用视黄酸处理原代小鼠成骨细胞可获得一群形态和分子特征均呈均一性的分支状骨细胞。该方法克服了在培养中获取和维持原代骨细胞的困难，且有利于研究来自转基因模型的细胞。
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摘要
摘要
骨研究人员群体普遍了解骨细胞培养的必要性；原代骨细胞的分离具有难度且获得的细胞数量较少。因此，目前最常用的细胞体系是类骨细胞的MLO-Y4细胞系。
本文所述方法涉及使用视黄酸诱导生成具有树突状形态和分子特征的均一性骨细胞群体。
从小鼠颅骨中分离成骨细胞后，将全反式维甲酸（ATRA）加入细胞培养基中，并每天在倒置显微镜下对细胞进行观察。处理2天后即可观察到初步的形态学变化，通常在5天内分化完成，表现为树突样结构逐步形成、丧失产生细胞外基质的能力、成骨细胞标志物表达下调以及骨细胞特异性分子表达上调。
由于原代细胞具有内在的变异性，需要每天进行细胞监测，且该方案只需极少调整即可适用于来自不同小鼠品系的细胞，并可用于转基因模型。
该方法易于操作，无需特殊仪器，具有高度可重复性，且能快速生成完全无细胞外基质的成熟骨细胞群体，从而可将这些细胞用于无限多样的生物学应用。
引言
骨细胞是骨骼中最丰富的细胞类型，属于终末分化的高度分支状细胞，深藏于骨骼内部。成熟骨细胞的胞体位于骨陷窝内，形态多样：在皮质骨中常见具有细长胞体的骨细胞，而在松质骨中则以圆形骨细胞更为常见1。骨细胞胞体发出分支状树突，延伸至称为骨小管的微细通道中，形成复杂的网络结构，不仅与其他骨细胞建立多处连接，还与其它骨细胞类型、骨髓、血管以及相关的周细胞相接触。骨陷窝和骨小管内含有组织间液，通过这一液体环境，骨细胞最终与循环系统相连通，因此它们不仅能影响局部生理过程，也能参与调控全身性事件；反之，其自身行为亦可受到局部和全身性变化的调节2。
由于多项技术进步，例如组织和细胞特异性转基因动物的构建、高分辨率显微镜技术的应用以及高通量分子筛选方法的使用，骨细胞的研究近年来迅速发展3,4然而，对这些细胞的认识仍不完整，主要原因是合适的 体外 模型。事实上，由于骨细胞位于深层组织，且作为高度分化的细胞类型增殖能力极低，因此在体外培养中一直难以获取和维持。
多年来，已开发出多种方法用于分离原代骨细胞5-7，尽管它们通常产生的细胞产量较低，且存在即使少量污染的成纤维细胞也会迅速过度生长并覆盖骨细胞的风险8因此，大多数实验 体外 迄今为止，已对成熟的骨细胞系 MLO-Y4 开展了大量研究工作 9.
附加的 体外 这些方法可能有助于增强对这些细胞的研究可能性，并改善对骨细胞生物学及病理生理学的分析。为了被广泛采用，这些方法应易于重复，且不需要特殊仪器或过长时间即可实现细胞成熟。尤为重要的是，若这些方法适用于原代细胞，则可充分利用转基因动物的优势。 我们最近描述了用视黄酸处理成骨细胞系MC3T3-E1及原代成骨细胞可诱导其快速发生表型转变，进而形成一群形态和分子特征均类似于骨细胞的分支状细胞。10.
