高通量定量表达筛选与纯化技术应用于在大肠杆菌（E. coli）中表达的重组二硫键富集型毒液蛋白

摘要

本文描述并应用了一种从小规模大肠杆菌（Escherichia coli）培养物中对融合蛋白进行定量、高通量表达筛选及分析性纯化的方法，该方法适用于富含二硫键的动物毒液蛋白靶标的表达。

摘要

Escherichia coli (E. coli) 是用于生产重组蛋白以进行结构与功能研究的最常用表达系统。然而，蛋白质纯化有时具有挑战性，因为许多蛋白质以不溶性形式表达。因此，在处理难以表达或多个目标蛋白时，建议在小规模（1–4 ml 培养液）条件下进行高通量（HTP）蛋白表达筛选，以快速确定可溶性表达的条件。为应对实验室中各类结构基因组学项目的需求，已建立并验证了一种定量（重组蛋白产量范围为 0.1–100 mg/L 培养液）且高通量的蛋白表达筛选流程。该流程已通过液体处理机器人实现自动化，但也可在无专用设备的情况下手动操作。

富含二硫键的毒液蛋白因其作为治疗性药物先导分子的潜力而日益受到关注。这些蛋白可能具有高度的活性和选择性，但其复杂的二硫键网络使其制备极具挑战性。作为欧盟第七框架计划“欧洲毒理组学项目”（FP7 European Venomics project，www.venomics.eu）的成员，我们的任务是开发高效的生产策略，旨在表达数千种新型毒液蛋白，用于功能表征。借助二硫键异构酶 DsbC 的氧化还原特性，我们优化了高通量生产流程，使其能够在大肠杆菌（E. coli）细胞质中表达氧化态且具有功能的毒液肽。该流程同样适用于多种富含二硫键蛋白的生产。本文以动物毒液蛋白的制备为例，展示了该流程的应用。采用本文所述方案，有望在短短一周内获得可溶性的富含二硫键蛋白。即使小规模制备，所纯化的蛋白也可用于通过质谱法验证其氧化状态、开展初步研究中的功能表征，或用于高灵敏度的微量检测。

引言

随着基因组学的发展以及新蛋白质发现速度的加快，人们已开发出高通量技术流程，以并行化传统方法，用于筛选和鉴定最优的蛋白质生产策略。需要优化的潜在变量包括但不限于：不同表达菌株^1,2、温度^3,4、培养基^2,3、靶蛋白变体⁵、融合伴侣^6-13、与分子伴侣共表达^14,15、胞质或周质表达^16-18，以及纯化缓冲液组分³。通过实施高通量方法，可高效地并行测试多个变量或多个靶标，同时减少批间差异。根据我们的经验，采用相同的培养条件（温度、培养基、通气等）和纯化条件（相同树脂、缓冲液等）进行放大时，该策略也表现出良好的可重复性。在过去十年中，已有多种高通量平台被用于确定可溶性蛋白表达的条件，主要是通过改变融合伴侣、表达菌株或温度等参数来实现^19-23。

我们最近采用了高通量筛选方法用于表达可溶性富含二硫键的蛋白质¹¹。所选蛋白质不仅来源于毒液，还包括来自多种物种（如植物、猪、牛和人类）的富含二硫键的酶抑制剂。该实验比较了12种不同的融合伴侣和3种不同表达菌株对28种二硫键交联蛋白质的可溶性和折叠特性的影响。我们证明，在BL21 (DE3) pLysS菌株中使用DsbC作为融合伴侣进行表达，在产量以及获得可溶性蛋白的数量方面，显著优于其他所有测试的菌株与融合伴侣组合¹¹。该实验结果为我们原有通用高通量流程（此前已用于多种蛋白质的表达筛选）^22,24 的优化提供了依据，使其更适用于富含二硫键靶蛋白的表达。来自动物毒液的富含二硫键蛋白质尤其具有研究价值。毒液是多种生物活性肽和蛋白质的复杂混合物，在药理学和治疗学上具有潜在应用价值。然而，含二硫键蛋白质的表达并非易事。这类蛋白质通常含有1至7个二硫键，必须以正确的二硫键连接模式进行氧化才能具备活性。目前，该平台正被用于欧洲第七框架计划VENOMICS项目（www.venomics.eu）中大量动物毒液富含二硫键蛋白的表达筛选，并用于建立新方法以实现数千个靶标的高通量表达标准化评估。本文提供了一种自动化方法，用于对富含二硫键的动物毒液蛋白进行高通量小规模表达筛选与纯化（见图1）。该策略针对富含二硫键的肽和蛋白质，利用HIS标签进行纯化，并采用具有氧化还原活性的融合伴侣DsbC，从而构建可切割的HIS-DsbC与目标蛋白的融合体（见图2）。

尽管本方案的重点是使用液体处理机器人和高通量电泳进行自动化操作，但这些方法同样适用于高通量手动操作。这意味着即使设备基础较为简单的实验室，也可以在无需昂贵仪器的前提下应用这些方案。有关从转化到纯化及分析的手动操作流程（不限于富含二硫键的蛋白质）已在其他文献中发表。²⁴ 且此处不再重复。手动操作的通量（从表达克隆开始，通过重组克隆产生）²⁵，用于分析可溶性蛋白水平）为96（使用SDS-PAGE检测）或384（4 × 96；使用点印迹和SDS-PAGE）²⁶每周培养（见 图1）。如果以半自动化方式（使用液体处理机器人和点印迹）进行，效率可进一步提高。²⁶ 或高通量电泳，例如使用 Caliper GXII LabChip 系统²² 可并行处理多达1,152（12 × 96）个培养物，持续一周，用于结果分析，具体方法如本文所述。培养采用深孔24孔板（DW24）格式，因此可使用常规摇床培养箱；相比之下，深孔96孔板（DW96）格式的培养则必须使用短轨道高速振荡培养箱以实现充分通气（振荡速度为800 rpm）。采用自诱导培养基²⁷ 同时也简化了表达过程，消除了手动诱导步骤。即使在实验室已使用预定义的表达和纯化条件的情况下，这些条件也可直接转移至该高通量系统中，以提升效率。文中提供了二硫键丰富蛋白高通量筛选流程的详细示意图。 图3. 流程中的参数是基于大量筛选实验确定的^11,22，这使我们能够选择最适合蛋白质生产的条件。

