的像素值。此时将弹出 Object Tracker 对话框。
   1. 勾选对话框中列出的全部四个选项，然后点击 OK。Multitracker 插件将为每一帧图像中的黑色斑点附加坐标，并在 Results 窗口中列出这些坐标，以及以像素为单位的总路径长度。Paths 窗口则以图形方式显示果蝇的移动轨迹。
   2. 从 Results 窗口中复制 x- 和 y-坐标列表，并将数据粘贴至 Excel 表格中。若图像序列中某一帧缺失黑色斑点，Multitracker 程序将在该帧处停止运行。若发生此情况，需返回步骤 4.2，重新对图像序列进行阈值化处理，以确保目标帧中果蝇被正确识别为黑色斑点。
5. 为将路径长度从像素单位转换为厘米，需另取一张白纸上两个相距 1 cm 的黑点的图像。
   1. 按照上述步骤（3.1–4.4.2）确定这两个黑点的 x、y 像素坐标，并利用该信息计算 1 cm 对应的像素数量。此转换系数将在第五步中用于生成以厘米为单位的运动数据。注意：完成此步骤后，必须在后续所有实验记录中保持相机位置固定。每次移动或调整相机后，均需重复此步骤以重新校准像素与厘米的换算关系。
   2. Multitracker 插件生成的路径长度会高估实际运动量，因为果蝇身体位置的微小波动以及光照强度/反射变化会影响阈值化后黑色斑点的大小和中心位置，从而引入噪声。必须去除此类噪声，才能获得对果蝇运动的准确估计。

5. 使用 Excel 进行数据分析

1. 通过将 Multitracker 程序生成的 x、y 坐标序列导入 Fly Analysis（由作者开发的 Excel Visual Basic 程序）中，对记录的数据进行去噪处理。（该程序可通过联系作者获取。）
2. 点击“Click Me”按钮并选择阈值截断值。进行 SLA 分析时选择 0.5 cm/sec 的阈值，进行运动分析时选择 0.1–0.3 cm/sec 之间的阈值。点击“OK”，程序将计算运动速度、时间和距离。注意：程序采用滑动窗口法对连续的 0.5–1.0 秒时间区间内的数据进行分析，并计算该时间窗口内的速度。任何高于用户定义阈值的数据均被视为果蝇运动。

结果

本文所述技术先前已被用于分析Drosophila BS突变体中SLA的差异¹。本研究中涉及的BS品系包括easily shocked（eas）、bang senseless（bss）和technical knockout（tko）。eas基因座编码一种乙醇胺激酶，参与磷脂酰乙醇胺的合成¹⁵，而tko基因座编码一种线粒体核糖体蛋白¹⁶。bss突变是电压门控钠离子通道paralytic（para）的一个等位基因¹⁷。本研究中使用的等位基因为eas¹、bss¹和tko^25t。

该方法在测量比叶面积（SLA）方面的有效性示例如下所示 图1，...

讨论

在研究果蝇（Drosophila）的运动或移动模式时，能够获取其移动距离、移动速度以及移动模式的相关信息具有重要意义。为了获取这些信息，传统上需要使用昂贵的设备，而这对于规模较小的实验室或仅需偶尔开展此类检测的实验室而言，往往难以承受^4,8,9。

本实验方法可用于测定运动距离（图2和 6）、运动速度（图4和 7）以及运动模式（图1和 5），所用设备成本低于两百美元。通过我们开发的 Excel Visual Basic 程序，可对 ImageJ 程序生成的一系列 x、y 坐标进行分析，从而提取上述所有信息。该系统此前已被用于鉴定对癫痫敏感的 Drosophila BS 突变体中 SLA 的遗传和药理学抑制因子¹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
网络摄像头	Logitech	Pro900	任何质量合格的网络摄像头均可使用。
HandiAVI 延时软件	Azcendant 软件		最新版本可从 http://www.azcendant.com/ 获取
ImageJ	NIH		最新版本可从 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html 获取
Multitracker 插件	NIH		最新版本可从 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html 获取
涡旋振荡器	VWR	Vortex Genie 2	大多数标准尺寸的涡旋振荡器（如 Vortex Genie 2）均可满足要求。
5 cm 培养皿盖	LabM Limited	D011	可使用更小或更大的培养皿盖作为运动实验中的实验区域。
光源箱	自制		由废旧材料制成。光源箱用于运动能力实验。根据室内光照条件，有可能无需光源箱即可完成实验。