一种改良的 体外 侵袭实验以确定激素、细胞因子和/或生长因子在介导癌细胞侵袭中的潜在作用

摘要

本视频文章描述了一种改良的 体外 研究激素、细胞因子和/或生长因子在驱动癌细胞侵袭中作用的方法

摘要

血液血清作为一种趋化因子，可诱导癌细胞迁移和侵袭，促进其进入微血管。然而，细胞迁移所针对的具体分子仍不明确。本研究开发了一种改良的侵袭实验方法，用于鉴定驱动细胞迁移和侵袭的靶分子。该技术通过比较三种条件下的侵袭指数，判断特定激素、生长因子或细胞因子是否在介导癌细胞侵袭潜能中发挥作用。这三种条件包括：i）正常胎牛血清（FBS）；ii）活性炭处理去除激素、生长因子和细胞因子的胎牛血清（CS-FBS）；以及 iii）CS-FBS 加入特定分子（记为“X”）。若与FBS相比，CS-FBS条件下细胞侵袭能力发生显著变化，则表明激素、细胞因子或生长因子参与了该侵袭过程的调控。随后可将单个分子重新加入CS-FBS中，检测其是否能够逆转或恢复侵袭表型。此外，还可联合使用两种或多种因子，评估多个分子在驱动或抑制侵袭过程中的相加或协同效应。总体而言，该方法可帮助研究人员确定激素、细胞因子和/或生长因子是否作为趋化吸引物或侵袭抑制剂，在特定类型癌细胞或特定突变体的侵袭过程中发挥作用。通过鉴定特异性的趋化因子和抑制因子，这种改良的侵袭实验有望揭示调控癌细胞侵袭的信号通路。

引言

一种新型侵袭实验已被开发，旨在鉴定特定激素、细胞因子和/或生长因子作为趋化因子在癌细胞侵袭中的作用。肿瘤细胞穿透细胞外基质（ECM）的能力是转移表型的标志性特征^1-3. 侵袭小室已被广泛用作 体外 用于研究癌细胞侵袭和迁移的工具，并可能提供有关其机制的知识 体内 肿瘤侵袭与转移 小室由圆柱形细胞培养插件组成，插件嵌套于细胞培养板的孔中。插件底部为具有特定孔径的半透性聚碳酸酯或聚苯乙烯膜。

在标准侵袭实验中，将细胞接种到插入膜上，并使用无血清培养基，然后将插入膜置于充满血清或类似血清的趋化因子的细胞培养孔中，以建立趋化梯度。该梯度可促使细胞穿过半透膜（迁移），或穿过包被的细胞外基质层（侵袭），随后可用常规染料对穿过的细胞进行染色，以检测并定量细胞数量。根据非侵袭性细胞系中迁移和侵袭的程度，对细胞数量进行归一化处理。该方法可使研究者在多种条件下（包括基因操作）评估不同类型细胞的侵袭潜能。

激素、细胞因子和生长因子是血清中的关键组分，越来越多的研究表明它们与驱动肿瘤侵袭表型相关⁴。然而，这些具有趋化活性的血清分子在介导侵袭过程中的性质、作用及特异性仍不明确。目前的挑战在于确定血清或类似血清的趋化因子中，究竟是哪些特定因子驱动了癌细胞的侵袭，以及哪些分子可能抑制这一侵袭过程。在本报告中，我们描述了一种评估血清中存在的激素、细胞因子和/或生长因子作为驱动癌细胞趋化与侵袭分子的潜在作用的方法学。

在此改进的实验方案中，采用活性炭吸附法去除2%胎牛血清（FBS）中的激素、细胞因子和生长因子，从而制备2%活性炭吸附处理的胎牛血清（CS-FBS）。2% FBS和2% CS-FBS均可用作建立趋化驱动力以诱导癌细胞侵袭的试剂。相较于常规的2% FBS，使用2% CS-FBS作为趋化因子具有多项优势：首要且最为显著的是，可在激素、细胞因子和生长因子含量显著降低或相对缺失的条件下研究癌细胞的侵袭表型；此外，还可使研究者评估激素、生长因子和细胞因子的集体去除是否会导致侵袭指数的升高或降低。随后，该实验设计可用于判断添加某一特定组分“X”是否能够抑制、降低、增强或使侵袭指数恢复至原始水平（参见 图2 & 3）。尽管该方法专用于恢复血清经炭吸附去除的成分至生理水平，但也应注意，炭吸附处理可能影响信号转导通路。例如，已有报道指出，炭吸附可降低成骨前体细胞的碱性磷酸酶活性，并通过减少MAPK激活剂诱导脂肪生成⁵活性炭处理培养基可从商业途径获得，其制备基于上述方案，即采用活性炭与葡聚糖混合后与胎牛血清孵育过夜。⁶.