在初步研究中，可直接从小规模表达中纯化带有标签的蛋白质进行表征，此时数十微克样品已足够使用，或用于灵敏的功能检测和结合检测（例如低体积高通量膜片钳系统²⁸）。只要去除标签和蛋白酶（例如通过反相高效液相色谱法），同样也可对切割后的无标签目标蛋白进行表征。质量控制还可通过质谱法（确认预期分子量及氧化状态）或色谱方法（确认纯度或异质性）进行²⁹。有时标签的切割并非必需，甚至可能不利（特别是对于溶解性差的蛋白质^30,31），因此本方案中标签切割为可选步骤。无论如何，所有构建体中，目标基因的上游均包含TEV蛋白酶切割位点（ENLYFQ/[G]³²），以便切割后获得天然序列的蛋白（见图2及讨论部分）。若需切割融合标签，可在小规模条件下对洗脱组分或“柱上”样品进行切割试验，以分析切割效率、必要时优化反应条件，并为后续放大实验提供可靠的产量估算。

在亲和纯化过程中，磁珠的使用体积有两种选择，具体取决于实验目的和预期。若需尽可能多地捕获蛋白（用于初步检测、质谱分析或放大生产时的产量推算），应使用终体积为200 µl的树脂，此条件下可在系统饱和前检测到培养物中1–100 mg/L范围内的可溶性蛋白（见第8.1节中的方案(A)）。然而，若实验目的是检测少量可溶性蛋白，则使用终体积为50 µl的树脂更为合适，此条件下可检测到培养物中0.1–25 mg/L范围内的可溶性蛋白（见第8.2节中的方案(B)）。

如有需要，可扩大生产规模，以获取毫克级纯化目标蛋白，用于进一步的结构与功能研究，具体条件基于可溶性表达所确定的条件。AFMB所用的放大工艺详细方案已在其他文献中讨论过^22,24。

讨论部分提供了与实验设置相关的更多细节、方案中的关键步骤、技术的修改与故障排除方法以及该技术的局限性。在开始实验之前，请务必阅读讨论部分。

在整个实验流程中，我们期望每一步的成功率达到90%（例如，在任何特定步骤中，至少有90%的培养物能够正常生长）。如果实验中任一步骤的成功率低于90%，则应弃用这些样品，并对全部构建体重新进行实验。然而，该成功率标准不适用于可溶性蛋白表达的构建体数量或切割效率达到100%的构建体比例，因为这些指标在很大程度上取决于所测试的蛋白质本身。

每种实验方案中均提供了机器人工作台设置的具体细节（另见图4），但也可根据需要调整以适应其他类型的工作台配置。机器人硬件（Tecan）包括96通道多通道臂（MCA96）、机器人操作臂（RoMa）以及8通道液体处理头（LiHa）。所有使用MCA96的步骤在无MCA96时也可通过LiHa完成，但耗时更长，因为LiHa在各步骤之间需要进行清洗。尽管机器人系统在技术上并非无菌环境，但添加抗生素通常可确保不会出现污染或无菌问题。

方案

A 部分：转化与测试表达

克隆²²及转化至纯化过程的手工操作步骤在其他文献中已有讨论²⁴。转化实验方案可在机器人平台上完全自动进行²⁶，但通常手工操作更为节省时间。因此，本文所述实验方案从表达预培养物的接种开始，并对经手工热激处理后的转化混合物进行涂板。有关手工克隆与转化操作的更多细节，请参阅相关参考文献^22,24。

1. 预培养与涂布

1. 准备机器人工作台（位置参见图4）：
   1. 在位置8放置一个含有150 ml无菌LB肉汤的300 ml槽，LB肉汤中添加氨苄青霉素（100 µg/ml）/氯霉素（34 µg/ml），或其他适当的抗生素。
   2. 在位置11放置一个无菌的DW96板。在位置14至17放置4块预先准备好的24孔LB琼脂（Amp/Cam）组织培养板（每孔含2 ml琼脂），并保留其盖子。
   3. 将转化板（含有热激后的96个转化混合物）放置在位置13，用于接种液体预培养物和LB琼脂平板。在位置18放置一盒无菌的200 µl移液枪头。
2. 使用96通道多通道臂（MCA96）和200 µl枪头，从位置8吸取200 µl LB肉汤，加入位置11的DW96板中。重复此操作，直至DW96板的每个孔中最终含有1 ml LB肉汤。此即为液体预培养物。
3. 使用机器人操作器（RoMa），取下第一块24孔LB琼脂板的盖子，并将其暂时放置于其他位置（例如酒店载体中），直至该板的涂布操作完成。
4. 使用8通道液体处理（LiHa）头，混匀后从位置13吸取第一列转化混合物50 µl。此体积的转化混合物恰好足以覆盖LB琼脂孔。
5. 使用前4个通道，将液体加入位置14的第一块24孔LB琼脂板的第一列（如图5所示）。
6. 使用后4个通道，将液体加入第一块24孔LB琼脂板的第二列。
7. 加样后彻底清洗所有枪头。
8. 继续此过程，直至位置14的第一块板上完成全部转化混合物的涂布，按照图5所示的方案从96孔转移至24孔。
9. 第一块板完成后，使用RoMa将盖子盖回，并取下位置15下一块板的盖子。继续按照涂布方案完成接下来的3块板。
10. 涂布完成后，将Te-Shake设置为1,200 rpm，振荡所有平板1分钟，以确保转化混合物均匀分布。
11. 使用MCA96和原始枪头，混匀后从位置13吸取剩余转化混合物60 µl，加入位置11含有LB肉汤的DW96板中。
12. 使用透气性粘性膜密封DW96预培养板，以保证培养过程中的通气。
13. 将DW96板置于37 °C摇床培养箱中，以最大转速过夜培养（200/800 rpm，取决于摇床轨道直径）。
14. LB琼脂平板应取下盖子后置于生物安全柜中直至干燥（约10分钟），然后倒置放入37 °C培养箱中，培养至次日早晨。
15. 次日，使用预培养物接种自诱导培养基进行表达测试，并用于制备甘油菌种。将琼脂平板放入冰箱作为备份。如有需要，可从琼脂平板或甘油菌种重新接种新鲜LB预培养物，重复表达实验。

2. DW24 ZYP-5052 平板的制备

注意：每组 4 块 DW24 板完成此操作大约需要 5 分钟。

1. 为每组96个培养物重复实验配制500 ml ZYP-5052自诱导培养基（依次加入464 ml ZY培养基、250 µl 2 M MgSO₄、10 ml 50x 5052、25 ml 20x NPS——各组分配方见表1），并添加适当的抗生素。
2. 准备机器人工作台：
   1. 在位置5和6各放置一个300 ml储液槽，每个槽中加入约250 ml培养基。在位置14至17放置四块无菌DW24板。在位置18放置200 µl吸头。
3. 使用MCA96和200 µl吸头，从位置5吸取200 µl ZYP-5052培养基，加入位于位置14的第一个DW24板中。共重复此操作5次（4个吸头同时向一个孔中加样，总计4 ml）。对位于位置15至17的其余3块DW24板重复上述操作，在处理最后两块DW24板时改用位置6中的ZYP-5052培养基。

