慢性肾脏病患者血管功能的评估

摘要

通过测量肱动脉血流介导的扩张、主动脉脉搏波速度以及血管内皮细胞蛋白表达，可以评估慢性肾病患者的血管功能障碍程度及其相关的生理机制。

摘要

与普通人群相比，慢性肾病（CKD）患者的心血管疾病（CVD）风险显著升高，而这一现象仅能部分由传统的心血管疾病危险因素加以解释。血管功能障碍是一种重要的非传统危险因素，其特征包括血管内皮功能障碍（最常见的是通过内皮依赖性舒张功能[EDD]受损来评估）以及大弹性动脉的硬化。尽管存在多种评估EDD和大弹性动脉硬度的技术，但最常用的分别是肱动脉血流介导的舒张功能（FMD_BA）和主动脉脉搏波传导速度（aPWV）。这两种无创性血管功能障碍检测指标均可独立预测患有或不患有肾病的患者未来发生心血管事件的风险。CKD患者表现出FMD_BA受损以及aPWV升高。虽然CKD中血管功能障碍发生的具体机制尚未完全阐明，但氧化应激增加及其继发的氮氧化物（NO）生物利用度降低是重要的促成因素。氧化应激相关的细胞变化可通过从肘前静脉采集血管内皮细胞，并利用免疫荧光法检测氧化应激标志物的蛋白表达来进行评估。本文将对用于测量FMD_BA、aPWV以及血管内皮细胞蛋白表达的这些方法进行讨论。

引言

慢性肾脏病（CKD）是一个重大的公共卫生问题，已达到流行病的程度，仅在美国就影响了约11.5%的人口¹。与普通人群相比，CKD患者发生心血管死亡或心血管事件的风险显著增加^2-4。尽管CKD患者普遍存在传统的心血管危险因素，但这仅能部分解释其心血管疾病（CVD）发病率升高的原因⁵。血管功能障碍是一种重要的非传统心血管危险因素，在肾脏病学领域正受到越来越多的关注^6-9。

尽管多种变化可能均参与了动脉功能障碍的发生发展，但最受关注的因素主要包括血管内皮功能障碍（通常通过内皮依赖性舒张功能受损（EDD）来评估）以及大弹性动脉的硬化¹⁰。目前存在多种评估EDD和大弹性动脉硬度的技术，其中最常用的方法分别为肱动脉血流介导的舒张（FMD_BA）和主动脉脉搏波传导速度（aPWV）。另一种常用于评估EDD的技术是利用静脉阻断体积描记法测量前臂血流对乙酰胆碱等药理学试剂的反应^11,12。然而，该方法需要对肱动脉进行导管插管，其侵入性高于FMD_BA，在慢性肾病（CKD）患者中可能属于禁忌。评估动脉硬度的另一种替代方法是测量颈动脉的局部动脉顺应性（即硬度的倒数），但该方法在临床终点事件中的应用和验证程度不及aPWV¹³。

慢性肾病（CKD）患者在尚未需要透析时，就已表现出肱动脉血流介导的舒张功能（FMD_BA）受损^14-16以及主动脉脉搏波传导速度（aPWV）升高^13,17,18。从临床角度来看，这两种无创性血管功能障碍评估指标不仅是慢性肾病患者未来心血管事件和死亡率的独立预测因子^19-21，也在其他人群中具有同样的预测价值^22-26。这些技术可用于研究各类心血管疾病（CVD）高危人群，包括慢性肾病患者。

慢性肾病（CKD）中动脉功能障碍发生的具体机制尚未完全阐明；然而，一氧化氮（NO）生物利用度降低是其中关键的影响因素^27-30，也是内皮依赖性舒张功能受损和动脉僵硬度增加的共同机制^10,31。在CKD中，氧化应激增强，并导致NO生物利用度下降^32-34。氧化应激的定义是活性氧（ROS）的生成相对于抗氧化防御系统处于过量状态。生理刺激（包括炎症信号通路）可促进氧化酶系统（例如，氧化酶NADPH氧化酶）产生ROS，包括超氧阴离子（O₂●^-）³⁵。超氧阴离子的生成最终导致一氧化氮（NO）生物利用度降低。

