对合成的组织工程结直肠癌模型中激光显微切割的细胞及其间质进行分子谱分析，代表了一种新颖且可操控的方法，可用于表征和解析肿瘤侵袭前沿的肿瘤细胞与癌相关间质细胞之间界面处独特的生物学特性。
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摘要
摘要
侵袭性结直肠癌（CRC）细胞已获得从其姐妹细胞中脱离、浸润间质并重塑细胞外基质（ECM）的能力。对这一表型独特细胞群体的生物学特性进行表征，有望显著加深我们对转移级联过程中早期事件的理解。
肿瘤侵袭是一个动态过程，由恶性上皮与癌症相关间质之间的双向相互作用所促进。为了研究肿瘤间质界面处的细胞特异性反应，我们结合了器官型共培养与激光显微切割技术。
在类器官模型中，成纤维细胞等关键间质成分与癌变上皮细胞进行三维共培养，这类模型是高度可调控的实验工具，可在接近生理条件的情况下研究肿瘤侵袭及癌细胞与间质的相互作用。
激光显微切割（LMD）是一种以微米级精度对肿瘤组织内不同层次进行手术分离和提取的技术。
通过将这些技术与基因组学、转录组学和表观遗传学分析相结合，我们旨在更深入地理解侵袭性肿瘤细胞及其周围间质组织的分子特征，从而有可能揭示结直肠癌（CRC）中新的生物标志物以及药物开发的新机遇。
引言
类器官共培养是一种组织工程模型，通过将恶性上皮细胞与间质细胞共同置于含有重要细胞外基质组分的胶原凝胶中，从而在三维空间中重建体内肿瘤微环境1-3。该模型最初被设计用于评估肿瘤侵袭能力，可减少对体内动物模型的依赖，并克服其他体外技术（如Transwell侵袭实验）的局限性——在这些实验中，侵袭细胞被迫人为地处于单一分散状态2-4。在这些模型中引入间质细胞（如成纤维细胞），反映了肿瘤微环境在调控恶性侵袭和转移中的关键作用3-4。然而，由于间质细胞存在显著的表型异质性，为了最大程度提高类器官模型的生理相关性，应尽可能使用器官特异性、解剖学上精确的离体成纤维细胞3,6。
类器官是一种多功能平台，可用于研究肿瘤细胞与基质细胞之间的相互作用，并正以越来越多的新方式被用于探究化学抑制剂和靶向基因改变对肿瘤侵袭的影响7,8研究侵袭性肿瘤边缘具有特别令人兴奋的前景。在类器官模型中，已建立的结直肠癌（CRC）细胞系通常形成层次分明的上皮层，通过横切面可清晰辨识出获得侵袭细胞外基质（ECM）能力的细胞。鉴于肿瘤及肿瘤相关间质细胞已知的微地形异质性 体内通过激光显微切割技术分离这些细胞并进行独立研究，可能揭示有关结直肠癌转移起源的重要生物学见解，并有助于更高效地确定治疗靶点。在以下方法学描述中，所有提供....
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方案
1. 从结肠组织外植体建立原代成纤维细胞培养
- 从外科手术室直接获取正常人结肠黏膜组织样本，并将其悬浮于 7-10 ml 含 100 单位/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 0.25 μg/ml 两性霉素 B 的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 在实验室中，将组织样本置于 10 cm 组织培养皿中央，用 PBS/青霉素-链霉素/两性霉素 B 溶液清洗 3 次。最后一次清洗后不要抽吸去除液体。
- 使用无菌镊子和手术刀将组织切成小块（约 2 mm），并将每一块组织放置在 12 孔板中用手术刀片划出的十字线中心。轻轻晃动手术刀，使组织贴附于孔底。
- 将样本培养于 750 μl 原代成纤维细胞生长培养基中（DMEM 培养基添加 20% 胎牛血清（FCS）、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 292 μg/ml L-谷氨酰胺），培养基应浸没组织但防止其漂浮。在接下来的 5 天内避免扰动培养板，仅每 2 天换液一次。
- 在接下来的 5 天内，成纤维细胞将缓慢地从组织边缘开始生长，约 7 天时更为明显。大约 3-4 周后，若已有足够数量的成纤维细胞迁出，向每孔加入 750 μl 胰蛋白酶。待细胞脱落后（可能需要 5-10 分钟），收集细胞并转移至 T-25 组织培养瓶中。
2. 器官型制备
成纤维细胞浸润的组织型....
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结果
我们已将上述方法应用于多种结直肠癌细胞系与间质细胞的组合。本文展示的一个示例是SW480上皮性结直肠癌细胞系与原代人源ex vivo结肠成纤维细胞的共培养。构建三维共培养体系（图1），进行显微观察和激光捕获显微切割（图2），并通过microRNA（miRNA）表达谱分析（图3），比较侵袭性肿瘤前沿区域细胞与分层（非侵袭性）肿瘤区域细胞之间差异表达的miRNA。
.......
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讨论
本文介绍一种方法，用于特异性分离和表征在转移进展的最早阶段获得侵袭癌相关间质能力的肿瘤细胞，该方法基于上皮细胞与间质细胞的三维共培养体系。
由结直肠癌上皮细胞与含合成基质的间质相邻组成的共培养模型 ex 体内 人结肠成纤维细胞被用于研究三维环境下的结直肠癌侵袭。这一在生理上具有相关性的系统可模拟 在 体内 条件可通过替换上皮中的细胞并使用构建的间质来适应其他癌症情况 ex 活体 不同解剖来源的成纤维细胞。 该方法的一个局限性在于仅使用成纤维细胞来简化间质区室，而实际上间质区室的组成更为复杂。 在 体内 结肠间质是一种复杂且动态的组织，其细胞组成具有异质性。以免疫来源的细胞为例，这类细胞在原发性肿瘤组织中大量存在，但在本模型中则不存在。 尽管如此，该模型可靠的可重复性以及其细胞组分易于进行实验操作的特点（例如 通过在上皮和间质区室中对单个基因进行过表达或敲低），这使得该模型相比传统方法更具价值且成本效益更高 在 体.......
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披露
作者声明不存在任何潜在的利益冲突。
致谢
MB 获得英国医学研究理事会（MRC）研究员项目的资助。KP 和 AHM 获得威塞克斯医学研究基金会以及癌症研究英国/皇家外科学院（英格兰）（C28503/A10013）资助项目的支持。我们感谢南安普顿大学组织化学研究单元提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 结直肠癌细胞系——示例为 SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| 胶原蛋白 | BD 生物科学 | 354265 | |
| Matrigel | BD生物科学 | 354234 | |
| 尼龙膜 | 默克密理博 | VVLP01300 | |
| 金属网格 | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| 激光显微切割平台 | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| 膜片载玻片 | 分子装置 | ||
| 焦宁蓝 | 默克密理博 | 1052350025 |
参考文献
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al.
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