应用视黄酸从小鼠原代成骨细胞获得骨细胞培养

摘要

用视黄酸处理原代小鼠成骨细胞可获得一群形态和分子特征均呈均一性的分支状骨细胞。该方法克服了在培养中获取和维持原代骨细胞的困难，且有利于研究来自转基因模型的细胞。 

摘要

骨研究人员群体普遍了解骨细胞培养的必要性；原代骨细胞的分离具有难度且获得的细胞数量较少。因此，目前最常用的细胞体系是类骨细胞的MLO-Y4细胞系。

本文所述方法涉及使用视黄酸诱导生成具有树突状形态和分子特征的均一性骨细胞群体。

从小鼠颅骨中分离成骨细胞后，将全反式维甲酸（ATRA）加入细胞培养基中，并每天在倒置显微镜下对细胞进行观察。处理2天后即可观察到初步的形态学变化，通常在5天内分化完成，表现为树突样结构逐步形成、丧失产生细胞外基质的能力、成骨细胞标志物表达下调以及骨细胞特异性分子表达上调。

由于原代细胞具有内在的变异性，需要每天进行细胞监测，且该方案只需极少调整即可适用于来自不同小鼠品系的细胞，并可用于转基因模型。

该方法易于操作，无需特殊仪器，具有高度可重复性，且能快速生成完全无细胞外基质的成熟骨细胞群体，从而可将这些细胞用于无限多样的生物学应用。

引言

骨细胞是骨骼中最丰富的细胞类型，属于终末分化的高度分支状细胞，深藏于骨骼内部。成熟骨细胞的胞体位于骨陷窝内，形态多样：在皮质骨中常见具有细长胞体的骨细胞，而在松质骨中则以圆形骨细胞更为常见¹。骨细胞胞体发出分支状树突，延伸至称为骨小管的微细通道中，形成复杂的网络结构，不仅与其他骨细胞建立多处连接，还与其它骨细胞类型、骨髓、血管以及相关的周细胞相接触。骨陷窝和骨小管内含有组织间液，通过这一液体环境，骨细胞最终与循环系统相连通，因此它们不仅能影响局部生理过程，也能参与调控全身性事件；反之，其自身行为亦可受到局部和全身性变化的调节²。

由于多项技术进步，例如组织和细胞特异性转基因动物的构建、高分辨率显微镜技术的应用以及高通量分子筛选方法的使用，骨细胞的研究近年来迅速发展^3,4然而，对这些细胞的认识仍不完整，主要原因是合适的 体外 模型。事实上，由于骨细胞位于深层组织，且作为高度分化的细胞类型增殖能力极低，因此在体外培养中一直难以获取和维持。

多年来，已开发出多种方法用于分离原代骨细胞^5-7，尽管它们通常产生的细胞产量较低，且存在即使少量污染的成纤维细胞也会迅速过度生长并覆盖骨细胞的风险⁸因此，大多数实验 体外 迄今为止，已对成熟的骨细胞系 MLO-Y4 开展了大量研究工作 ....

方案

所有动物实验均根据现行的国家和欧洲关于用于科学目的动物保护的法规进行，并经米兰大学伦理委员会审查和批准。

1. 原代成骨细胞的分离

该方法经微小修改后，遵循 Dodig 等人et al¹⁴ 所描述的实验步骤。

1. 通过向 HBSS 培养基（Hanks 平衡盐溶液，不含钙、 镁或 酚红）中添加 0.1% Collagenase P 和 0.05% 胰蛋白酶（从 2.5% 胰蛋白酶 10X 溶液开始，不含酚红）来制备消化液。
2. 使用 3–4 日龄的小鼠（该操作可适用于至少 1 只小鼠）。
3. 通过断头法处死小鼠。用 70% 乙醇喷洒头部，并置于冰上。用镊子和解剖/手术剪去除皮肤和肌肉层。
4. 小心取下顶骨，并沿矢状缝将其分为两半。确保骨骼无残留缝线及任何附着组织，将单个骨片放入含有 HBSS 培养基的培养板中，直至操作完成。
5. 弃去 HBSS，向每孔中加入消化液，在 37 °C 下孵育 15 分钟。
6. 弃去上清液。
7. 再次加入消化液，在 37 °C 下孵育 15 分钟。
8. 此次保留上清液，并将其转移至补充有 10% FBS（胎牛血清）和 1% 链霉素/青霉素的 α-MEM 培养基（最小必需培养....

