通过背根电位记录法测量小鼠脊髓初级传入抑制 在体 内

摘要

GABA能突触前抑制是脊髓中一种强大的抑制机制，在脊髓神经网络对运动和感觉信号的整合中具有重要作用。可通过记录背根电位（DRP）来测量初级传入纤维去极化的基础过程。本文介绍了一种在小鼠中进行体内DRP记录的方法。

摘要

突触前抑制是脊髓中最强大的抑制机制之一。其生理学基础是由GABA能轴-轴突触介导的初级传入纤维去极化（初级传入去极化）。初级传入去极化的强度可通过记录背根处容积传导电位（背根电位，DRP）来评估。突触前抑制的病理变化在某些疼痛状态的异常中枢处理以及部分运动过度兴奋性疾病中具有关键作用。本文描述了一种记录DRP的方法。 体内 在小鼠中。本文介绍了在麻醉动物中制备脊髓背根并使用吸电极进行记录的操作步骤。该方法可用于测量GABA能背根电位（DRP），从而评估活体小鼠中的脊髓突触前抑制。结合转基因小鼠模型，DRP记录可作为研究疾病相关脊髓病理生理机制的有力工具。 体内 与……相比，记录具有多个优势 离体 离体脊髓标本 例如 同时记录或操控上脊髓网络并通过外周神经刺激诱导背根电位的可能性。

引言

突触前抑制是脊髓中最强大的抑制机制之一。它可抑制单突触兴奋性运动神经元中的兴奋性突触后电位（EPSPs），而不改变突触后膜电位及运动神经元的兴奋性^1-3。该机制的基础是GABA能轴-轴突触作用于感觉传入纤维的突触前末梢所引发的初级传入去极化（PAD）^4-7（另见图1a）。这些突触含有GABA_A-和GABA_B-受体（GABA_AR和GABA_BR）。GABA_AR的激活导致氯离子电导增加，由于局部离子分布状况，从而引发初级传入去极化（PAD）。这种去极化阻断动作电位向轴突末梢的传导，并减弱其强度，导致Ca²⁺内流减少，递质释放下降。GABA_B受体的激活虽不参与PAD的产生，但可通过减少Ca²⁺内流而增强突触前抑制。GABA_AR的激活似乎主要参与短时程抑制，而GABA_BR则参与长时程调节^8-10。除GABA（占PAD和突触前抑制主要部分）外，其他递质系统也可能调节并参与这一机制^11,12。

突触前抑制的病理变化在多种疾病状态中似乎至关重要 例如 外周炎症与神经病理性疼痛^13,14以及异常的中枢性疼痛处理¹⁵脊髓损伤¹⁶以及由GABA能传递功能障碍介导的运动过度兴奋性中枢神经系统疾病^17,18因此，评估突触前抑制有助于研究脊髓水平的实验性病理状态 体内PAD 产生容积传导电位，可直接测量脊髓中的突触前抑制。这些电位被称为背根电位（DRP），可在刺激相邻背根后从脊髓背根记录得到。⁷.

关于背根电位（DRP）的首次测量最早在猫和青蛙中被报道¹⁹，并在20世纪70年代初由Eccles、Schmidt等人在猫中进行了深入研究^3,4,20,21。尽管在猫²²和大鼠²³中进行的DRP in vivo 记录已被广泛使用，但在小鼠中的测量几乎 exclusively 在ex vivo 分离的脊髓制备物中完成^15,24。本文介绍一种在麻醉小鼠中in vivo 记录DRP的方法，可在完整生物体中直接测量突触前抑制。

方案

本方案中提及的所有实验操作均经图林根州主管部门批准（Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz，许可编号：02-044/12）。