一氧化氮（NO）生物利用度降低可能继而导致慢性肾脏病（CKD）的发生，因为内皮功能障碍是新发CKD的独立预测因子³⁶。这与动物实验数据一致，表明抑制eNOS可引起高血压（全身性和肾小球性）、肾小球缺血、肾小球硬化以及肾小管间质损伤³⁷。事实上，在模拟人类疾病的实验性肾病模型中，NO生物利用度降低似乎是疾病发生和进展的必要条件，提示内皮功能障碍在人类CKD中具有关键作用^38,39。

可通过采用 Colombo 最初开发的技术，对人体研究对象采集的血管内皮细胞进行血管氧化应激标志物的评估 等⁴⁰ 和改良的密封件 等^41-43使用两条无菌J型导丝，从肘前静脉采集细胞，回收并固定后，通过免疫荧光法对细胞进行内皮细胞的阳性鉴定，并分析其目的蛋白的表达情况。

本文介绍了一种可用于以下目的的方法学：a) 测量肱动脉血流介导的舒张功能（FMD_BA）；b) 测量臂踝脉搏波传导速度（aPWV）；c) 测量血管内皮细胞中氧化应激标志物的蛋白表达水平。研究重点为无需长期透析的慢性肾脏病（CKD）患者。

方案

本方案遵循科罗拉多多机构审查委员会（COMIRB）的指导原则。

1. 测试会话的准备工作

1. 受试者应遵循以下限制条件以获得最准确的测量结果：禁食（包括食物和咖啡因）12小时，12小时内避免运动，如适用，12小时内禁止吸烟。 >尽可能在用药前进行半衰期限制（在慢性肾病患者等人群中可能不可行），育龄期女性应在月经周期的第1-7天进行检测，以尽量减少激素影响。
2. 通过将2 ml 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）、0.05 g肝素（180 USP单位/mg）和2.5 g牛血清白蛋白加入476.8 ml磷酸盐缓冲液中，配制500 ml解离缓冲液 pH 为 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）。可在 4 °C 下保存数月。
3. 打开超声设备、计算机和无创血流动力学工作站（NIHem；动脉僵硬度检测设备）。将输出超声信号的电缆连接至计算机的R波触发盒。

2. 血管内皮细胞的收集与处理

1. 经过培训的护士或医师负责采集（步骤 2.2–2.5、2.7），研究人员负责收集和处理导线（步骤 2.6、2.8–2.19）
2. 准备肘前部位 局部消毒剂，应用止血带，定位静脉，使用18 G套管针穿刺 导管。在静脉输液管末端安装一个肝素帽适配器。
3. 戴上无菌手套，并在操作部位覆盖无菌有孔洞巾。
4. 在无菌巾上放置2根J形导丝。拉直其弧度。 "J" 解开 "J" 从两根导线形成形状。
5. 打开肝素帽，将J型导丝插入静脉约8 cm。在拔出导丝前，前后推送数次。避免导丝上沾有大量血液。
6. 使用线剪将导线剪断，使其能够放入含有约 30 ml 解离缓冲液的 50 ml 锥形管中
7. 对第二根导线重复步骤 2.5。
8. 对第二根导线重复步骤 2.6。将试管送回湿实验室。
9. 用镊子夹住导线，将导线悬于管内液面之上。使用电动移液器从50 ml锥形管中反复吸取解离缓冲液，然后释放，使液体沿导线长度方向流下，以冲洗并振动导线，持续10分钟。随后将导线上多余的液体甩入管中。
10. 400 × g、4 °C 条件下离心 7 分钟。
11. 在锡箔包裹的试管中配制甲醛溶液，将 100 ml 甲醛溶液与 900 ml PBS 混合。
12. 缓慢将离心管从离心机中取出，打开真空泵，将吸液管尖端套在吸管末端，保留约400 ml液体在管中，其余液体抽除 不扰动沉淀。
13. 用铝箔覆盖，并用移液器向管中加入1 ml甲醛溶液以固定样品。不要重悬。在室温下孵育10分钟。
14. 使用涂片笔在8张载玻片上标记受试者及研究访视信息，并用涂片笔在每张载玻片上画一个椭圆形。
15. 加入15 ml PBS，重悬，于4 °C、400 × g离心5分钟。
16. 重复步骤 2.15，加入 12 ml PBS，重悬，于 4 °C、400 x g 离心 6 分钟。
17. 缓慢将离心管从离心机中取出，打开真空泵，将吸液管尖端套在吸管末端，保留约 2 ml 液体在管中，其余液体用真空泵吸除 不扰动沉淀。
18. 在8个载玻片的椭圆区域中重悬并均匀移液。
19. 置于37 °C培养箱中孵育5小时，然后于-80 °C保存直至进行分析（样品可稳定保存多年）。