3. 测试表达培养物的接种与培养

注意：每组 4 块 DW24 板的接种操作约需 10 分钟完成，随后继续过夜培养。

1. 准备机器人工作台：
   1. 将含有预培养物的DW96板（来自步骤1.15）放置在位置11。将含有ZYP-5052培养基的四个DW24板（来自步骤2.3）放置在位置14至17。
2. 使用LiHa从位置11吸取100 µl预培养物，按照图5所示方案接种至测试表达培养物中（1/40稀释）。每次处理96孔预培养板的不同列之间，均需在清洗站彻底清洗LiHa吸头。
3. 用透气膜密封DW24板，并在37 °C下振荡培养4小时（200/400 rpm）。此阶段为生长期，期间培养基中的葡萄糖将被优先消耗²⁷。
4. 将温度降至17 °C。在4小时后葡萄糖耗尽时，乳糖开始被代谢，从而诱导蛋白表达，为本研究中使用的BL21 (DE3) pLysS或Rosetta 2 (DE3) pLysS菌株提供最佳生长条件²²。让细胞过夜表达。同时利用剩余的预培养物制备甘油菌种保存液。

4. 甘油菌种保存液的制备

注意：为防止冰箱故障，甘油菌种应制备三份，并存放于不同位置。

1. 准备机器人工作台：
   1. 将微孔板放置在位置5至7，用于存放甘油菌种。在位置8放置一个300 ml的槽，内含50 ml 100%甘油。在位置11的每个孔中放置一个DW96板，其中含有800 µl预培养物（来自步骤3.2）。在位置18放置200 µl吸头。
2. 使用较慢的吸液和分配速度，利用MCA96和200 µl吸头将甘油加入含有预培养物的DW96板中。
   1. 从位置8吸取200 µl甘油。
   2. 首先在位置11分配150 µl，然后暂停20秒，使残留的甘油流至吸头底部，再将剩余的50 µl分配完毕。
3. 使用同一吸头，在位置11的DW96板中充分混匀菌液与甘油。最终甘油浓度为20%。从DW96板中吸取140 µl，转移至位置5的第一个微孔板中。
4. 对剩余的每个微孔板（位置6和7）重复步骤4.3。
5. 用塑料封口膜密封每个微孔板，并于-80 °C保存。弃去DW96板中剩余的培养物，弃置前需使用抗菌剂进行去污染处理。

5. 评估培养物的生长情况

注意：通常不需要评估最终生长速率，因为在大多数培养条件下最终 OD₆₀₀ 通常相同（在这些条件下约为 12），但应记录任何未生长的培养物。

1. 取50 µl每种培养物（来自步骤3.4），加入到含有150 µl培养基的平底透明微孔板中。
2. 测定OD₆₀₀，并考虑4倍稀释因素。若某些样品生长不佳，需在最终分析时予以记录。

6. 收集细胞

注意：此步骤大约需要 45 分钟完成。

1. 将步骤 3.4 中的 4 块 DW24 板在 3,000 × g 离心 10 分钟，然后将上清液弃入含有抗菌剂的废液容器中。将板倒置轻敲在吸水纸上，以去除残留的培养基。
2. 同时，准备 100 ml 裂解缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8，或其它偏好的缓冲液），并加入溶菌酶（终浓度为 0.25 mg/ml）。
3. 准备机器人工作台：
   1. 将裂解缓冲液置于位置 5 的 300 ml 槽中。在位置 11 放置一块干净的 DW96 板。将含有菌体沉淀的 4 块 DW24 板（来自步骤 6.1）放置在位置 14–17。在位置 18 放置 200 µl 吸头。
4. 使用 MCA96 和 200 µl 吸头，从位置 5 吸取 125 µl 裂解缓冲液，加入每块 DW24 板（位置 14–17）中。重复一次。注意：4 个吸头将同时向一个孔中加液，使 DW24 板每个孔的终体积为 1 ml。
5. 使用 Te-Shake（1,000 rpm）振荡位置 14–17 的板 15 分钟，以重悬沉淀。
6. 沉淀重悬后，使用 LiHa 的前 4 个通道从样品 1 至 4（第一块 DW24 板第一列，位于位置 14）吸取 550 µl，然后使用 LiHa 的后 4 个通道吸取样品 5 至 8（第一块 DW24 板第二列）550 µl，将液体加入位置 11 的 DW96 板第一行中。
7. 重复步骤 6.6，使所有细胞悬液均转移至 DW96 板中。
8. 每次处理完一组样品后，将 LiHa 吸头在清洗站中清洗。
9. 按照 图 5 所示方案，对每块 DW24 板（位置 15–17）的每一列重复执行步骤 6.6 至 6.8。用塑料封膜密封。
10. 如需当天纯化或短期冷冻保存，请在 -80 °C 至少保存 1 小时；否则保存于 -20 °C。

B 部分：纯化与分析

7. 细胞裂解

注意：此步骤大约需要 60 分钟完成。

1. 将冻存的细胞悬液（来自步骤 6.10）置于水浴中（室温或 37 °C）解冻约 15 分钟，并在摇床培养箱中继续重悬 10 分钟。此时培养物应变得黏稠。
2. 取 500 µl DNase 储存液，与 1 ml MgSO₄ 储存液混合。使用 8 道移液器手动操作或使用机器人 LiHa，向 DW96 的每孔中加入 15 µl 混合液，使 DNase 的终浓度为 10 µg/ml，MgSO₄ 的终浓度为 20 mM。
3. 用塑料封口膜重新密封板，继续振荡 15 分钟。此时培养物应不再具有黏性。务必通过肉眼观察仔细检查所有培养物是否均已失去黏性。注意：此步骤至关重要；若部分培养物仍具黏性（例如，某些孔中意外遗漏或未正确加入 DNase），过滤器可能发生堵塞，导致样品受力不均，或在纯化过程中出现滤板溢出甚至完全堵塞的情况。
4. 对于全细胞裂解液的 SDS-PAGE 样品，吸取 10 µl 裂解液加入含有 10 µl 4x SDS-PAGE 上样缓冲液和 20 µl 水的 96 孔 PCR 板中。在 95 °C 下变性 3 分钟，随后冷冻保存待分析（总组分）。若具备高通量电泳系统，可按照制造商推荐的样品制备方案在该系统上进行分析。有关样品分析的更多细节，请参见第 10 节。

