方法文章

慢性肾脏病患者血管功能的评估

DOI：

10.3791/51478

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2014年6月16日

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1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

本文内容

摘要

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通过测量肱动脉血流介导的扩张、主动脉脉搏波速度以及血管内皮细胞蛋白表达，可以评估慢性肾病患者的血管功能障碍程度及其相关的生理机制。

摘要

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与普通人群相比，慢性肾病（CKD）患者的心血管疾病（CVD）风险显著升高，而这一现象仅能部分由传统的心血管疾病危险因素加以解释。血管功能障碍是一种重要的非传统危险因素，其特征包括血管内皮功能障碍（最常见的是通过内皮依赖性舒张功能[EDD]受损来评估）以及大弹性动脉的硬化。尽管存在多种评估EDD和大弹性动脉硬度的技术，但最常用的分别是肱动脉血流介导的舒张功能（FMDBA）和主动脉脉搏波传导速度（aPWV）。这两种无创性血管功能障碍检测指标均可独立预测患有或不患有肾病的患者未来发生心血管事件的风险。CKD患者表现出FMDBA受损以及aPWV升高。虽然CKD中血管功能障碍发生的具体机制尚未完全阐明，但氧化应激增加及其继发的氮氧化物（NO）生物利用度降低是重要的促成因素。氧化应激相关的细胞变化可通过从肘前静脉采集血管内皮细胞，并利用免疫荧光法检测氧化应激标志物的蛋白表达来进行评估。本文将对用于测量FMDBA、aPWV以及血管内皮细胞蛋白表达的这些方法进行讨论。

引言

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慢性肾脏病（CKD）是一个重大的公共卫生问题，已达到流行病的程度，仅在美国就影响了约11.5%的人口1。与普通人群相比，CKD患者发生心血管死亡或心血管事件的风险显著增加2-4。尽管CKD患者普遍存在传统的心血管危险因素，但这仅能部分解释其心血管疾病（CVD）发病率升高的原因5。血管功能障碍是一种重要的非传统心血管危险因素，在肾脏病学领域正受到越来越多的关注6-9。

尽管多种变化可能均参与了动脉功能障碍的发生发展，但最受关注的因素主要包括血管内皮功能障碍（通常通过内皮依赖性舒张功能受损（EDD）来评估）以及大弹性动脉的硬化10。目前存在多种评估EDD和大弹性动脉硬度的技术，其中最常用的方法分别为肱动脉血流介导的舒张（FMDBA）和主动脉脉搏波传导速度（aPWV）。另一种常用于评估EDD的技术是利用静脉阻断体积描记法测量前臂血流对乙酰胆碱等药理学试剂的反应11,12。然而，该方法需要对肱动脉进行导管插管，其侵入性高于FMDBA，在慢性肾病（CKD）患者中可能属于禁忌。评估动脉硬度的另一种替代方法是测量颈动脉的局部动脉顺应性（即硬度的倒数），但该方法在临床终点事件中的应用和验证程度不及aPWV13。

慢性肾病（CKD）患者在尚未需....

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方案

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本方案遵循科罗拉多多机构审查委员会（COMIRB）的指导原则。

1. 测试会话的准备工作

  1. 受试者应遵循以下限制条件以获得最准确的测量结果：禁食（包括食物和咖啡因）12小时，12小时内避免运动，如适用，12小时内禁止吸烟。 >尽可能在用药前进行半衰期限制（在慢性肾病患者等人群中可能不可行），育龄期女性应在月经周期的第1-7天进行检测，以尽量减少激素影响。
  2. 通过将2 ml 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）、0.05 g肝素（180 USP单位/mg）和2.5 g牛血清白蛋白加入476.8 ml磷酸盐缓冲液中，配制500 ml解离缓冲液 pH 为 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）。可在 4 °C 下保存数月。
  3. 打开超声设备、计算机和无创血流动力学工作站（NIHem；动脉僵硬度检测设备）。将输出超声信号的电缆连接至计算机的R波触发盒。

2. 血管内皮细胞的收集与处理

  1. 经过培训的护士或医师负责采集（步骤 2.2–2.5、2.7），研究人员负责收集和处理导线（步骤 2.6、2.8–2.19）
  2. 准备肘前部位 局部消毒剂，应用止血带，定位静脉，使用18 G套管针穿刺 导管。在静脉输液管末端安装一个肝素帽适配器。
  3. 戴上无菌手套，并在操作部位覆盖无....