3. FMD_BA 和 aPWV 的评估

1. 让受试者换上一次性短裤，并仰卧于安静、光线昏暗且温度可控的房间内。
2. 根据特定超声及动脉僵硬度检测设备的要求放置相应数量的心电图电极（本操作使用无创血流动力学工作站 [NIHem] 测量动脉僵硬度，需使用4个电极），并在受试者身上佩戴血压袖带。
3. 静息20分钟后开始血压测量。至少进行3次测量，每次间隔2分钟，直至连续读数相差在5 mmHg以内。
4. 通过触诊定位肱动脉搏动，放置张力计，并使用软件程序记录肱动脉波形，开始张力测定。
5. 依次对桡动脉、股动脉和颈动脉重复上述操作。
6. 使用卷尺测量从胸骨上切迹至各检测部位（肱动脉、桡动脉和颈动脉）的距离，股动脉则使用定制标尺或卡尺测量。
7. 使用软件程序计算颈-肱动脉脉搏波传导速度、颈-桡动脉脉搏波传导速度以及颈-股动脉脉搏波传导速度（aPWV）。
8. 将前臂血压袖带置于鹰嘴突远端，在触发模式下使用血管软件记录至少10个心动周期的基线肱动脉超声图像和血流速度数据。如需要，可使用机械臂固定超声探头以保持稳定。
9. 将前臂血压袖带充气至250 mmHg并启动计时器，同时指导受试者保持完全静止。
10. 当计时器显示4:45时，使用设置为触发模式的血管软件开始记录血流速度；在5:00时触发释放袖带压力，并在时钟显示5:10时切换超声设备以记录B模式（直径）图像。
11. 持续记录，直至时钟显示7:00为止。
12. 再次使用设置为触发模式的血管软件，记录至少10个心动周期的基线肱动脉超声图像。
13. 测量受试者血压。若收缩压 >100 mmHg，且无其他禁忌证，将0.4 mg舌下硝酸甘油置于受试者舌下，并启动计时器。
14. 当时钟显示3:00时，使用设置为触发模式的血管软件开始记录B模式（直径）图像。
15. 当时钟显示8:00时停止记录。
16. 持续监测血压，直至其恢复至基线水平。

4. 制备人脐静脉内皮细胞（HUVEC）对照玻片

1. 将 HUVECs 培养至第 5–6 代，细胞融合度达到约 80%。
2. 用 3 ml 胰蛋白酶或根据培养皿/瓶所需适量的胰蛋白酶进行消化。
3. 加入等体积的胰蛋白酶中和液以中和胰蛋白酶。
4. 以 200 × g 离心约 5 分钟，用真空泵吸除胰蛋白酶及中和液。
5. 用约 10 ml PBS 重悬细胞以洗涤。
6. 以 200 × g 离心约 5 分钟，吸除 PBS。
7. 去除 PBS，加入 1800 μl PBS 和 200 μl 甲醛进行固定。
8. 用 PBS（约 10 ml）重悬细胞。
9. 以 200 × g 离心约 5 分钟，吸除 PBS，再用适当体积的 PBS 重悬，每张载玻片加样约 200 μl。
10. 将载玻片储存于 -80 °C，待分析时取出（样品可稳定保存多年）。