8. 镍亲和纯化

注意：吸取所有树脂悬浮液时应使用较慢的加样速度，因为悬浮液较为黏稠。树脂过度干燥会导致结合能力下降。用于纯化时，所指定的咪唑浓度适用于镍亲和树脂。如果使用其他离子（例如，钴）被使用时，则应相应调整其浓度。

1. A - 镍亲和纯化，用于检测浓度范围为1-100 mg/L的样品（最终树脂体积 = 200 µl）
   注意：该纯化过程完成约需1.5小时，因此一天内最多可进行4次。
   1. 准备机器人工作台：
      1. 将分别含有结合缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8）、洗涤缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，50 mM 咪唑，pH 8）和洗脱缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 8）的300 ml槽置于第6至第8位。
      2. 在位置5留出一个300 ml的空槽用于树脂浆液。在位置9和10放置板架。在位置10放置一个DW96，其上安装SPE模块及滤膜/接收板（20 µm）。
      3. 将含有裂解液的DW96板（来自步骤7.3）置于位置14。在位置18和19分别放置200 µl宽口吸头和200 µl标准吸头。在支架上放置两块备用的DW96板，用于洗涤和洗脱步骤。注意：若无支架，也可将其放置于工作台上的其他合适位置。
   2. 准备105 ml平衡好的33%树脂悬液（35 ml树脂 + 70 ml结合缓冲液）。在开始实验步骤前，立即将树脂悬液加入位置5的槽中。
   3. 使用 MCA96 和 200 µl 宽口吸头（位置 18），在吸取前充分混匀位于位置 5 的树脂悬液，然后将 200 µl 树脂悬液转移至位于位置 14、含有裂解液的 DW96 中。重复此步骤两次，共向裂解液中加入 600 µl 树脂悬液，每次吸取前均需混匀树脂悬液。
   4. 使用MCA96在位置14进行10分钟的混匀步骤，以促进结合并防止树脂沉淀。
   5. 从14号位置吸取溶液，并将800 µl（分四次，每次200 µl）转移至9号位置的滤板上；每次吸取前需混匀，否则树脂将沉积在DW96板底部。
   6. 在位置10处开启真空约90秒，使裂解液通过板过滤进入DW96中以收集穿流液，注意避免树脂干裂。关闭真空。
   7. 重复步骤 8.1.5 和 8.1.6，使所有树脂均转移至滤板中。
   8. 使用RoMa机械臂将承载滤板的SPE模块从位置10移至位置9，使下一步洗涤直接排入废液，并将位于位置10、含有穿流液的DW96转移至另一位置例如，直至实验程序结束。
   9. 使用一组新的 200 µl 吸头（位置 19），用总共 800 µl 结合缓冲液（位置 6）洗涤树脂（位置 9），并在位置 9 施加真空，直至缓冲液完全通过。重复此步骤一次。
   10. 使用 RoMa 机械臂将新的 DW96 置于位置 10，以收集 50 mM 咪唑洗涤液，并将 SPE 柱块和滤板移回上方（位置 10）。
   11. 从第7位加入800 µl洗涤缓冲液至第10位，开启真空泵，直至缓冲液完全通过。关闭真空泵。
   12. 使用 ROMA 时，将 SPE 柱块和滤板移至位置 9，将含有洗涤样品的 DW96 转移至孵育位，并置于一旁，直至程序结束。
   13. 用另外800 µl洗涤缓冲液（从位置7转移至位置9）洗涤树脂，施加真空直至缓冲液完全通过。重复此步骤一次。
   14. 使用 RoMa 将新的 DW96 置于位置 10，并将 SPE 模块和滤板重新放回上方，以收集洗脱液。
   15. 总共加入 500 µl 洗脱缓冲液（从第 8 位加入至第 9 位），并进行孵育 原位 3 分钟。开启真空泵，直至所有缓冲液完全通过。
   16. 可选：对于高表达蛋白，可按照步骤 8.1.14 和 8.1.15 的方法，将第二次洗脱进行至新的 DW96 中。
   17. 取流穿液、洗涤液和洗脱液样品，用于SDS-PAGE或高通量电泳分析。
       1. 对于流穿组的SDS-PAGE样品，取10 µl加入含有10 µl 4X SDS-PAGE上样缓冲液和20 µl水的96孔PCR板中。对于洗涤组和洗脱组的SDS-PAGE样品，取30 µl加入含有10 µl 4X SDS-PAGE上样缓冲液的PCR板中。95 °C变性3分钟，随后冷冻保存直至分析。
       2. 对于高通量电泳样品，请遵循制造商的说明。有关样品分析的更多细节，请参见第10节。
2. B - 镍亲和纯化，用于检测浓度范围为 0.1–25 mg/L 的目标物（最终树脂体积 = 50 µl）
   注意：该纯化步骤约需30分钟完成，意味着一天内最多可进行12次。
   1. 准备机器人工作台：
      1. 将分别含有结合缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8）、洗涤缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，50 mM 咪唑，pH 8）和洗脱缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 8）的300 ml槽置于第6至第8位。
      2. 在位置5留出一个300 ml的空槽用于树脂浆液。在位置9和10放置板架。在位置10放置一台DW96，上方安装SPE模块及滤膜/接收板（20 µm）。
      3. 将含有裂解液的DW96板（来自步骤7.3）置于位置14。在位置18和19分别放置200 µl宽口吸头和200 µl标准吸头。在支架上放置一个备用的96孔微孔板用于洗脱。注意：若无支架，也可将其置于工作台上的其他合适位置。
   2. 配制50 ml平衡好的25%树脂悬液（12.5 ml树脂 + 37.5 ml结合缓冲液）。在开始实验前，立即将树脂悬液加入位置5的槽中。
   3. 使用 MCA96 和 200 µl 宽口吸头（位置 18），在吸取前充分混匀位于位置 5 的树脂悬液，然后将 200 µl 树脂悬液转移至位于位置 14、含有裂解液的 DW96 中。
   4. 在室温下使用 Te-Shake 以 1400 rpm 振荡孵育 10 分钟，以促进结合。
   5. 从第14位吸取溶液，并使用宽口吸头（第18位）将全部1,200 µl（分6次，每次200 µl）转移至第10位的滤板中。每次吸取前需充分混匀，否则树脂会沉积在DW96底部。
   6. 在位置10处开启真空约30秒，使裂解液通过滤板进入DW96孔板，收集穿流液，注意避免树脂干燥。关闭真空。
   7. 使用 RoMa 机械臂，将承载滤板的 SPE 模块从位置 10 移至位置 9，使下一步洗涤直接排入废液；同时将位于位置 10 的含有穿流液的 DW96 转移至另一位置例如，直至实验程序结束。
   8. 使用200 µl吸头（位于19号位置），用总共800 µl结合缓冲液（来自6号位置）清洗树脂（位于9号位置），并在9号位置施加真空，直至缓冲液完全通过。重复一次。
   9. 使用 RoMa 机械臂将新的 DW96 置于位置 10，以收集 50 mM 咪唑洗涤液，并将 SPE 柱块和滤板移回上方（位置 10）。
   10. 从第7位加入150 µl洗涤缓冲液至第10位，开启真空泵，直至缓冲液完全通过。关闭真空泵。
   11. 使用 ROMA 将 SPE 柱块和滤板移至位置 9，并将含有洗涤样品的 DW96 转移至孵育位，保留至实验程序结束。
   12. 用另外800 µl洗涤缓冲液（从位置7转移至位置9）洗涤树脂，施加真空直至缓冲液完全通过。重复一次。
   13. 使用 RoMa 将微孔板移至位置 9，并将固相萃取（SPE）块和滤板重新放回上方，以收集洗脱液。
   14. 加入190 µl洗脱缓冲液（从位置8加至位置9），并孵育 原位 3 分钟。抽真空直至所有缓冲液完全通过。
   15. 取流穿液、洗涤液和洗脱液样品，用于SDS-PAGE或高通量电泳分析。
       1. 对于流穿组的SDS-PAGE样品，取10 µl加入含有10 µl 4X SDS-PAGE上样缓冲液和20 µl水的96孔PCR板中。对于洗涤组和洗脱组的SDS-PAGE样品，取30 µl加入含有10 µl 4X SDS-PAGE上样缓冲液的PCR板中。95 °C变性3分钟，随后冷冻保存直至分析。
       2. 对于高通量电泳样品，请遵循制造商的说明。有关样品分析的更多细节，请参见第10节。

