使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

摘要

我们介绍了一种通过雾化吸入脂多糖激发中性粒细胞性肺部炎症以模拟急性肺损伤的方法。此外，还描述了肺隔离、气管插管和支气管肺泡灌洗的基本外科技术。

摘要

急性肺损伤（ALI）是一种以肺泡中性粒细胞浸润为特征的严重疾病，目前治疗手段有限且死亡率高。ALI 的实验模型对于加深我们对疾病发病机制的理解至关重要。来源于革兰氏阳性菌的脂多糖（LPS）可在小鼠气道和肺实质中诱导中性粒细胞炎症。然而，将 LPS 等化合物有效递送至肺部仍存在困难。本文所述方法通过雾化铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LPS 对小鼠进行攻击，实现肺部递送。将溶解的 LPS 通过连接压缩空气的雾化器雾化，使小鼠在 Plexiglas 盒中暴露于持续流动的 LPS 气溶胶中 10 分钟，随后在气溶胶停止后继续停留 2 分钟以完成适应。之后进行气管插管，继之以支气管肺泡灌洗，并进行甲醛灌注，从而实现对无菌性肺部炎症的表征。雾化 LPS 可诱导以肺泡中性粒细胞增多为特征的肺部炎症，该现象可通过支气管肺泡灌洗和组织学评估检测到。该技术仅需少量设备、成本低廉，且对操作人员的培训和经验要求极低。因此，该暴露系统可在任何实验室常规开展，有助于进一步加深对肺部病理机制的理解。

引言

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分¹。LPS攻击是急性肺损伤的成熟研究模型，急性肺损伤是一种以急性中性粒细胞炎症和水肿为特征的综合征²。此外，肺部中性粒细胞增多也是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的典型特征³，在人体中使用LPS攻击已被用于模拟COPD急性加重⁴。因此，LPS暴露的实验模型具有临床相关性，是研究人类病理机制的重要工具。

本文所述气溶胶化LPS肺部递送的目的是在传导气道和呼吸气道中引发中性粒细胞炎症反应，同时避免全身性影响。此前已有多种LPS激发技术的报道。静脉注射LPS是最常用的给药途径。尽管该方法操作简便，但其主要损伤靶点为血管内皮，随后因中性粒细胞迁移至肺组织而继发性破坏肺上皮。静脉给药还会诱发全身性炎症²，这可能使动物模型的临床表现复杂化。相比之下，气管内给药则未观察到全身性炎症反应。然而，该技术操作繁琐，需要使用麻醉剂并具备相当的操作经验^5,6。此外，通过该途径给药时，LPS在肺部的沉积依赖于呼吸运动⁷。因此，为实施气管内给药所需的麻醉深度会影响肺部沉积效果，并可能导致气道内沉积量的不一致。相比之下，气溶胶化LPS的肺部递送所需培训极少，可轻松应用于大量动物，且个体间差异极小或无差异^5,8。最近一项研究证实，就沉积效果而言，气溶胶递送优于气管内给药途径，并且在此模型中，更接近生理相关剂量的LPS即可诱导中性粒细胞炎症反应⁸。

既往研究表明，气溶胶化的Psuedomonas aeruginosa LPS刺激可在气道腔和肺实质（包括肺泡腔）引发显著的炎症反应^9,10。该炎症以中性粒细胞占主导并伴有肺水肿，因此可用于研究急性肺损伤的发病机制，并进一步了解参与疾病病理过程的机制。

方案

动物实验已获北斯德哥尔摩动物福利伦理委员会批准。实验操作均依照瑞典法律执行。

1. 生成LPS气溶胶

1. 将 0.5 g 纯化的 P. aeruginosa LPS 溶于 50 ml 无菌生理盐水中，轻轻振荡以确认完全溶解。取 1 ml 溶解后的 LPS 加入 9 ml 无菌生理盐水中稀释，终浓度为 1 mg/ml。用铝箔包裹避光，并于 -20 °C 保存。
2. 在室温下避光解冻溶解的 LPS，使用前充分混匀。
3. 在通风良好的二级生物安全柜中，将红色进气管插入雾化器，并通过制造商提供的管路将雾化器连接至加压的室内空气源（参见 图1 中实验装置示意图）。
   注意：暴露操作过程中应穿戴适当的个人防护装备，包括带有颗粒物过滤器的可重复使用半面罩呼吸器、护目镜、手套和防护服。

