使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

摘要

我们介绍了一种通过雾化吸入脂多糖激发中性粒细胞性肺部炎症以模拟急性肺损伤的方法。此外，还描述了肺隔离、气管插管和支气管肺泡灌洗的基本外科技术。

摘要

急性肺损伤（ALI）是一种以肺泡中性粒细胞浸润为特征的严重疾病，目前治疗手段有限且死亡率高。ALI 的实验模型对于加深我们对疾病发病机制的理解至关重要。来源于革兰氏阳性菌的脂多糖（LPS）可在小鼠气道和肺实质中诱导中性粒细胞炎症。然而，将 LPS 等化合物有效递送至肺部仍存在困难。本文所述方法通过雾化铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LPS 对小鼠进行攻击，实现肺部递送。将溶解的 LPS 通过连接压缩空气的雾化器雾化，使小鼠在 Plexiglas 盒中暴露于持续流动的 LPS 气溶胶中 10 分钟，随后在气溶胶停止后继续停留 2 分钟以完成适应。之后进行气管插管，继之以支气管肺泡灌洗，并进行甲醛灌注，从而实现对无菌性肺部炎症的表征。雾化 LPS 可诱导以肺泡中性粒细胞增多为特征的肺部炎症，该现象可通过支气管肺泡灌洗和组织学评估检测到。该技术仅需少量设备、成本低廉，且对操作人员的培训和经验要求极低。因此，该暴露系统可在任何实验室常规开展，有助于进一步加深对肺部病理机制的理解。

引言

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分¹。LPS攻击是急性肺损伤的成熟研究模型，急性肺损伤是一种以急性中性粒细胞炎症和水肿为特征的综合征²。此外，肺部中性粒细胞增多也是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的典型特征³，在人体中使用LPS攻击已被用于模拟COPD急性加重⁴。因此，LPS暴露的实验模型具有临床相关性，是研究人类病理机制的重要工具。

本文所述气溶胶化LPS肺部递送的目的是在传导气道和呼吸气道中引发中性粒细胞炎症反应，同时避免全身性影响。此前已有多种LPS激发技术的报道。静脉注射LPS是最常用的给药途径。尽管该方法操作简便，但其主要损伤靶点为血管内皮，随后因中性粒细胞迁移至肺组织而继发性破坏肺上皮。静脉给药还会诱发全身性炎症²，这可能使动物模型的临床表现复杂化。相比之下，气管内给药则未观察到全身性炎症反应。然而，该技术操作繁琐，需要使用麻醉剂并具备相当的操作经验^5,6。此外，通过该途径给药时，LPS在肺部的沉积依赖于呼吸运动⁷。因此，为实施气管内给药所需的麻醉深度会影响肺部沉积效果，并可能导致气道内沉积量的不一致。相比之下，气溶胶化LPS的肺部递送所需培训极少，可轻松应用于大量动物，且个体间差异极小或无差异^5,8。最近一项研究证实，就沉积效果而言，气溶胶递送优于气管内给药途径，并且在此模型中，更接近生理相关剂量的LPS即可诱导中性粒细胞炎症反应⁸。

既往研究表明，气溶胶化的Psuedomonas aeruginosa LPS刺激可在气道腔和肺实质（包括肺泡腔）引发显著的炎症反应^9,10。该炎症以中性粒细胞占主导并伴有肺水肿，因此可用于研究急性肺损伤的发病机制，并进一步了解参与疾病病理过程的机制。

方案

动物实验已获得北斯德哥尔摩动物福利伦理委员会的批准。实验操作均依照瑞典法律执行。

1. 生成LPS气溶胶

1. 将0.5 g纯化的P. aeruginosa LPS溶于50 ml无菌生理盐水中，轻轻搅拌并确认完全溶解。取1 ml溶解后的LPS加入9 ml无菌生理盐水中稀释，终浓度为1 mg/ml。用铝箔避光包裹，并于-20 °C保存。
2. 在室温下避光解冻溶解的LPS，使用前充分混匀。
3. 在通风的二级生物安全柜中，将红色进气管插入雾化器，并通过制造商提供的管路将雾化器连接至加压的室内空气源（参见图1中实验装置示意图）。
   警告：暴露操作过程中应佩戴适当的个人防护装备，包括带有颗粒过滤器的可重复使用半面罩呼吸器、护目镜、手套和防护服。

图1：用于生成气溶胶的实验装置示意图。 雾化器的进气口连接至气源。雾化器的出口首先通过一根15.9 mm的管子和一个空气过滤器连接至流量计，并将气源调节至2 kbar压力下5.0 L/min的流速。出口随后连接至一个配有可拆卸盖子和5 mm通气孔的有机玻璃箱，以防止压力积聚。