9. 标签切割（可选）

1. 将TEV蛋白酶（2 mg/ml）按1/10（v/v）的比例加入洗脱的蛋白（来自步骤8.1.15（和8.1.16）或步骤8.2.14）中。
2. 在室温（或对温度敏感的蛋白质置于 4 °C）下轻轻振荡孵育过夜。
3. 在裂解结束时，将30 µl裂解液加入含有10 µl 4x SDS-PAGE上样缓冲液的PCR板中，或按照制造商说明处理高通量电泳样品。
4. 将剩余的裂解混合物（来自步骤 9.2）通过一个 96 孔 0.22 µm 滤板过滤，并在 DW96 中收集可溶性穿流液，同时施加真空。此操作可在其中一个真空位点进行例如将液体处理机器人上的位置10（如第8.1和8.2节洗脱步骤所述）进行操作，以去除在切割过程中可能沉淀的任何蛋白质。
5. 过滤后，取30 µl加入含有10 µl 4x SDS-PAGE上样缓冲液的PCR板中，或按高通量电泳样品方式制备。该步骤可用于比较切割前的蛋白、切割后的混合物以及切割后仍保持可溶的蛋白，有助于预测后续放大实验的预期结果。有关样品分析的更多细节，请参见第10节。

10. 结果分析

1. 通过 SDS-PAGE、点印迹（dot blot）或高通量电泳系统（如 Caliper LabChip）分析纯化样品，鉴定表达可溶性蛋白的构建体。
   1. 首先分析洗脱样品，以鉴定产生可溶性蛋白的构建体。大多数情况下，若已鉴定出可溶性构建体，则仅分析洗脱样品，以尽量减少分析所需时间。
   2. 如果目标蛋白未出现在洗脱组分中，应运行洗涤液和穿流液样品，以判断蛋白是否表达但未能正确结合到树脂上。
   3. 对于无法检测到可溶性蛋白的构建体，应运行全细胞裂解液样品，以检查蛋白是否表达。
      注意：此处的一个局限性在于，若目标蛋白的表达水平未超过背景表达水平，则可能无法检测到该蛋白，从而导致假阴性结果。需注意的是，蛋白有可能在亲和树脂上发生非特异性吸附或沉淀，这可能导致假阴性结果或在使用推荐方案时低估产量（在本研究中属罕见事件）。如果蛋白在洗脱后发生沉淀（洗脱数分钟至数小时后可见白色沉淀），建议调整缓冲液组成（例如盐浓度），和/或进行差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry）实验以优化缓冲液条件。此外，可将少量树脂重悬于 SDS-PAGE 上样缓冲液中并煮沸，以检测是否有蛋白滞留在树脂上。
   4. 如果蛋白未表达但细胞正常生长，则应尝试新的表达策略；若 OD₆₀₀ 值未达到预期水平，则应重新培养并再次分析培养物。
   5. 若需分析切割样品，应采用并行比较的方式进行分析，使每个构建体在切割前和切割后的样品分别位于相邻泳道，以便于分析。
2. 除非使用可直接定量洗脱液浓度的方法，否则应对阳性样品通过测量 280 nm 处的吸光度（A280）进行定量。
   1. 测量 A280 时应以洗脱缓冲液为空白对照，并考虑蛋白的摩尔消光系数，从而估算蛋白产量，以确定表达量最高的可溶性构建体。
   2. 为最可靠地比较可溶性蛋白的产量，建议根据培养物密度（使用第 5 节中测得的 OD₆₀₀ 值）对产量进行归一化处理。若所有培养物的密度大致相同，则无需归一化。

11. 质量控制

1. 可通过液相色谱-质谱法（LC/MS）直接从洗脱液或切割样品中分析样品。
2. 或者，可先使用 ZipTip 吸头或液相色谱方法进行脱盐（以去除咪唑及可能存在的缓冲盐），然后采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）或电喷雾电离（ESI）质谱法进行分析。
3. 可进行小规模功能研究，以检测蛋白质功能是否符合预期。若功能研究需要较大量的蛋白，可扩大培养规模，并在小规模实验确认蛋白大小和氧化状态后，从大规模培养物中进行功能检测。