结果

结果来自5到10次独立实验。

细胞形态

经AA/GP处理的原代细胞大多具有铺路石样的特征，这是成熟成骨细胞的典型形态。其间散在分布着分支状细胞（如图1A中红色箭头所示），这些细胞可能代表部分骨细胞。

经ATRA处理后，细胞迅速开始出现突起，通常在2天后即可观察到。如图1B所示，具有突起的细胞需要空间以伸展其树突。随着ATRA处理时间的延长，突起的数量和复杂性逐渐增加，见图1C和图1D。用罗丹明标记的鬼笔环肽对丝状肌动蛋白进行染色，可清晰显示被鬼笔环肽标记的细胞突起，见图2。

基质生成

原代成骨细胞可产生大量钙化基质，该基质在细胞层叠并积聚于细胞之间，可通过茜素红染色进行观察，图3A

讨论

近年来，骨细胞已成为骨骼中最核心的细胞。研究进展正逐步揭示出许多此前未被预料或未经证实的骨细胞特性，这些特性对于设计治疗多种骨骼疾病的新疗法具有重要价值。然而，由于体外（in vitro）模型资源有限，骨细胞生物学的研究长期受限，此前曾长期使用成骨细胞作为替代细胞，直到骨细胞样细胞系 MLO-Y4 问世才有所改善。最近，同一研究团队又引入了一种条件性永生化细胞系¹⁶，该细胞系可分化为表达硬化素（sclerostin）和 FGF23 的有突起的晚期骨细胞。尽管这些细胞系具有极高的研究价值无可置疑，但众所周知，原代细胞更接近体内（in vivo）的真实状态，并且能够从转基因动物中获取原代骨细胞，从而对特定分子通路进行功能研究。

原代骨细胞的分离与培养最初源于鸡骨^5,6 ，随后扩展至大鼠和小鼠骨骼^17,7，该方法极具应用价值，但每次分离所获得的细胞数量较少，且细胞纯度在很大程度上依赖于操作者的经验。因此，目前仅有少数实验室采用该技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶 P	Roche Applied Science	11213857001
胰蛋白酶	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	使用前于 37 °C 预热
α-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	使用前于 37 °C 预热
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F4135
链霉素/青霉素	Sigma-Aldrich	P4333
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4403
甘油-2-磷酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	G9422
全反式维甲酸	Sigma-Aldrich	R2625	避免 ATRA 暴露于光
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	溶于 PBS 并在使用前过滤。务必在化学通风橱中操作。
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	可加入二抗中
茜素红	Sigma-Aldrich	A5533
詹纳斯绿	Sigma-Aldrich	201677
高氯酸	Sigma-Aldrich	176745	谨慎使用（建议佩戴皮肤和眼部防护装备）
盐酸	Sigma-Aldrich	320331	谨慎使用（建议佩戴皮肤和眼部防护装备）
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
Fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
经济型镊子 #7，0.40 × 0.5 mm 尖端	World Precision Instruments	501981
经济型镊子 #4，0.40 × 0.45 mm 尖端	World Precision Instruments	501978
解剖剪刀，直头，10 cm 弯型	World Precision Instruments	14394
手术剪刀，14 cm，直头，不锈钢	World Precision Instruments	501218
培养瓶	Corning	430168
多孔板	Corning	3335
Thermanox 盖玻片	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
显微镜	Zeiss Apotome
分光光度计	Safas Xenius