在小鼠肾切除术后建立自发性转移性肾细胞癌（mRCC）模型

摘要

自发性转移性肾细胞癌（RCC）疾病进展模型可用于在具有临床相关性的环境中评估治疗方法。本实验方案展示了原位肾肿瘤细胞植入、规范的肾切除术操作步骤，最后提供了一套尸检指南，用于对转移负荷及定位进行肉眼观察和生物发光评分。

摘要

在肾细胞癌（RCC）新实验性治疗药物的改进测试中，一个关键挑战是建立能够真实模拟早期和晚期转移性疾病的进展模型。典型的肿瘤移植模型通常采用异位或原位的原发性肿瘤植入，但很少包含能够模拟临床情况的全身性自发转移性疾病。本实验方案描述了构建与患者疾病进展阶段相似的RCC模型的关键步骤。首先，该方案采用高转移性的小鼠肿瘤细胞系，在同源模型中实现原位肿瘤细胞植入，方法包括将细胞与Matrigel混合后植入肾包膜下空间，以防止细胞泄漏和早期扩散，该操作既可经浅表途径也可经内部途径进行。接着，方案详细说明了带瘤肾脏切除（肾切除术）的操作流程，并强调了术前和术后小鼠护理的关键要点。最后，方案概述了监测和评估微转移及大转移疾病进展所必需的步骤，包括生物发光成像，并提供了一份详细的可视化尸检指南，用于评分全身性疾病的分布情况。本方案的目标是促进临床相关性高的转移性RCC模型的广泛应用，从而提高未来治疗测试的预测价值。 

引言

肾细胞癌（RCC）患者死亡的主要原因是全身性转移性疾病，这类转移通常在肾脏原发肿瘤经手术切除后发生。然而，目前在小鼠中评估实验性治疗手段的临床前肿瘤模型极少包含转移性疾病，能够真实模拟局部生长、手术切除以及自发性微转移形成与进展等临床阶段的模型更是少之又少 ^1-3。随着新疗法的不断涌现，这一测试环节的缺失变得愈发重要，因为在动物模型中观察到的显著抗肿瘤效果并不总能转化为对患者的同样成功治疗 ⁴。这种结果差异可能源于局部异位或原位原发肿瘤模型与晚期转移性疾病之间药物疗效的不同^5-7。以肾细胞癌为例，仅有少数研究采用了包含自发性复发疾病的成熟动物实验方案，而这类复发情况可模拟临床上通常已将带瘤肾脏完全或部分切除的患者状况 ^2,3。造成小鼠模型应用不足的原因多种多样。首先，动物成本高昂，且肿瘤细胞的选择及其转移潜能存在固有的变异性。例如，人类肾癌细胞系通常极少发生转移，必须经过多轮原位植入和转移性筛选，才能获得能够稳定播散并形成远端病灶的亚系（参见此类人类细胞系建立过程的描述 ^8-10）。相反地 ，在免疫健全小鼠模型中，小鼠来源的肿瘤细胞往往表现出较强的侵袭性，因此必须使用较低细胞数量并联合Matrigel注射，以减少立即发生的全身扩散³。其次，实施准确的原位植入、手术切除（肾切除术）以及对自发性转移生长进行追踪（和定量）存在技术上的困难，在应用该技术时需考虑多个关键变量（详见讨论部分）。本实验方案的目的是详细描述肾细胞癌原位植入、切除（肾切除术）及自发性转移疾病监测的关键步骤（以及潜在的技术难点），并为科学实验室在评估实验性治疗手段疗效时提供标准化且更广泛应用的操作指南。