结果

代表性结果如图所示 图6 用于VENOMICS流程中96种富含二硫键蛋白的表达筛选. 蛋白质按照二硫键数目递增，随后按残基数递增的顺序排列。这些多肽在细胞质中表达，带有 HIS-标签和 DsbC 融合伴侣。在使用推荐的培养条件时，OD₆₀₀ 通常可达到12的倍数。使用方案8.2-B进行肽段纯化，镍亲和树脂终体积为50 µl，因此本实验中可检测到的融合蛋白最大量约为25 mg/L。

图6A展示了Caliper LabChip系统获得的电泳结果（显示切割前的融合蛋白）以及基于外推法得出的融合蛋白产量评分系统（以每升培养液中的毫克数计，分为0.1至2 mg/L培养液、2至10 mg/L培养液、10至25 mg/L培养液以及未检出）。请注意，切割后的DsbC标签通常迁移至约32 kDa处，而非预期的27 kDa。类似地，DsbC融合蛋白的迁移位置也通常比预期高出约5 kDa。在许多靶蛋白中，我们不仅观察到完整的融合蛋白（上条带），还观察到单独的融合伴侣蛋白（下条带）。对于其中部分靶蛋白，优化培养条件可提高完整融合蛋白（上条带）相对于单独DsbC的比例，从而提升最终产量。评分仅依据完整融合蛋白的表达水平。在96种蛋白中，仅有16种在融合蛋白水平上未能检出，总体成功率为83%。在可检测到的80种蛋白中，有45种的表达水平高于2 mg/L培养液（占56%）。根据靶蛋白和融合形式的不同，蛋白产量通常在2–100 mg/L培养液范围内（但在本示例中，采用方案8.2 B时，融合蛋白的最大检测量约为25 mg/L）。

根据二硫键数量对成功率进行的分析（如图6B所示）显示，对于所测试的所有二硫键数量（介于1至7之间），实验均取得了合理成功率，其中含有6个二硫键的靶标成功率最低，为66%。基于等电点和残基数对表达成功率分布的分析（如图6C所示）表明，该技术无明显偏好性，成功表达的靶标与未检测到的靶标在整个图谱中均呈分散分布。

图6D 展示了通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）对单一目标物在使用DTT还原前后所获得的质谱结果示例。通常情况下，无需进行如此全面的质谱分析（还原后的样品无需额外分析），但为了充分演示，我们展示了两种结果。所示目标物是一种分子量为5.7 kDa、富含二硫键的毒液蛋白，含有4个二硫键。左侧谱图显示的是蛋白在DTT还原前的结果，即裂解并脱盐后未经其他处理的状态。右侧谱图显示的是蛋白经DTT还原后再脱盐以去除过量DTT的结果。谱图中用箭头标出了对应于实验测得质量的离子峰，各离子的标识以绿色显示。这些离子所对应的实验母离子质量（分别为还原前（-DTT）和还原后（+DTT）的蛋白）列于表格中。测得的质量（还原前样品为5709.6 Da，还原后样品为5717.6 Da）相差8 Da。2 Da的质量差对应于1个氧化态二硫键的存在，因此8 Da的质量差表明未还原样品中存在4个二硫键（与预期一致）。

图1. 高通量表达筛选流程的示意图。 使用本方案，单人每周可通过手动操作测试96至384种条件，或使用所述半自动化设备测试多达1,152种条件。表达质粒采用重组克隆技术构建，可同时对多个目标基因进行亚克隆。一旦确定可溶性表达条件并完成（如需要的）切割反应，蛋白质即可进入质量控制环节，以检测氧化状态和纯度，并进行微量分析和/或大规模生产。

图 2. 通用重组克隆与表达载体构建的示意图。 从目标入门克隆出发，可在单次实验中高通量地亚克隆至多个表达载体（每周最多可处理 6 × 96 个入门克隆）。所表达的蛋白带有 HIS 标签，用于镍亲和层析纯化。融合伴侣 DsbC（去除其周质信号序列以实现胞内表达）可用于提高目标蛋白的可溶性，或辅助其正确折叠与氧化。需要注意的是，若需切除标签，目标编码序列应包含一个N端TEV蛋白酶切割位点（ENLYFQ）。左上角插图展示了使用供体载体与目标序列构建入门克隆的过程，目标序列可通过PCR或基因合成获得。入门克隆也可从商业化的入门克隆文库中获取。目前存在多种重组克隆系统，本研究采用如示意图所示的 Gateway 系统。

图 3. 多个富含二硫键靶蛋白的高通量筛选流程。 靶蛋白最初在BL21 (DE3) pLysS E. coli 的细胞质中以HIS-DsbC融合蛋白形式表达，使用自诱导培养基（ZYP-5052），在37/17 °C条件下进行。随后通过镍树脂进行纯化，并利用高通量电泳（或点印迹/SDS-PAGE）检测可溶性融合蛋白。如果第一轮表达筛选未成功，则尝试替代的培养条件。若构建体能够产生足够产量的可溶性蛋白，则可进行微量分析和质量控制，如有需要，还可进行大规模生产。对于可溶性产量不足的靶蛋白，可继续采用不同的菌株和温度进行表达筛选，随后尝试其他融合伴侣及周质表达。虚线框表示可选步骤。

图 4. 高通量平台的机器人工作台设置。 图中展示了我们液体处理机器人工作台的布局，尽管只要具备相应位置，也可使用其他类型的工作台。该设置包括一个用于8通道液体处理头（LiHa）的清洗站（WS）、两个各含4个位置的微孔板架（MP4，位置1-4和5-8）、一个具有两个位置的真空站（Te-VacS，位置9和10）、一个含3个位置的微孔板架（MP3，位置11-13）、两个各含2个位置的板振荡器（Te-Shakers，位置14-15和16-17），以及一个用于一次性吸头、具有3个位置的吸头架（DiTi，位置18-20）。此外，还配有用于深孔板的两个板位“旅馆”架（hotel carriers）和一个用于微孔板的板位架（未显示）。液体处理机器人上安装的硬件包括一个96通道多通道臂（MCA96），用于配合一次性吸头使用；一个带固定吸头的8通道液体处理头（LiHa）；以及一个可在工作台上移动微孔板/设备的机器人机械臂（RoMa）。本方案中各步骤均参照图示位置编号进行描述。

