在结直肠癌细胞的三维模型的入侵肿瘤微环境的分子剖析和体外成纤维细胞

摘要

激光显微切割细胞和基质由合成的，组织工程肠癌模型的分子分析代表了一种新的和可操作的方法在肿瘤细胞之间的界面来表征和解剖的独特生物学在浸润前沿和癌症相关的基质细胞。

摘要

入侵结直肠癌（CRC）细胞已获得挣脱他们的姐姐细胞，浸润间质，和重塑细胞外基质（ECM）的能力。这个特征明显的表型组细胞的生物学转移级联过程中可以大大提高我们的早期事件的理解。

肿瘤侵袭是一个动态过程由​​恶性上皮和相关肿瘤间质之间的双向相互作用促进。为了检查细胞特异性应答在我们结合器官共培养和激光显微解剖技术在肿瘤基质界面。

器官模型，其中关键的基质成分，如成纤维细胞是3 - dimentioanally共培养与癌症上皮细胞，是高度可操作的实验工具，使浸润和肿瘤 - 基质的相互作用在近pH值加以研究ysiological条件。

激光显微切割（LMD）是这需要手术剥离和提取肿瘤组织内的各阶层，以微米级精度的技术。

通过结合这些技术与基因组，转录组和表观遗传分析，我们的目标是发展的入侵肿瘤细胞和周围间质组织的分子特性有更深的了解，并在这样做可能揭示新的生物标志物，并在CRC的药物的发展机遇。

引言

器官型共培养物是组织工程化的模型，其帮助在含有必需的细胞外基质组分^1-3的胶原凝胶并列恶性上皮细胞和基质细胞重建体内肿瘤微环境中3维。主要设想为测量肿瘤侵袭的方法，organotypics减少依赖于体内动物模型，并避免其它的体外技术如Transwell小室测定法，其中侵入细胞是人工强制进入单分散状态^2-4的缺点。包含基质细胞在这些模型中，如成纤维细胞，反映了肿瘤微环境中调节恶性肿瘤的侵袭和转移^3-4中的重要作用，然而基质的表型异质性是这样的，为了最大限度地提高器官的生理相关性模型，器官特异性，准确的解剖体外成纤维细胞应该包括尽可能^3,6。

Organotypics是一个通用平台，研究肿瘤和基质细胞之间的相互作用，并越来越多地以新颖的方式来检查对肿瘤侵袭化学抑制剂的影响，以及靶基因的改变^7,8使用。研究侵袭性肿瘤边缘是一个特别令人兴奋的前景。在器官模型，建立结肠直肠癌（CRC）细胞系中通常会产生一个很好的分层上皮细胞层，并在截面中，已经获得侵入细胞外基质（ECM）的能力的细胞是容易辨别的。鉴于肿瘤和肿瘤相关间质细胞在体内的既定微地形异质性，采用激光显微切割和学习他们孤立地提取这些细胞，可以揭示有关大肠癌转移的来历重要的生物学见解以及它会如何更有效地有针对性的。我n以下的方法，谁捐....

方案

从结肠外植初级成纤维细胞培养1。建立

1. 获得正常人结肠黏膜组织样本直接从外科手术室，并暂停在7-10毫升的PBS中补充有100单位/ ml青霉素，100微克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素。
2. 在实验室中，将样品在一个10厘米的组织培养皿的中心，洗3次，用PBS /笔，链球菌/两性霉素。最后一次洗涤后不要吸。
3. 用无菌镊子和手术刀，切割组织切成小块（约2毫米），并把每个块上绘制在一个12孔板的手术刀刀片交叉的中心。轻轻摇动手术刀在组织，使其能够坚持。
4. 培养在750微升的试样初级成纤维细胞生长培养基（DMEM补充有20％胎牛血清（FCS），100 U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和292微克/毫升L-谷氨酰胺），这应该次亚RGE组织而不使其浮动。避免打扰板块未来5天，惟重新饲料每2天。
5. 在未来5天的成纤维细胞会慢慢开始从组织的边缘长出来。在大约7天，这将更加明显。经过约3-4周，如果有足够的成纤维细胞生长出来，加750μL胰蛋白酶，每孔。经过细胞脱离（这可能需要5-10分钟），游泳池和转移到T-25组织培养瓶。

2，器官准备

编制成纤维浸渍胶器官的:

1. 制备含每器官型5×10 ⁵细胞在DMEM补充有10％FCS和292微克/毫升L-谷氨酰胺成纤维细胞悬浮液。
2. ....

结果

本公司已申请上述方法的CRC细胞系和间质细胞的多种组合。其中一个例子这里介绍的是SW480上皮CRC细胞系与原代人类体外结肠成纤维细胞。三维共培养物对细胞之间差异表达的miRNA在侵袭性肿瘤前比较，构造（ 图1），进行显微镜和激光捕获显微切割（ 图2），并通过微RNA（miRNA）的谱（ 图3）分析以及在该分层（非侵入）的肿瘤区域。

图1原理图和器官模型的摄影表现，CRC细胞接种到含有一种人工合成的基质层成纤维细胞和必需的细胞外基质成分。细胞共同培养时通过提高器官凝胶到一个无菌的不.......

讨论

这里我们描述了一种方法，特别是分离和表征已购入时转移进程在上皮细胞和基质细胞的三维共培养物的最初阶段侵入癌症相关间质的能力的肿瘤细胞。

由并列含有离体人结肠癌成纤维细胞的合成基质的CRC上皮细胞共培养模型被用于研究CRC侵袭3 -维。这其中在体内条件模拟可以通过在上皮代细胞，以及使用各种解剖起源的体外成纤维细胞构成的基质适用于其他癌症情景生理学相关的系统。这种方法的一个限制是仅使用成纤维细胞的间质隔室的简单化，作为体内结肠基质是一个复杂和动态的组织具有不同的大公升成分。一个例子是免疫源性细胞，这是目前在显著数量的原发肿瘤的材料，但此模型不存在。尽管如此，这种模式再加上轻松的可靠重复性与该细胞成分可以通过实验操作（ 例如，通过多年来在上皮细胞和基质车厢单个基因的表达或敲除），使之成为一个有价值的和符合成本效益的模式相比传统的体内实验。

在这个手稿，我们也证明了CRC​.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
结直肠癌细胞系 - 示例显示 SW480	ATCC	ATCC CCL-228
胶原蛋白	BD Biosciences 354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
尼龙膜	Merck Millipore	VVLP01300
金属网格	The Mesh Company	WSS20-A4	themeshcompany.com
激光器显微切割平台	Leica 显微系统	Leica AS LMD
膜安装载玻片	分子设备
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025