全反式维甲酸（ATRA）是维生素A的一种活性代谢产物，可通过结合核内维甲酸受体（RARs）来调控基因转录。RARs与类视黄醇X受体（RXRs）形成异源二聚体后结合DNA，最终调节维甲酸（RA）应答靶基因的表达11。研究表明，ATRA可调控多种细胞类型的分化与成熟，其中包括其他具有分支结构的细胞，如神经元细胞12和足细胞13。
本文所述方法基于将全反式维甲酸（ATRA）添加至原代成骨细胞。为达到有效作用，必须在特定密度接种的细胞达到精确的成熟阶段时加入ATRA；根据我们的经验，这些条件对于实现成骨细胞向骨细胞的表型转换至关重要。
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方案
所有动物实验均根据现行的国家和欧洲关于用于科学目的动物保护的法规进行，并经米兰大学伦理委员会审查和批准。
1. 原代成骨细胞的分离
该方法经微小修改后，遵循 Dodig 等人et al14 所描述的实验步骤。
- 通过向 HBSS 培养基（Hanks 平衡盐溶液，不含钙、 镁或 酚红）中添加 0.1% Collagenase P 和 0.05% 胰蛋白酶（从 2.5% 胰蛋白酶 10X 溶液开始，不含酚红）来制备消化液。
- 使用 3–4 日龄的小鼠（该操作可适用于至少 1 只小鼠）。
- 通过断头法处死小鼠。用 70% 乙醇喷洒头部，并置于冰上。用镊子和解剖/手术剪去除皮肤和肌肉层。
- 小心取下顶骨，并沿矢状缝将其分为两半。确保骨骼无残留缝线及任何附着组织，将单个骨片放入含有 HBSS 培养基的培养板中，直至操作完成。
- 弃去 HBSS，向每孔中加入消化液，在 37 °C 下孵育 15 分钟。
- 弃去上清液。
- 再次加入消化液，在 37 °C 下孵育 15 分钟。
- 此次保留上清液，并将其转移至补充有 10% FBS（胎牛血清）和 1% 链霉素/青霉素的 α-MEM 培养基（最小必需培养基）中。
- 重复步骤 1.7 和 1.8 共 2 次。
- 合并三次收集的细胞悬液，以 425 ×g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，加入 3 ml 含补充物的 α-MEM 重悬细胞沉淀，并转移至 25 cm2 培养瓶中。
- 24 小时后更换培养基，以去除碎片和死细胞。
- 向 α-MEM 培养基中添加 50 µg/ml 抗坏血酸（AA）和 3 mM 甘油-2-磷酸二钠盐水合物（GP）。
- 此后每隔一天更换一次培养基（α-MEM 加 AA/GP）。
2. ATRA 实验方案
- 在避光环境中进行所有全反式维甲酸（ATRA）实验，以防止其失活。
- 在HBSS培养基中配制1X胰蛋白酶溶液，并于37 °C保存备用。
- 从亚融合细胞中移除培养基，并用HBSS小心洗涤。
- 加入1 ml胰蛋白酶，轻轻旋转培养瓶使所有细胞被胰蛋白酶覆盖，于37 °C孵育3分钟。
- 在倒置显微镜下观察细胞的实际脱落情况。
- 加入3 ml α-MEM培养基以灭活胰蛋白酶。
- 回收细胞，在425 g下离心15分钟。
- 将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。
- 在血细胞计数板计数室内滴加一滴样品，静置数分钟使其沉降 并统计细胞数量。
- 将细胞置于25 cm²培养瓶中2 密度为10,000个细胞/cm²的培养瓶2 使用含AA/GP的α-MEM培养基。需注意细胞密度对细胞过程及细胞间接触的最适发育具有重要影响。起始密度高于10,000个细胞/cm²时2 影响细胞突起的正常发育，但细胞数量过低会导致细胞过早死亡，原因是缺乏细胞间接触。
- 添加 每24小时向培养基中添加5 µM ATRA。
- 每天观察细胞以评估形态：通常在48小时后可观察到形态学变化。若在最初24-48小时后细胞仍在增殖，则按上述密度重新接种。培养4-5天后可获得由成熟骨细胞组成的均一细胞群体。根据实验需求，可在培养后的任意时间点使用细胞，最长至12-15天。
- 当细胞接种于其他载体（如盖玻片或孔板）时，需确保上述密度并持续每24小时添加一次ATRA，直至使用。细胞转移至新载体后，须至少静置培养24小时使其充分贴壁，再进行实验。
3. 免疫染色
- 进行免疫染色时，将细胞接种在盖玻片上，并遵循已建立的实验方法（例如参见Burry15）。
- 例如，进行间接免疫荧光染色时，用4%多聚甲醛或冷丙酮固定，然后在湿盒中室温下依次与一抗孵育1小时，再在避光、湿盒中室温下与荧光标记的二抗孵育30分钟。
- 使用DAPI或其类似物进行细胞核复染，并用抗荧光淬灭封片剂封片。
4. 茜素红染色与提取
- 将细胞接种在盖玻片上。
- 将盖玻片浸入70%乙醇中固定细胞，持续10分钟。
- 在细胞上滴加茜素红染色液（1 mg/ml，pH 5.5），覆盖30分钟。
- 用自来水冲洗盖玻片，滴加甘油于载玻片上封片，并使用正置显微镜在10倍和20倍放大下采集图像。
- 完成上述步骤后，将载玻片浸入自来水中回收盖玻片。
- 将每片盖玻片放入孔板的孔中。
- 加入60%高氯酸（用量需足以完全覆盖细胞），在4 °C条件下轻柔振荡过夜。
- 使用分光光度法在450 nm波长下测定上清液的光密度。
- 为根据细胞数量进行数据归一化，加入詹纳斯绿（0.2% PBS溶液）覆盖细胞样本，孵育10分钟。
- 用超纯水小心冲洗。
- 加入0.5 N HCl（用量需足以覆盖所有细胞），手动轻轻振荡数秒。
- 使用分光光度法在615 nm波长下测定吸光度。
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结果