5. 血管内皮细胞染色

1. 从-80 °C冰箱中取出载玻片，在室温下放置5分钟（此操作适用于一批10张载玻片，包括一张HUVEC对照载玻片）。
2. 用精细任务擦拭纸擦去多余的水（不要触碰载玻片中心）。
3. 向每张玻片上加入改良的 PBS 以重新水化，静置 10 分钟。
4. 在载玻片静置期间，配制5%驴血清及其他溶液。
   1. 将300 μl驴血清加入5,700 μl经pH调整至7.4的PBS缓冲液中，配制5%驴血清溶液，适用于最多10张载玻片（如需处理更多样本，应相应增加用量）。
   2. 将目标一抗用1,000 μl的5%血清稀释。例如，硝基酪氨酸和NADPH氧化酶（稀释比分别为1:300和1:1,500）可作为氧化应激的标志物。
   3. 将5 μl AF568用1,500 μl含5%血清的溶液稀释，配制二抗AF568。
   4. 通过将2 μl VE Cadherin稀释至1,000 μl含5%血清的溶液中来制备VE钙黏蛋白。
   5. 通过将5 μl VE钙黏蛋白加入1,000 μl 5%血清中，配制AF488。
   6. 在整个过程中将AF568、VE-cadherin和AF488避光保存，同时在准备载玻片时将其置于4 °C冰箱中的摇床上。
5. 复水10分钟后，用柔软的擦拭纸将载玻片擦干。
6. 加入5%驴血清，孵育60分钟，并在标记区域覆盖一层塑料封口膜，以确保试剂完全覆盖.
7. 弃去塑料石蜡膜，用精细擦拭纸干燥载玻片。 不要清洗加入一抗，孵育60分钟，并在标记区域覆盖一层塑料封口膜，以确保试剂完全覆盖。
8. 弃去塑料石蜡膜，用喷瓶中的改良PBS冲洗，然后在玻片架中浸泡5分钟。浸泡期间，将玻片转移至暗室。后续所有步骤均需在避光条件下操作。
9. 用Kimwipes纸将载玻片干燥，加入AF568（二抗）孵育45分钟，并在标记区域覆盖一层塑料封口膜，以确保试剂完全覆盖。避光孵育。
10. 将塑料石蜡膜丢弃至生物危害废物容器中。用挤压瓶中的改良PBS冲洗，然后将柱子浸泡5分钟。
11. 用Kimwipes纸将载玻片干燥，然后加入VE-Cadherin孵育60分钟，并在标记区域覆盖一层塑料封口膜以确保试剂完全覆盖。避光孵育。
12. 将塑料石蜡膜丢弃至生物危害废物容器中。用挤压瓶中的改良PBS冲洗，然后将柱子浸泡5分钟。
13. 用柔软的任务擦拭布轻轻擦干载玻片，加入 AF488 孵育 30 分钟，并在标记区域覆盖一层塑料封口膜，以确保试剂完全覆盖。避光孵育。
14. 将塑料石蜡膜丢弃至生物危害废物容器中。用挤压瓶中的改良PBS冲洗，然后将柱子浸泡5分钟。
15. 用柔软的任务擦拭布轻轻擦拭载玻片，并将载玻片避光干燥 20 分钟。
16. 每张载玻片上仅加一滴含4',6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐（DAPI）的Fluoroshield封片剂，然后盖上盖玻片。
17. 将载玻片置于4 °C冰箱中，用锡箔纸覆盖。成像需在48小时内完成。

6. 血管内皮细胞的成像与分析

1. 根据特定显微镜的规格，准备显微镜以成像染色的内皮细胞。单个盲法技术人员应对一批细胞中的特定蛋白进行分析。
2. 系统性扫描载玻片。通过VE钙黏蛋白（VE Cadherin）的阳性染色识别内皮细胞，并通过DAPI的阳性染色确认细胞核完整性。
3. 每张载玻片成像30个细胞以供后续分析。对染色批次中的每张载玻片重复此操作，包括HUVEC。
4. 使用定性软件分析目的一抗染色强度。
5. 为尽量减少不同染色批次间染色强度差异可能带来的混杂效应，应以所收集内皮细胞中目标蛋白表达量与HUVEC中相同蛋白表达量的比值来报告结果。