图5. 从单个96孔板转移至四个24孔板的示意图。

图6. 96种富含二硫键的毒液蛋白质表达筛选的代表性结果。 蛋白质以HIS-DsbC融合形式在细胞质中表达，并使用50 µl镍树脂进行纯化（方案8.2-B）。A) 表达筛选结果，显示虚拟凝胶图及表达产量评分。虚拟凝胶图中各泳道的对比度已进行调整，以补偿条带过弱或过强的情况。请注意，某些目标蛋白可见两条条带，上方条带对应完整的融合蛋白，下方条带对应单独的融合标签。B) 不同表达水平下蛋白质的占比与其蛋白质中二硫键数量的关系。每组中实际的蛋白质数量已叠加在图中。C) 基于等电点（pI）和残基数的表达水平分布情况。D) 一种分子量为5.7 kDa、含有4对二硫键的富含二硫键毒液蛋白的质谱分析结果示例。左侧谱图为经DTT还原前的蛋白，右侧谱图为经DTT还原并脱盐后的蛋白。图中箭头标出了对应实验分子量的离子峰，其归属以绿色显示。还原前与还原后蛋白的实验分子量列于表格中，二者相差8 Da，表明在加入还原剂前蛋白处于氧化状态。请点击此处查看该图的放大版本。

组分	配方	说明
ZY	~928 ml 10 g 胰蛋白胨 5 g 酵母提取物 925 ml 水	混合后高压灭菌以达到灭菌效果。
2 M MgSO4	100 ml 49.3 g MgSO4·7H2O ~60 ml 水	搅拌至完全溶解，然后高压灭菌以达到灭菌效果。
50x 5052	1 L 250 g 甘油 730 ml 水 25 g 葡萄糖 100 g α-乳糖	按顺序加入，加热搅拌至完全溶解，然后高压灭菌以达到灭菌效果。
20x NPS	1 L 900 ml 水 66 g (NH4)2SO4 136 g KH2PO4 142 g Na2HPO4	按顺序加入并搅拌至完全溶解，然后高压灭菌以达到灭菌效果。

表1. ZYP-5052 培养基各组分配方。

讨论

目前尚无一种通用的单一方案可用于表达可溶性、正确折叠且具有功能的蛋白质。为了节约成本和时间，大多数实验室或蛋白质核心设施在处理多个靶标时，通常采用高通量蛋白质表达筛选方法，以寻找最佳的“通用”变量组合，从而为大多数靶标获得可溶且有活性的蛋白质。我们已确定DsbC是一种普遍适用的融合伴侣，可用于富含二硫键的多肽和蛋白质的可溶性表达¹¹。通过使用DsbC融合蛋白及高通量方法，可在一周内观察到多个靶标的可溶性表达情况¹¹，随后可在后续轮次中针对需要进一步优化的靶标，筛选其他变量，例如引言中讨论的那些因素。本文所述方案旨在表达富含二硫键的蛋白质和多肽。然而，对于希望以高通量方式表达非交联蛋白质的用户，相应的实验方案此前已有发表，可参见其他文献^22,24。

高通量实验体系适用于多种应用场景，包括对大量不同蛋白质进行可溶性表达的筛选，或同时对多个目标基因（或单个目标基因的多个表达载体）的大量表达构建体（包含多种融合标签）进行筛选，以提高实验成功率。该平台还可用于在大量目标分子上对新建立的实验方案进行性能评估与验证。其他应用还包括针对单一难表达目标蛋白的突变体筛选。 例如，所有直系同源物或同一家族的成员，或在一次实验中检测单个靶标的一组突变体的表达效果。该方案还可与共表达载体（仅带有一个标签蛋白）联用，以实现蛋白质复合物的下拉及初步表征，随后通过更深入的生物物理分析验证复合物的正确形成及其化学计量比³³纯化的蛋白量有时适用于微量检测（功能检测、蛋白质-DNA结合实验）³⁴ 或蛋白质-蛋白质相互作用实验）。高通量表达筛选策略具有多项优势：（i）可在单次实验中测试大量靶标或大量变量；（ii）批次间变异较小；（iii）使用深孔板进行小规模操作简便易行；（iv）易于放大并具有良好的可重复性；（v）具备自动化潜力；（vi）样品追踪与处理简便（无需对单个管子进行标记，使用板式格式相比单独操作试管在克隆混合或更换过程中可减少错误）。

尽管实验方案部分未予讨论，但实验准备过程中有几个重要事项需简要说明。有关更详细的讨论，请参见我们之前的发表文献²⁴为了获得最高效率，建立一个适用于高通量克隆的系统将非常有益，可简化大量目标基因的亚克隆过程。在VENOMICS项目的初始阶段，我们采用了通用的Gateway重组系统。²⁵ 可实现每周数百个克隆的任意目的载体亚克隆。Gateway 重组克隆的相关实验方案可在 Invitrogen 网站获取。其他高通量克隆方法包括连接酶无关克隆（LIC）^35,36 无限制性克隆（RF克隆）³⁷有多种方法可获得用于表达的目的基因，包括通过PCR从模板DNA中扩增、从入门克隆文库中获取，或直接合成基因，后者是VENOMICS项目所采用的策略。合成基因可在基因两端带有重组位点进行订购，且基因合成可方便地对目的基因序列进行密码子优化（以排除稀有密码子） E. coli 密码子）。这一步是推荐的，但并非必需。对于未进行密码子优化且含有大量稀有密码子的靶基因，建议使用Rosetta 2 (DE3) pLysS菌株（该菌株携带在大肠杆菌中通常表达水平较低的稀有密码子对应的tRNA） E. coli）可能比 BL21 (DE3) pLysS 更为适用。尽管已有可限制细胞质正常还原环境中二硫键还原的菌株，但在我们的实验中，这些菌株的效果不如常规菌株理想 E. coli 菌株¹¹.

为了回收可溶性融合蛋白并定量其产量，需从测试表达培养物中进行分析级亲和纯化。可获得关于在每升培养液中表达量为 0.1 – 100 mg 范围内的融合蛋白可溶性产量的定量数据。如果目标蛋白不具可溶性，可在尝试不同融合伴侣之前，先测试替代的表达条件和诱导温度、菌株或培养基。对于富含二硫键蛋白的可溶性表达，我们此前对融合伴侣的效果排序如下：DsbC > DsbA > GST > MBP > TRX > HIS-tag，适用于胞质表达¹¹。周质表达是另一种可能有助于富含二硫键目标蛋白成功折叠的策略。周质环境的还原性弱于胞质，并含有有助于二硫键形成的有用氧化还原伴侣分子。DsbC、DsbA 和 MBP 蛋白通常通过其周质信号序列被定位至周质空间。这为利用这些标签将富含二硫键的目标蛋白靶向输送至周质空间以促进其正确折叠提供了机会。对于难以处理的目标蛋白，下一步可能是从包涵体中纯化不溶性的 HIS 标签目标蛋白，随后进行溶解和复性（此过程超出本方案的范围，此处不予讨论³⁹）。对于仅含一个或两个二硫键的目标蛋白，该过程可能相对简单，但随着二硫键数量的增加，复性难度也逐渐升高。此外，特别是对于含有四个或更多二硫键的蛋白质和多肽，尝试更复杂的表达系统（如酵母、昆虫或哺乳动物表达系统）可能是有益的。