图 1：用于生成气溶胶的实验装置示意图。 雾化器的入口连接至气源。雾化器的出口首先通过一根 15.9 mm 的管子和一个空气过滤器连接至流量计，并将气源 调节至 2 kbar 压力下 5.0 L/min。随后，出口连接至一个配有可拆卸盖子和 5 mm 孔洞的有机玻璃箱，以防止压力积聚。

4. 将雾化器的出口通过空气过滤器连接至质量流量计。将质量流量计连接至电源。
5. 调节空气供应 至 5 L/min，压力保持在 1.0–2.0 bar。
6. 拆下质量流量计并断开空气供应。
7. 将雾化器的出口连接至一根 15.9 mm 的导管，该导管分为两支，分别连接两个尺寸为 150 × 163 × 205 mm 的有机玻璃箱，箱体配备可拆卸盖子。每个箱子在进气口对面的侧壁上应设有一个 5 mm 的小孔，以防止压力积聚。
8. 将最多 5 只小鼠放入每个有机玻璃箱中，并盖上盖子。
9. 打开雾化器，向其内插管中加入至少 4 ml 溶解于无菌 生理盐水中的 LPS 或仅加入载体（无菌 生理盐水）；液体体积不得超过 8 ml。重新将进气口连接至空气供应。
10. 使气溶胶流入密闭的有机玻璃箱中持续 10 分钟。持续监测动物状态，并确保空气供应与雾化器进气口连接紧密。
11. 断开空气供应。在盖子保持关闭的情况下，让动物在有机玻璃箱中继续停留 2 分钟。
12. 打开盖子，使气溶胶充分散去，然后将动物放回笼中。若动物体表潮湿，应将笼子置于低温加热垫上，以防低体温。
13. 在实验后的最初 30 分钟内持续监测动物，之后在最初的 6 小时内每 2 小时 监测一次 。动物在雾化过程中及之后应表现出正常的呼吸模式和活动行为。

2. 支气管肺泡灌洗 (BAL)

1. 在实验终点，根据所在机构兽医人员的建议，使用异氟烷对动物进行深度麻醉。 通过夹捏后肢足垫检查是否出现回缩反射，以确认麻醉深度足以进行重大手术。 用70%乙醇喷洒动物体表毛发进行消毒。
2. 使用剪刀切开腹腔，并切断主动脉以放血处死动物。在腹部放置一块组织块以吸收流出的血液。 
3. 安乐死后，用剪刀沿腹侧中线从前向后做一次切口以暴露胸腔。用镊子夹住胸骨前缘抬起肋骨，在最腹侧位置刺穿膈肌，注意避免损伤任何肺叶。沿前后方向做两个切口（在下颌下方汇合），打开肋腔。
4. 用镊子轻轻撑开肋骨，于喉部下方剪断气管。
5. 用镊子提起气管，剪断连接肺叶与胸腔的韧带，并轻轻牵拉脂肪组织和心脏组织，将肺组织取出。
6. 将一根聚乙烯导管（内径：0.58 mm；外径：0.965 mm）插入气管，并用丝线固定导管。
7. 用丝线结扎多叶肺（右肺的四个肺叶）。
8. 将23号针头插入聚乙烯导管，使用1 ml注射器缓慢注入250 µl冰冻无菌PBS至单个肺叶中。
9. 轻轻叩击肺组织30次，然后通过注射器回收灌洗液。重复操作一次，加入200 µl PBS（从单个肺叶中总共应回收约300 µl灌洗液，相对于总注入体积450 µl）。
10. 将支气管肺泡灌洗液（BALF）置于冰上保存，或立即进行细胞计数。使用Turk溶液染色后，用血细胞计数板对细胞进行计数¹¹。将细胞数乘以染色液的稀释倍数及血细胞计数板计数区域内的体积，计算总细胞数。
11. 按照其他文献所述方法，对经细胞离心涂片处理的细胞制备分类细胞计数¹¹。

3. 肺组织的福尔马林固定用于组织学评估

1. 取出多叶肺组织并在干冰上速冻，于 -80 °C 保存。
2. 将一个去除了活塞的 60 ml 注射器固定在金属支架上，向注射器内加入 10% 甲醛溶液，液面高度为实验台上方 20 cm，以提供 20 cm 的恒定压力。
3. 通过带阀门的塑料管将固定在气管上的 23 号针头连接至 60 ml 注射器，以控制甲醛溶液的流速。
4. 向肺叶内灌注甲醛溶液 5 分钟。断开针头连接，并在牵拉丝线以关闭气管、保持肺内压力的同时，将针头及聚乙烯管一并从气管中移除。
5. 将肺叶完全浸入甲醛溶液中，在 4 °C 下固定 24 小时。
6. 用 70% 乙醇对固定后的组织洗涤至少 3 次，每次不少于 20 分钟，随后按以下程序逐步脱水至二甲苯（每步 1 小时）：
   • 3 次 70% 乙醇
   • 3 次 95% 乙醇
   • 3 次 100% 乙醇
   • 3 次二甲苯
   • 1 次（液体）石蜡
7. 将脱水后的组织包埋于石蜡中，切为 4–5 µm 厚的切片，采用苏木精-伊红染色，以便进行组织学评估。