1. 实验准备

1. 制作吸吮电极
   1. 使用显微拉管仪，将标准硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成显微移液管， 例如 标准膜片电极
   2. 使用金刚砂锉将电极断裂至尖端直径为0.5–1 mm（略大于背根的直径）。
   3. 将尖端进行热抛光，以免吸入时损伤背根。使用标准实验室火炬即可。
   4. 将玻璃微丝安装在电极夹持器上，该夹持器通过注射器连接负压系统。
2. 溶液的配制
   1. 小鼠注射麻醉：将0.75 ml 10%氯胺酮、0.24 ml 2%赛拉嗪与5 ml 0.9%生理盐水混合。按10 µl/g体重（BW）剂量经腹腔注射（i.p.）。
   2. 人工脑脊液（aCSF）：将以下盐类（单位：mM）溶于双蒸水中：NaCl 134；KCl 3；KH₂PO₄ 1.2；MgCl₂ 1.3；CaCl₂ 2.7；NaHCO₃ 16；葡萄糖 10。用 1 M NaOH 调节 pH 至 7.4，并持续通入 95% O₂ 与 5% CO₂ 混合气体至少 30 分钟以充分氧合并维持生理 pH。₂PO₄ 1.25；MgSO₄₄•H₂O₂; NaHCO₃₃ 25；CaCl₂ 2；D-葡萄糖 10。加入 H₂O₂ 至终浓度为0.003%。务必使用新鲜配制的溶液。
3. 记录装置的准备（图2)
   1. 将放大器连接到PC接口以实现数据数字化。
   2. 使用基于PC的程序或模拟定时器来触发电脉冲刺激器，并在PC硬盘上进行数据采集。
   3. 使用连接至标准玻璃电极夹持器的氯化银丝进行刺激和记录。
   4. 在小鼠立体定位架周围组装三个分别用于刺激、记录和参考电极的操纵器，以便所有电极后续均可到达制备好的脊髓部位。
   5. 将管路和注射器连接至电极夹具，以便施加负压。

2. 动物实验的一般注意事项及记录实验前的动物准备

1. 所有实验均应按照各机构动物护理与使用委员会的指南进行。所有手术和记录操作均需在深度麻醉下实施，以确保将动物的痛苦降至最低。
2. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮和赛拉嗪分别为每克体重125mg和8mg；按上述方法配制的溶液，注射量为10 µl/g体重）对动物进行麻醉。在长时间记录过程中，如有必要，可追加腹腔或肌肉注射。
   注意：在大腿上部肌肉重复注射0.05–0.1 ml氯胺酮/赛拉嗪溶液，已被证实可维持动物深度麻醉长达3小时。
3. 使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。
4. 将动物头部固定于立体定位仪中，并使用带有直肠探针和反馈回路的加热垫，在实验期间控制动物体温。脊髓无需在立体定位仪中固定。
5. 开始手术前，通过检查眼睑反射和小鼠脚趾间的抽动反应来评估麻醉深度。反射应完全消失。
6. 使用手术刀沿脊髓中线从上胸段至下腰段切开皮肤，以获得清晰的手术视野。切开皮肤时不得使用剪刀。小心将皮肤与下方组织分离。后续操作中应持续用0.9%生理盐水保持创面湿润。
7. 使用手术刀和剪刀从腰段至胸段两侧切断椎骨旁的肌腱和结缔组织。
8. 使用小型咬骨钳去除棘突及椎骨周围的残余结缔组织。
9. 在解剖显微镜下，从腰段（L4/L5）开始，用咬骨钳小心地逐节咬开椎骨。将咬骨钳尖端插入椎骨与脊髓之间的间隙，轻轻撬开骨片。操作中不得损伤硬脊膜，避免对脊髓施加压力，这两点对实验成功至关重要。整个过程中应持续保持脊髓湿润。逐步向中胸段推进。

3. 背根分离与背根电位记录（图2）

1. 使用带弯头的细针（30 G）小心打开硬脑膜。此后始终用 aCSF 保持湿润。
2. 尽可能使用测径器分离背根，并尽可能远端切断两根相邻的背根。分离过程中剧烈牵拉背根会影响实验成功率。
3. 将吸电极下降至背根处。向脊髓中加入尽可能多的 aCSF，因为液体有助于将背根吸入电极内。
4. 通过注射器施加负压，将一根背根的切断端吸入玻璃移液管中。如有需要，可用细针将背根移至电极开口前方。
5. 若背根在吸电极内干燥，可在其尖端添加少量 aCSF，同时小心施加负压，直至移液管内充满足够量的 aCSF。
6. 背根吸入后，将电极尖端从脊髓上抬起。注意避免移液管尖端与脊髓之间形成“液桥”，以免造成记录/刺激电极短路。
7. 对同侧相邻的另一根背根重复步骤 3.3–3.6。
8. 将参考电极尽可能靠近背根放置，并持续滴加 aCSF 保持湿润。
9. 建立记录装置时，已选定一根背根用于刺激，另一根用于记录。在电流钳模式下记录第二根背根信号的同时，逐步增加刺激电压。可观察到一个短暂的向下偏转，随后出现缓慢而持久的向上偏转，代表背根电位（DRP）。
10. 将刺激电压调整至超最大水平，并记录多个扫描信号（每个背根至少记录 20–30 次扫描，频率 0.1 Hz，滤波范围 0.3 Hz–3 kHz）。
11. 记录三刺激短串（100 Hz），以获取 DRP 时间依赖性总和的信息。
12. 交换记录和刺激部位，进行额外的对侧记录。
13. 动物不计划在操作后存活。最后一次记录完成后，在深麻醉状态（氯胺酮/赛拉嗪，见上文步骤 2.2）下通过断头法处死动物。