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结果

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FMDBA 通过测量反应性充血后肱动脉直径的最大变化值来量化。因此，需将静息状态下的动脉直径与血压袖带压迫5分钟后释放所引起的动脉直径进行比较（图1）。图A显示了肱动脉的典型超声图像，图B展示了使用商业软件获得的从袖带释放至其后2分钟内R波门控的直径变化曲线。由于直径变化通常非常微小（在图1中变化仅为4.8%），测量中的微小差异可能对结果产生显著影响。强烈建议使用商业化的自动边缘检测软件，以最大限度地减少测量中的偏倚和潜在误差44,45。由于在不同组别或比较条件下，反应性充血引起的扩张刺激可能存在差异，应利用多普勒血流速度计算剪切率，并在适用时对FMDBA进行剪切率差异的校正46,47。

大多数市售系统（包括本研究中使用的NIHem）均可在操作者极少干预的情况下计算aPWV。通过比较心电图R波与特定部位脉搏波形的“起始点”之间的时间差（图2），分别获得颈动脉（图A）和股动脉（图B）的数据。结合距.......

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讨论

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获得准确的FMDBA和aPWV结果分别依赖于高质量的超声图像和压力波形采集。实现这一目标的关键在于操作者需接受适当且持续的培训，并规范使用每种技术44。此外，必须尽可能通过标准化测试流程来控制所有可能影响结果的外部变量（例如， 检测前12小时禁食、温度湿度受控的检测环境，等）44,45。如上所述，强烈推荐使用商业化的R波门控采集软件和边缘检测软件，以最大限度地减少测量过程中的偏倚和潜在误差44,45。当FMDBA受损时，可能是由于内皮细胞释放一氧化氮（NO）功能障碍，或血管平滑肌对释放的NO反应能力下降所致。通过舌下给予硝酸甘油，可评估平滑肌层对外源性一氧化氮供体的反应性，从而判断FMDBA的任何损害是否特异性地源于血管内皮产生一氧化氮的能力下降44,45。

由于测量的是速度，因此对距离和时间的准确测量至关重要。我们所描述的方案基于弗雷明汉心脏研究（Framingha.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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作者感谢 Nina Bispham 提供的技术支持。本工作由美国心脏协会（12POST11920023）和美国国立卫生研究院（NIH）（K23DK088833，K23DK087859）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
J型导丝St. Jude404584每次采集使用2根
一次性短裤（MediShorts）Quick Medical4507
无创血流动力学工作站（NIHem）Cardiovascualr EngineeringN/A包含定制标尺。  替代系统为Sphygmocor
超声设备G.E.型号：Vivid7 Dimension我们使用G.E.设备，但市场上存在多家厂商和多种型号
血管成像软件（Vascular Imager） Medical Imaging ApplicationsN/A
R波触发盒Medical Imaging ApplicationsN/A定制制作
快速充气系统Hokanson型号：Hokanson E20
前臂血压袖带HokansonN/A定制袖带，内含6.5 × 34 cm气囊 
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）InvitrogrenC-015-5C
驴血清Jackson017-000-121
疏水笔（Pap pen）Research Products International195505
VE-钙黏蛋白抗体（VE Cadherin）Abcamab33168
AF568Life TechnologiesA11011取决于显微镜的具体配置 
AF488Life TechnologiesA11034取决于显微镜的具体配置 
硝基酪氨酸抗体（Nitrotyrosine antibody） Abcamab7048
NADPH氧化酶抗体Upstate07-001
DAPI VectorH-1200
精密擦拭纸（Kimwipe） Fisher Scientific06-666-A
塑料石蜡膜（parafilm） Fisher Scientific13-374-10
共聚焦显微镜 Olympus型号：FV1000 FCS/RICS存在多种可选型号 

参考文献

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  1. Levey, A. S., et al. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med. 150, 604-612 (2009).
  2. Foley, R. N., Parfrey, P. S., Sarnak, M. J. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. J Am Soc Nephrol. 9, (1998).
    3. ....

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重印与许可

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