4. 通过空气过滤器将雾化器的出口连接至质量流量计。将质量流量计连接至电源。
5. 调节空气供应至 5 L/min，压力维持在 1.0–2.0 bar。
6. 移除质量流量计并断开空气供应。
7. 将雾化器的出口连接至一根 15.9 mm 的导管，该导管分为两支，分别连接至两个尺寸为 150 × 163 × 205 mm 的亚克力盒，盒上配有可拆卸盖子。每个盒子在与进气口相对的一侧应设有 5 mm 的小孔，以防止压力积聚。
8. 将最多 5 只小鼠放入每个亚克力盒中，并关闭盖子。
9. 打开雾化器，向其插入部分加入至少 4 ml 溶解于无菌生理盐水中的 LPS 或仅含载体（无菌生理盐水）；液体体积不得超过 8 ml。重新将进气口连接至空气供应。
10. 使气溶胶流入密闭的亚克力盒中持续 10 分钟。持续监测动物状态，并确保空气供应与雾化器进气口连接紧密。
11. 断开空气供应。在盖子保持关闭的状态下，让动物在亚克力盒中继续停留 2 分钟。
12. 打开盖子，使气溶胶充分散去，并将动物放回笼中。若动物体表潮湿，应将笼子置于低温加热垫上，以防低体温。
13. 在操作后的最初 30 分钟内持续监测动物，之后在前 6 小时内每 2 小时监测一次。动物在雾化过程中及之后应表现出正常的呼吸模式和活动行为。

2. 支气管肺泡灌洗 (BAL)

1. 在实验终点，根据所在机构兽医人员的建议，使用异氟烷对动物进行深度麻醉。通过夹捏后肢足垫检查是否存在回缩反射，以确认麻醉深度足以进行重大手术。用70%乙醇喷洒动物体表毛发进行消毒。
2. 使用剪刀打开腹腔，并切断主动脉以放血处死动物。在腹部放置一块组织材料以吸收流出的血液。
3. 安乐死后，用剪刀沿腹侧正中线做一次前后方向的切割，暴露胸腔。用镊子夹住胸骨前缘抬起肋骨，用剪刀在最腹侧位置刺破膈肌，注意避免损伤任何肺叶。再沿前后方向做两处切割（在下颌下方汇合），打开肋骨 cage。
4. 用镊子轻轻撑开肋骨，于喉部下方剪断气管。
5. 用镊子提起气管，剪断连接肺叶与胸腔的韧带，并轻轻牵拉脂肪组织和心脏组织，完整取出肺脏。
6. 将一根聚乙烯导管（内径：0.58 mm；外径：0.965 mm）插入气管，并用丝线固定导管。
7. 用丝线结扎多叶肺（右肺的四个肺叶）。
8. 将23号针头插入聚乙烯导管，使用1 ml注射器向单个肺叶缓慢注入250 µl冰上预冷的无菌PBS。
9. 轻轻敲击肺组织30次，然后通过注射器回收灌洗液。重复操作一次，加入200 µl PBS（从单个肺叶中总共应回收约300 µl PBS，初始总注入体积为450 µl）。
10. 将支气管肺泡灌洗液（BALF）置于冰上保存，或立即进行细胞计数。使用血细胞计数板和Turk溶液染色法对细胞进行计数¹¹。将计数所得细胞数乘以染色液的稀释倍数及血细胞计数板计数区域内的体积，计算总细胞数。
11. 按照其他文献所述方法，对经细胞离心涂片处理的细胞进行分类计数¹¹。

3. 用于组织学评估的肺组织福尔马林固定

1. 取出多叶肺组织，并在干冰上快速冷冻。于 -80 °C 保存。
2. 将一个去掉活塞的 60 ml 注射器固定在金属支架上。向注射器中加入 10% 福尔马林，液面高度距实验台面 20 cm，以维持 20 cm 的恒定压力。
3. 通过带阀门的塑料管，将固定在气管上的 23 号针头连接至该 60 ml 注射器，以控制福尔马林的流动。
4. 用福尔马林对肺叶进行 5 分钟的灌注。随后断开针头，同时牵拉丝线以闭合气管，并在取出针头和聚乙烯管时保持肺内压力。
5. 将肺叶完全浸入福尔马林中，在 4 °C 下固定 24 小时。
6. 用 70% 乙醇清洗固定后的组织三次，每次至少 20 分钟；然后按以下程序逐步脱水并转移至二甲苯（每步 1 小时）：
   • 3 次 70% 乙醇
   • 3 次 95% 乙醇
   • 3 次 100% 乙醇
   • 3 次二甲苯
   • 1 次（液态）石蜡
7. 将脱水后的组织包埋于石蜡中，切成 4–5 µm 的切片，并用苏木精和伊红染色，以便进行组织学评估。