结果来自5到10次独立实验。
细胞形态
经AA/GP处理的原代细胞大多具有铺路石样的特征，这是成熟成骨细胞的典型形态。其间散在分布着分支状细胞（如图1A中红色箭头所示），这些细胞可能代表部分骨细胞。
经ATRA处理后，细胞迅速开始出现突起，通常在2天后即可观察到。如图1B所示，具有突起的细胞需要空间以伸展其树突。随着ATRA处理时间的延长，突起的数量和复杂性逐渐增加，见图1C和图1D。用罗丹明标记的鬼笔环肽对丝状肌动蛋白进行染色，可清晰显示被鬼笔环肽标记的细胞突起，见图2。
基质生成
原代成骨细胞可产生大量钙化基质，该基质在细胞层叠并积聚于细胞之间，可通过茜素红染色进行观察，图3A
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讨论
近年来，骨细胞已成为骨骼中最核心的细胞。研究进展正逐步揭示出许多此前未被预料或未经证实的骨细胞特性，这些特性对于设计治疗多种骨骼疾病的新疗法具有重要价值。然而，由于体外（in vitro）模型资源有限，骨细胞生物学的研究长期受限，此前曾长期使用成骨细胞作为替代细胞，直到骨细胞样细胞系 MLO-Y4 问世才有所改善。最近，同一研究团队又引入了一种条件性永生化细胞系16，该细胞系可分化为表达硬化素（sclerostin）和 FGF23 的有突起的晚期骨细胞。尽管这些细胞系具有极高的研究价值无可置疑，但众所周知，原代细胞更接近体内（in vivo）的真实状态，并且能够从转基因动物中获取原代骨细胞，从而对特定分子通路进行功能研究。
原代骨细胞的分离与培养最初源于鸡骨5,6 ，随后扩展至大鼠和小鼠骨骼17,7，该方法极具应用价值，但每次分离所获得的细胞数量较少，且细胞纯度在很大程度上依赖于操作者的经验。因此，目前仅有少数实验室采用该技术。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
资金由“Progetto a concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010”项目提供给 MD，以及 Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus，米兰
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶 P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | 使用前于 37 °C 预热 |
| α-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | 使用前于 37 °C 预热 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 链霉素/青霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| 甘油-2-磷酸二钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| 全反式维甲酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | 避免 ATRA 暴露于光 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 溶于 PBS 并在使用前过滤。务必在化学通风橱中操作。 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | 可加入二抗中 |
| 茜素红 | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| 詹纳斯绿 | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| 高氯酸 | Sigma-Aldrich | 176745 | 谨慎使用（建议佩戴皮肤和眼部防护装备） |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 320331 | 谨慎使用（建议佩戴皮肤和眼部防护装备） |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| 经济型镊子 #7，0.40 × 0.5 mm 尖端 | World Precision Instruments | 501981 | |
| 经济型镊子 #4，0.40 × 0.45 mm 尖端 | World Precision Instruments | 501978 | |
| 解剖剪刀，直头，10 cm 弯型 | World Precision Instruments | 14394 | |
| 手术剪刀，14 cm，直头，不锈钢 | World Precision Instruments | 501218 | |
| 培养瓶 | Corning | 430168 | |
| 多孔板 | Corning | 3335 | |
| Thermanox 盖玻片 | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| 显微镜 | Zeiss Apotome | ||
| 分光光度计 | Safas Xenius |
参考文献
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