结果

对气溶胶化的 P. aeruginosa LPS 进行攻击通常会在气道腔和肺泡腔内引发显著的炎症反应，其特征是在早期和晚期时间点均以中性粒细胞为主。

雾化 LPS 诱导肺部中性粒细胞增多

C57BL/6by 和 BALB/c 小鼠暴露于气溶胶化的 P. aeruginosa 单独给予LPS或载体后，对BALF中的中性粒细胞进行计数。仅暴露于载体气溶胶的C57BL/6by小鼠，其BALF中的总细胞数通常约为或低于200,000个细胞，细胞组成中95–100%为单核细胞，仅含少量淋巴细胞（0.5–5%），BALF中无中性粒细胞。图2A-C). 经气溶胶LPS攻击的小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中总细胞数增加，通常 >6小时后为50万个细胞。24小时后细胞浸润仍处于较高水平。LPS暴露后，支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞谱转变为以中性粒细胞为主（占80–95%）。图2B 和 C).

讨论

雾化的脂多糖（LPS）可在气道中引发炎症反应，其特征为上皮下黏膜层、传导性气道周围间隙以及肺泡腔内出现中性粒细胞浸润。此外，支气管肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白含量升高，提示存在血浆渗漏，符合急性肺损伤的病理特征。由于LPS诱导的是无菌性炎症，该反应不依赖于适应性免疫应答，因此在模拟细菌感染的相关性方面存在一定局限性。然而，该技术可用于在排除适应性免疫应答干扰的情况下，解析炎症反应的具体机制。

尽管该方法简单且易于调整以回答不同的科学问题，但雾化器和管路的选择至关重要。使用不同于本文所述的进样口、雾化器和管路时，必须验证LPS的沉积情况及由此引发的中性粒细胞增多。此外，由于较不常见的小鼠品系对LPS的反应可能不同，应针对每种品系确定最佳LPS剂量。再者，气溶胶化LPS所引发的中性粒细胞炎症与经鼻内递送LPS所诱导的炎症程度相当，这一点已被其他研究者观察到^12,13。虽然鼻内给药操作简便，但该方法需要使用麻醉剂，并且可能将鼻腔内的微生物群带入肺部，因为鼻腔并非无菌环境，且该技术需要较大体积的载体溶液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纯化 Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		有害。建议进行纯化。可使用从其他细菌中提取的LPS。
Pari LC sprint star 雾化器	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI 质量流量计 4040	三糖铁琼脂（TSI）	4040	可使用供应商提供的替代产品。
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon 管	Sigma-Aldrich	Z685704	推荐品牌
带可拆卸盖子的有机玻璃盒	定制构建	N/A	150 × 163 × 205 毫米（侧面有一个 2 毫米的孔）。
3M 半面式可重复使用呼吸器	3M	7503	推荐品牌
3M 高级微粒过滤器（P100）	3M	2291	推荐品牌
剪刀	VWR	233-1104	可使用首选的剪刀。
镊子	VWR	232-1313	可使用首选的镊子。
Intramedic PE50 聚乙烯管	BD	427411	推荐品牌
Ethicon 2-0 Perma-hand 丝线	VWR	95056-992	推荐品牌
26 ½ 套管针			存在其他供应商。
1 ml BD滑动式针头注射器，非无菌	BD	301205	存在其他供应商。
60 ml BD Luer-Lok 注射器，非无菌，聚丙烯	BD	301035	存在其他供应商。
Fluka 苏木精-伊红	Sigma-Aldrich	3972	存在其他供应商。
Türk's 溶液	默克密理博	109277
台式离心机			存在其他制造商。
Cytospin 4 细胞离心涂片机	赛默飞世尔科技	A78300003	可以使用其他离心机。
HEMA-3 快速染色试剂盒	Fisher Scientific	23-123-869	存在其他染色试剂盒。
10% 中性缓冲福尔马林溶液	Sigma-Aldrich	HT501128	存在其他供应商。