结果

气溶胶化铜绿假单胞菌脂多糖（P. aeruginosa LPS）攻击通常会在气道腔和肺泡腔内引发显著的炎症反应，其特征是在早期和晚期时间点均以中性粒细胞为主。

雾化LPS诱导肺部中性粒细胞增多

将 C57BL/6by 和 BALB/c 小鼠暴露于气溶胶化的 P. aeruginosa LPS 或仅载体，随后在支气管肺泡灌洗液（BALF）中计数中性粒细胞。仅暴露于载体气溶胶的 C57BL/6by 小鼠，其 BALF 中的总细胞数通常约为或低于 200,000 个细胞，细胞组成中 95–100% 为单核细胞，仅含少量淋巴细胞（0.5–5%），BALF 中无中性粒细胞（图 2A–C）。经气溶胶化 LPS 激发的小鼠，其 BALF 中总细胞数增加，通常在 6 小时后超过 >500,000 个细胞，且细胞浸润水平在 24 小时后仍维持较高。LPS 暴露后，BALF 中的细胞谱转变为以中性粒细胞为主（80–95%）（图 2B 和 C）。...

讨论

雾化的脂多糖（LPS）可在气道中引发炎症反应，其特征为上皮下黏膜层、传导性气道周围间隙以及肺泡腔内出现中性粒细胞浸润。此外，支气管肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白含量升高，提示存在血浆渗漏，符合急性肺损伤的病理特征。由于LPS诱导的是无菌性炎症，该反应不依赖于适应性免疫应答，因此在模拟细菌感染的相关性方面存在一定局限性。然而，该技术可用于在排除适应性免疫应答干扰的情况下，解析炎症反应的具体机制。

尽管该方法简单且易于调整以回答不同的科学问题，但雾化器和管路的选择至关重要。使用不同于本文所述的进样口、雾化器和管路时，必须验证LPS的沉积情况及由此引发的中性粒细胞增多。此外，由于较不常见的小鼠品系对LPS的反应可能不同，应针对每种品系确定最佳LPS剂量。再者，气溶胶化LPS所引发的中性粒细胞炎症与经鼻内递送LPS所诱导的炎症程度相当，这一点已被其他研究者观察到^12,13。虽然鼻内给药操作简便，但该方法需要使用麻醉剂，并且可能将鼻腔内的微生物群带入肺部，因为鼻腔并非无菌环境，且该技术需要较大体积的载体溶液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纯化的 Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		有害。建议进行纯化。也可使用从其他细菌中纯化的LPS。
Pari LC sprint star 雾化器	PARI 呼吸设备公司	023G1250
TSI 质量流量计 4040	TSI	4040	可使用供应商提供的替代产品。
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon 管	Sigma-Aldrich	Z685704	推荐品牌。
带可拆卸盖子的有机玻璃箱	定制	N/A	150 × 163 × 205 mm（侧面有一个 2 mm 的孔）。
3M 半面罩可重复使用呼吸器	3M	7503	推荐品牌。
3M 高级颗粒物滤芯（P100）	3M	2291	推荐品牌。
剪刀	VWR	233-1104	可使用偏好的剪刀。
镊子	VWR	232-1313	可使用偏好的镊子。
Intramedic PE50 聚乙烯管	BD	427411	推荐品牌。
Ethicon 2-0 Perma-hand 丝线	VWR	95056-992	推荐品牌。
26 ½ 号针头			存在其他供应商。
1 ml BD 滑动接头注射器，非无菌	BD	301205	存在其他供应商。
60 ml BD 鲁尔锁注射器，非无菌，聚丙烯材质	BD	301035	存在其他供应商。
Fluka 苏木精-伊红染液	Sigma-Aldrich	3972	存在其他供应商。
Türk 溶液	Merck Millipore	109277
台式离心机			存在其他制造商。
Cytospin 4 细胞离心涂片机	Thermo Scientific	A78300003	可使用其他离心机。
HEMA-3 快速染色试剂盒	Fisher Scientific	23-123-869	存在其他染色试剂盒。
中性缓冲福尔马林溶液，10%	Sigma-Aldrich	HT501128	存在其他供应商。