该实验方法的建立源于Zucker et al.⁷ 报道的一项结果。作者发现，影响间隙连接通讯的突变表型在向含正常2% FBS的培养基迁移时，其侵袭指数增加；而使用活性炭剥离血清（charcoal-stripped serum）替代正常血清后，该增加效应消失。基于此结果，作者推断该突变影响了细胞向脂溶性分子（更具体地说，激素、生长因子或细胞因子）的迁移⁷。众所周知，激素、生长因子和细胞因子可介导与肿瘤促进和侵袭相关的信号通路⁴。因此，科研人员明确驱动其特定癌细胞或突变体侵袭行为的具体因子至关重要。本实验方法旨在通过分析组分“X”在正常FBS与CS-FBS中的浓度差异，研究该组分在其生理浓度下所起的作用。通过应用该检测方法，研究人员可更深入地了解调控其研究体系中侵袭行为的特异性通路。

激素、生长因子和细胞因子常被归类为肿瘤促进剂⁸某些因子（如EGF）在侵袭小室中被用作化学引诱物的直接来源。⁹因此，这些成分很可能是血清中主导肿瘤侵袭的主要组分。本方案提出了一种对传统方法简单但重要的改进 体外 侵袭实验可使研究者评估激素、生长因子和细胞因子在介导癌细胞侵袭潜能中的作用。然而，该实验旨在分析的早期阶段即为研究者提供该方法是否适用于其研究的判断依据，以避免在无需使用时浪费宝贵的时间和资源。该方法采用CS-FBS，并依赖研究者自行判断哪些分子可作为潜在介导癌细胞侵袭的候选分子。这些分析结果将有助于确定特定细胞系或突变体中哪些血清成分充当趋化吸引物或抑制剂。此外，该方法可能帮助研究者识别促进或抑制癌细胞侵袭的关键信号通路，从而指导未来的药物设计。

方案

1. 准备不同的培养基及其他组分

1. 实验前，准备培养基，其中包含DMEM或其他指定培养基，并添加正常FBS、炭吸附处理的FBS，或炭吸附处理的FBS加待测成分。注意每次实验可同时检测多种成分。
2. 准确称量并适当稀释激素、生长因子或细胞因子，使其溶解于炭吸附处理的血清中，浓度为生理浓度。

2. 在冰上制备胶原基质

1. 在冰上加入以下无菌过滤的组分，配制 2 ml 浓度为 2.2 mg/ml 的 I 型胶原蛋白基质：200 μl 10x PBS（pH 7.4）、5.4 μl 1 N NaOH、600 μl 双蒸水₂O 和 1.2 ml I 型胶原蛋白（浓度为 3.63 mg/ml）。
2. 将 I 型胶原蛋白溶液置于冰上保存，直至准备包板时使用。

3. 准备迁移/侵袭实验板

1. 针对每种待测细胞系，使用一块24孔板，其中12个孔含有插件。另外12个不含插件的孔用于添加趋化培养基，并在实验设置过程中转移插件。
   注意：对于本实验所用的细胞系，使用带有聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜和8 μm孔径的胶原基质板最为理想。然而，也可使用预包被Matrigel基质的板替代，此时应根据所研究的细胞系适当减小孔径。
2. 明确标记板上的各孔，每种分析条件使用3个孔（包括FBS迁移、CS-FBS迁移、FBS侵袭、CS-FBS侵袭，以及作为对照的非侵袭性细胞系的FBS迁移）。通过细胞穿过PET膜上的孔来检测迁移能力，通过细胞穿过胶原或Matrigel基质后再穿过膜上孔来检测侵袭能力。为每种细胞条件使用不同颜色的标记，以辅助加样过程。

4. 加样侵袭基质

1. 小心地将75 μl胶原基质溶液加入用于侵袭实验的插入式培养小室中。注意避免产生气泡。若出现气泡，可用倒置的移液枪头轻触表面以分散气泡。
2. 将带有胶原包被插入小室的培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育30分钟，使凝胶充分凝固。

5. 将细胞接种至膜或侵袭基质上

1. 同时，用胰蛋白酶消化细胞并加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基。在台式离心机上以200 × g离心5分钟，用无血清培养基洗涤3次。
2. 用无血清培养基重悬细胞，使用血细胞计数板或自动载片计数器计数细胞，并加入无血清培养基至终浓度为5 × 10⁴ 个细胞/mL。
3. 当胶原基质凝固后（约30分钟后），向每孔中加入700 μL含2%限定FBS或活性炭处理FBS的培养基。每块板包含12个插件，分配如下：
   • 3个插件含胶原，孔中培养基添加2% FBS
   • 3个插件含胶原，孔中培养基添加2% CS-FBS
   • 3个插件不含胶原，孔中培养基添加2% FBS
   • 3个插件不含胶原，孔中培养基添加2% CS-FBS
   1. 根据待测试因子的数量使用额外的板，并为每种条件设置相应的无胶原对照。
4. 将细胞悬液以5 × 10⁴ 个细胞/mL的浓度加入插件中，每个迁移和侵袭插件接种500 μL细胞悬液。
5. 将细胞在37 °C下孵育22小时。