随着微型化和自动化技术的进步，高通量电生理芯片实验室技术²⁸无疑将成为未来功能分析的发展方向。我们预计，对于大多数应用而言（可能结构研究除外），这将消除对大规模培养的需求。小规模培养不仅可用于筛选表达条件，还能为这些微型化的功能检测提供足够量的样品。并行生产多个目标蛋白并获得足量样品以进行功能表征的能力，将降低培养和使用此类平台的成本，使重组蛋白的表达与表征更加经济高效且节省时间。

本文所述方案已应用于FP7欧洲VENOMICS项目的初始阶段，用于表达富含二硫键的多肽和蛋白质。动物毒液是生物活性多肽的优良来源，这些多肽通常具有重要的药理学潜力。然而，由于其复杂的二硫键连接模式和分子量较小，这类多肽的生产面临挑战。通过使用本文所述的高通量平台，VENOMICS项目旨在构建一个包含10,000种新型毒液多肽的文库，以重现自然界中观察到的多样性。该文库将用于鉴定具有潜在药理学或治疗应用价值的富含二硫键的多肽，目标是开发新药。目前，该平台正被用于对VENOMICS项目中新方案的性能进行基准测试和验证。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tecan Freedom EVO 200 液体处理机器人	Tecan Group Ltd.		方案可适用于任何带有真空歧管的液体处理机器人。 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96 孔 PCR （PCR96） 板	Greiner Bio-One	652270	http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB 培养基			，高压灭菌，用于无菌。
抗生素储备			卡那霉素 （50 mg/ml）、氨苄青霉素 （100 mg/ml）、氯霉素（乙醇中 34 mg/ml），储存库存 &20 &°C. 使用 1：1,000 稀释液。
深孔 96 （DW96） 板，体积容量为 2.42 ml	Greiner Bio-One	780270	高压灭菌无菌。 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
表达载体			用于目标构建体的表达。Store at −20 摄氏度。
BL21 （DE3） pLysS 感受态细胞			或用户选择的替代 E. coli 表达菌株。Store at −80 &°C。
Breathseal 透气胶膜	Greiner Bio-One	676050
PCR 机，带 96 孔板块			用于 SDS-PAGE/卡尺样品的转化、热休克和沸腾。
24 孔无菌组织培养板	Greiner Bio-One	662165	http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-琼脂			，高压灭菌。
200 亩;l 无菌一次性吸头	Tecan Group Ltd.	30 038 617	http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron 振荡培养箱，3 mm 投掷	Infors	AJ103	非必要，也可以使用常规振荡培养箱。 http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate 培养箱
微量滴定板			对于甘油储备液和洗脱，使用纯化方案 B。
甘油			用于制备甘油原液。
200 亩;l 一次性吸头	Tecan Group Ltd.	30 038 616	http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
胶带垫	Qiagen	19570	http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl	Orapi 组		或等效的微生物消毒剂。
ZYP-5052 培养基			成分配方见 表 1。
深孔 24 （DW24） 板，容量 10 ml	Whatman	7701-5102	高压灭菌。 http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
平底透明微量滴定板	Greiner Bio-One	655101	用于吸光度读数。
> http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/ 板读数分光光度计			自选。用于测量培养物的 OD600。
带转子的离心机，用于深孔板			适用于 3,800 x g。
溶菌酶			50 mg/ml 水溶液。Store at −20 摄氏度。
咪唑 ACS 级	Merck	IX0005-1	必须使用高质量等级的咪唑，以免干扰 A280 读数来计算蛋白质产量。
裂解缓冲液			50 mM Tris、300 mM NaCl、10 mM 咪唑 pH 8，含有 0.25 mg/ml 溶菌酶（或您首选的缓冲液）。每次从库存中添加溶菌酶，不要长时间储存。
水浴
板超声仪（超声波处理器 XL，适用于深孔板）	Misonix Inc.		不是必需的。单独的溶菌酶通常足以进行几乎完全的裂解。
DNase			2 mg/ml 水原液，过滤灭菌。将等分试样储存在 −20 摄氏度。
硫酸镁 （MgSO4）			2 M 水原液，高压灭菌。
SDS-PAGE 或 Caliper 样品缓冲液
结合缓冲液			50 mM Tris、300 mM NaCl、10 mM 咪唑 pH 8（或您首选的缓冲液）。储存在 4 °C 下。
洗涤缓冲液			50 mM Tris、300 mM NaCl、50 mM 咪唑 pH 8（或您首选的缓冲液）。储存在 4 °C 下。
洗脱缓冲液			50 mM Tris、300 mM NaCl、250 mM 咪唑 pH 8（或您首选的缓冲液）。储存在 4 °C 下。
96 孔接收器/过滤板 20 µm，1.8 ml 容量	Macherey-Nagel	740686.4	http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl 一次性大口径刀尖	Tecan Group Ltd.	30 050 348	http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 FF 填料	GE Healthcare	17-5318-02	用于纯化靶标融合蛋白。储存在 4 °C。使用前洗涤并平衡。 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
烟草蚀刻病毒 （TEV） 蛋白酶			可选，用于切割。2 mg/ml，储存缓冲液中不含还原剂。Store at −80 &°C。
96 孔 0.22 µm 滤板	Millipore	MSGV N22 10	可选。过滤裂解后的可溶性组分. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/斑点印迹设备或卡尺 Labchip GXII 设备			电泳仪和凝胶类型的选择由用户选择的自由裁量权。
分光光度计和比色皿用于			测量 280 nm 处的吸光度 （A280） 以计算可溶性蛋白质的产量。如果在 Caliper 上进行分析，则不需要。
ZipTip 移液器吸头	Millipore		可选。ZipTip 的类型由用户自行决定。C4 树脂应用于较大的蛋白质，而肽 C18 可能更好。在进一步质量控制之前，也可以使用样品脱盐的替代方法来净化样品。 http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
材料按照"方案"部分所需的顺序列出。除非另有说明，否则试剂可以在室温下储存。作者的参考编号提供了首选的材料选择，但等效产品也可能是合适的。对于品牌不会影响实验结果的试剂，省略了公司详细信息。