结果

FMD_BA 通过测量反应性充血后肱动脉直径的最大变化值来量化。因此，需将静息状态下的动脉直径与血压袖带压迫5分钟后释放所引起的动脉直径进行比较（图1）。图A显示了肱动脉的典型超声图像，图B展示了使用商业软件获得的从袖带释放至其后2分钟内R波门控的直径变化曲线。由于直径变化通常非常微小（在图1中变化仅为4.8%），测量中的微小差异可能对结果产生显著影响。强烈建议使用商业化的自动边缘检测软件，以最大限度地减少测量中的偏倚和潜在误差^44,45。由于在不同组别或比较条件下，反应性充血引起的扩张刺激可能存在差异，应利用多普勒血流速度计算剪切率，并在适用时对FMD_BA进行剪切率差异的校正^46,47。

大多数市售系统（包括本研究中使用的NIHem）均可在操作者极少干预的情况下计算aPWV。通过比较心电图R波与特定部位脉搏波形的“起始点”之间的时间差（图2），分别获得颈动脉（图A）和股动脉（图B）的数据。结合距...

讨论

获得准确的FMD_BA和aPWV结果分别依赖于高质量的超声图像和压力波形采集。实现这一目标的关键在于操作者需接受适当且持续的培训，并规范使用每种技术⁴⁴。此外，必须尽可能通过标准化测试流程来控制所有可能影响结果的外部变量（例如， 检测前12小时禁食、温度湿度受控的检测环境，等）^44,45。如上所述，强烈推荐使用商业化的R波门控采集软件和边缘检测软件，以最大限度地减少测量过程中的偏倚和潜在误差^44,45。当FMD_BA受损时，可能是由于内皮细胞释放一氧化氮（NO）功能障碍，或血管平滑肌对释放的NO反应能力下降所致。通过舌下给予硝酸甘油，可评估平滑肌层对外源性一氧化氮供体的反应性，从而判断FMD_BA的任何损害是否特异性地源于血管内皮产生一氧化氮的能力下降^44,45。

由于测量的是速度，因此对距离和时间的准确测量至关重要。我们所描述的方案基于弗雷明汉心脏研究（Framingha...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
J型导丝	St. Jude	404584	每次采集使用2根
一次性短裤（MediShorts）	Quick Medical	4507
无创血流动力学工作站（NIHem）	Cardiovascualr Engineering	N/A	包含定制标尺。  替代系统为Sphygmocor
超声设备	G.E.	型号：Vivid7 Dimension	我们使用G.E.设备，但市场上存在多家厂商和多种型号
血管成像软件（Vascular Imager）	Medical Imaging Applications	N/A
R波触发盒	Medical Imaging Applications	N/A	定制制作
快速充气系统	Hokanson	型号：Hokanson E20
前臂血压袖带	Hokanson	N/A	定制袖带，内含6.5 × 34 cm气囊
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）	Invitrogren	C-015-5C
驴血清	Jackson	017-000-121
疏水笔（Pap pen）	Research Products International	195505
VE-钙黏蛋白抗体（VE Cadherin）	Abcam	ab33168
AF568	Life Technologies	A11011	取决于显微镜的具体配置
AF488	Life Technologies	A11034	取决于显微镜的具体配置
硝基酪氨酸抗体（Nitrotyrosine antibody）	Abcam	ab7048
NADPH氧化酶抗体	Upstate	07-001
DAPI	Vector	H-1200
精密擦拭纸（Kimwipe）	Fisher Scientific	06-666-A
塑料石蜡膜（parafilm）	Fisher Scientific	13-374-10
共聚焦显微镜	Olympus	型号：FV1000 FCS/RICS	存在多种可选型号