6. 定量分析迁移和侵袭细胞的数量

1. 分别在不同的孔中设置使用甲醇固定剂、伊红和苏木精对孔板进行染色。
2. 使用棉签从每个孔中去除细胞和基质。每个孔再重复使用第二根棉签擦拭一次。
3. 用镊子将每个小室插入物依次浸入3种溶液中，每种溶液各浸5次，每次1秒。
4. 让插入物过夜干燥（O/N）。
5. 可选择以下任一方法：i) 用解剖刀小心沿边缘切割取下滤膜，将其置于载玻片上，加盖盖玻片并使用浸油封片；或 ii) 将插入物倒置过夜干燥（O/N），然后直接用于显微镜观察。
6. 次日，使用20倍物镜在显微镜下观察载玻片或插入物，并从滤膜的不同区域采集5张图像。为提高一致性，采集4个外围视野和1个中心视野。
7. 使用 ImageJ 软件对所有条件下的细胞进行计数，并代入以下公式进行计算。
8. 按如下方法计算侵袭百分率：
   穿过I型胶原插入物的平均细胞数 = a
   穿过对照插入物的平均迁移细胞数 = b
   侵袭百分率 = (a / b) × 100
9. 按如下方法计算在2% FBS条件下的侵袭指数：
   待测细胞在2% FBS中的侵袭百分率 = c
   对照非侵袭性细胞在2% FBS中的侵袭百分率 = d
   侵袭指数（FBS）= (c / d)
10. 按如下方法计算在2% CS-FBS条件下的侵袭指数：
    待测细胞在2% CS-FBS中的侵袭百分率 = e
    对照非侵袭性细胞在2% CS-FBS中的侵袭百分率 = f
    侵袭指数（CS-FBS）= (e / f)

7. 重复实验方案，比较活性炭处理的FBS与活性炭处理的FBS + X_n在多种因子联合条件下的差异

1. 根据需要，使用不同的“X”组分或多种组分的组合重复该步骤多次。
2. 应用计算方法，确定每个因素“X”对迁移和侵袭效应的贡献程度。

结果

侵袭指数根据与非侵袭性细胞系的归一化结果，针对每种实验条件进行计算。在本实验中，我们采用1205Lu黑色素瘤细胞系以及由此衍生的稳定变异细胞系作为侵袭性细胞系，同时使用前恶性非侵袭性变异细胞系WM793作为对照，1205Lu细胞系即来源于WM793细胞¹⁰ 作为合理的对照。我们还使用胶原蛋白I作为侵袭基质，因为它是真皮的主要成分。这与之前的一项研究一致，该研究指出最佳侵袭基质因细胞系不同以及与体内情况的一致程度而异。 体内 结果¹¹该侵袭实验根据研究者可能获得的结果进行了示意图解。首先，2% FBS的侵袭指数应显著高于或低于CS-FBS的侵袭指数，方可继续进行本实验（图1 & 2）。如果使用活性炭处理的胎牛血清（FBS）后，侵袭指数出现显著升高或降低，则该实验对研究者而言不具备适用性（图2 & 3）。如果使用活性炭处理的胎牛血清可消除这种增加，则研究者 already 知道增强的侵袭是针对某种激素、生长因子或细胞因子的图2 & 3）。然后，研究者必须利...

讨论

肿瘤转移是一个多步骤的过程。肿瘤细胞必须突破基底膜，侵入淋巴系统或血液微血管，并通过这些循环系统被运输到远端部位，随后穿出血管并定植形成大转移灶¹²。类固醇激素^13,14、生长因子^15-18和细胞因子^19-21已被证实能够促进上皮-间质转化（EMT）、肿瘤侵袭及转移的进程。这些分子对于解析肿瘤进展相关的信号通路至关重要，因此，建立一种用于研究这些分子在肿瘤侵袭潜能中作用的检测方法，是阐明复杂信号通路的重要一步。

使用炭吸附去除血清中激素的检测方法相较于现有方法具有优势，因为它旨在识别驱动肿瘤细胞迁移的关键因素。此前已有研究发表，采用正常原代乳腺成纤维细胞在侵袭小室中进行实验。在该研究中，作者使用炭吸附处理的培养基，并在Matrigel小室中回补雌激素，但并未如预期引起细胞侵袭，因为这些细胞本身不具致瘤性。然而，无论是否存在雌激素，巨噬细胞条件培养基的存在均显著增强了细胞侵袭，且增强程度相似²²。尽管该实验同样采用了含炭吸附血清的侵袭实验体系（在有或无雌激素条件下），但它并非...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带有 8.0 µm PET 膜的 BioCoat 对照小室	Corning	354578	每块 24 孔板中各 12 个。PET = 聚对苯二甲酸乙二醇酯
大鼠尾部 I 型胶原蛋白	Corning	354236	来源 = 大鼠尾腱，纯度 = 90%
固定剂；Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	甲醇基固定剂，含苏木精/伊红
胎牛血清	Life Technologies	16000	标记为 FBS
活性炭处理胎牛血清	Life Technologies	12676	标记为 CS-FBS
胎牛血清	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	标记为 FBS
活性炭处理胎牛血清	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	标记为 CS-FBS