4. 数据分析

1. 将数据转移至分析软件（例如 Sigma Plot、Igor Pro 或 MATLAB）。
2. 基于 20–30 次扫描计算平均迹线。
3. 取电压偏转的最大幅度（相对于基线；DRP 峰值幅度）用于进一步分析（图 3）。
4. 计算三次脉冲后与单次脉冲的 DRP 峰值幅度之比，以获得后续电位时间依赖性叠加的量化指标。

结果

典型的DRP痕迹如图3所示。明显的刺激伪迹之后通常会跟随一个短暂的向下偏转。随后可清晰分辨出一个缓慢且持续时间较长的向上偏转，即为DRP。在部分记录中，背根反射表现为叠加在DRP上的小尖峰。在正常的野生型小鼠中，当刺激电压过高时，背根反射最常出现。由于在此制备中背根反射难以以高重复性引出，因此未将其用于分析，且需注意将刺激电压降至最低但仍保持为超强刺激强度。为分析DRP峰值幅度，采用20–30次连续扫描的平均迹线（图3a）。DRP峰值幅度可与刺激伪迹前的基线水平进行比较计算。
DRP的时间依赖性总和可通过重复刺激（3次刺激；100 Hz；图3b）进行分析。峰值幅度的计算方法与单次刺激实验相同。单次刺激与高频三次刺激后的幅度比值可反映PAD时间依赖性总和的估计值。

讨论

神经元活动与突触电位的胞外和胞内电生理记录 体内 是研究中枢神经系统神经元功能和病理生理学的先进技术。脊髓整合对运动功能至关重要， 例如 肢体运动及多模态感觉感知。突触前抑制是该计算过程中确保对感觉输入产生适当反应的关键机制之一。作用于Ia类传入纤维的GABA能突触通过传入纤维的去极化（PAD）抑制运动神经元的兴奋。背根电位记录 体内 为在完整动物体内直接测量突触后抑制（PAD）开辟了可能性。该技术可能对与异常脊髓抑制相关疾病状态的研究具有特殊意义，例如疼痛、脊髓损伤、外周神经损伤或炎症。结合使用基因修饰小鼠模型，该技术可有力地用于探究脊髓抑制障碍的潜在机制。本文所述方法克服了利用离体脊髓制备进行小鼠背根电位（DRP）记录的某些局限性，从而保留了与高级中枢神经网络的通路，并可实现脊髓与高级中枢神经元活动的联合分析。通过同步电刺激相应脑区，可研究高级中枢活动对PAD的影响。此外，可通过直接刺激外周神经诱发DRP，这在外周神经损伤或炎症的动物模型中可能具有重要意义。在适当的麻醉、意识状态及温度控制条件下，可在完整动物的生理状态下持续数小时进行记录。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃管（内径 1.16 mm）	Science Products (Hofheim, Germany)	GB200F-10	其他玻璃管也可能适用
灌流溶液（无菌，0.9% NaCl）	Braun Melsungen AG	3570350
Rompun 2% (Xylazine)	Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany)
氯胺酮 10%	Medistar GmbH (Ascheberg, Germany)	KETAMIN 10%
30 G 微量注射针头 / Sterican	Braun Melsungen AG	4656300
人工脑脊液（aCSF）用盐类	Sigma-Aldrich	Diverse
S88 双输出方波脉冲发生器	Grass Technologies (Warwick, USA)	S88X
SIU5 射频变压器隔离单元	Grass Technologies (Warwick, USA)	SIU-V
InstruTECH LIH 8+8	HEKA (Lambrecht, Deutschland)	LIH 8+8 + Patchmaster 软件
通用放大器	NPI (Tamm, Deutschland)	ELC-03X
微电极拉制仪	Sutter Instruments (Novato, USA)	P-1000
解剖显微镜	Olympus (Tokyo, Japan)
显微操作器	Sutter Instruments (Novato, USA)	MPC-200/MPC-325	机械式显微操作器也可使用
恒温毯系统	Stoelting (Wood Dale, USA)	50300V
细胞内/细胞外记录电极夹持器	Harvard Apparatus (Holliston, USA)	641227