方案

1. 原位肾肿瘤移植

1. 细胞培养
   1. 在进行原位移植前，将小鼠 RENCA^LUC 细胞以单层培养至 75% 汇合度。
   2. 经胰酶消化并用含 5% FBS 的培养基重悬后，在 4 °C 条件下以 1,000 rpm 离心 5 分钟，用 PBS 洗涤 3 次。然后将细胞重悬于无血清培养基中，浓度为 5 × 10⁴ RENCA^LUC/5 μl 无血清培养基。
      注意：根据所使用的细胞变体或细胞系，可将细胞重悬于基质胶（matrigel）与无血清培养基按 1:1 比例混合的溶液中，以减缓高侵袭性小鼠细胞在移植后的生长和扩散。
2. 手术与细胞移植
   注意：本文所述所有动物实验，包括动物饲养管理及实验终点的确定，均依照罗斯韦尔帕克癌症研究所（Roswell Park Cancer Institute）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
   1. 使用异氟烷（2–3%）麻醉一只 Balb/C 小鼠。轻捏足部并检查反射以确认麻醉充分。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。将小鼠置于右侧卧位，剃除前肢与后肢之间左侧体表的毛发。用酒精和碘酒对背部腰部区域进行消毒，为切口做好无菌准备。
   2. 使用手术剪在最后一根肋骨与髋关节之间沿纵轴方向做一条约 1 cm 的皮肤切口。用钝头组织剪松解皮下结缔组织。再用手术剪在腹壁上沿纵轴方向做一条约 0.5 cm 的切口。用弯头镊子轻轻向下推动切口周围组织，使肾脏自然外翻，便于在注射前轻柔固定器官。
   3. 用 Hamilton 注射器吸取 5 μl 已准备好的细胞悬液。对于包膜下移植，可采用以下两种移植方法：
      1. 浅层法：  沿肾脏纵轴平行方向，将针头斜面朝上插入肾包膜下（但位于实质上方）。针头到位后，注入全部细胞，直至形成一个微小的白色液泡。缓慢退出针头，并立即用无菌棉签轻压注射部位，吸收可能渗漏的液体，防止细胞扩散。
      2. 内部法：将针头斜面朝上，从肾脏最终移植位点的对侧开始，穿入肾脏实质内部，直至针头可见但未刺破包膜下间隙。注入全部细胞，直至形成白色液泡，随后擦拭注射部位以防止渗漏。
   4. 轻柔地将肾脏复位至体腔内。使用可吸收的 5-0 Vicryl 缝线缝合腹壁。缝合完成后，拉拢皮肤并夹上 2–3 个伤口夹。确保夹子牢固且间距均匀，避免伤口暴露。在恢复前，使用 25 G 针头皮下注射 500 μl 0.9% NaCl 和 100 μl 布托啡诺（Buprenorphine，0.01 mg/ml）。术后常规监测伤口夹的位置与稳定性，并在 10 天后拆除。

2. 肾切除术/原发肿瘤切除

1. 按照上述第1.2.1节和第1.2.2节所述的相同方案进行小鼠麻醉、固定、切口及肾脏暴露操作。
2. 使用第二把镊子，从肾脏尾端轻轻分离连接的脂肪组织，并从头端分离肾上腺。在轻柔夹持肾脏的同时，使用可吸收的5-0 Vicryl缝线在输尿管、肾动脉和肾静脉周围打双结。缓慢结扎后，在结上方剪断以摘除肾脏。若出现即刻出血，或缝线对输尿管、动脉和静脉的固定可能不足时，则应使用电灼器而非 剪刀在结上方切断。 
3. 肾脏摘除后，仔细检查结扎的动脉是否有出血，并在必要时使用电灼器处理。使用5-0 Vicryl缝线关闭腹壁。将皮肤层拉拢，按照1.2.4节所述的相同注意事项放置2-3个伤口夹。术后每日密切观察动物是否出现痛苦、出血或活动受限等迹象。遵循机构关于动物安全的指导原则。

3. 终点时转移进展与定位的监测

1. 转移性疾病定量：生物发光监测
   1. 参见 JOVE 之前描述的方法，该方法使用转染了荧光素酶的细胞，并通过 Xenogen IVIS 成像系统进行定量以监测转移 ^11,12。
2. 用于比较评估转移分布的肉眼解剖指南
   1. 根据机构指南实施动物安乐死，终点包括出现痛苦迹象、呼吸困难、体重减轻等。
      注意：需密切监测动物，因为自发性转移进展可能高度可变且迅速。
   2. 使用手术剪在尿道上方开始切口，沿胸腔向上延伸至下颌。使用钝头剪分离腹部皮肤与腹壁肌肉。
   3. 沿四肢进行切口，剥离皮肤。仔细检查皮肤筋膜和腹壁是否有结节，然后检查浅表淋巴结：腹股沟、臂部、腋窝和浅表颈淋巴结。
   4. 在腹壁做切口，并沿左右两侧向上剪至膈肌。通过一次横向剪切移除腹壁前部，暴露内脏器官。
   5. 观察内脏器官未受干扰时的外观，检查是否有明显可见的肿瘤。同时注意胃和肠道内容物；若为空，表明小鼠可能无法进食；若内容物呈深色，可能提示上/下消化道出血。
   6. 对每只动物的各个器官进行肉眼评分，记录肿瘤存在与否，并为每组小鼠分配总分（以每组4只动物为例，见图1D-i）。
      注意事项：1）淋巴结肿大并不一定意味着肿瘤生长；若其体积显著增大、质地坚硬且呈灰白色，则很可能是转移性结节。2）腹腔内出现大量乳白色或浑浊液体提示腹水。腹水中可能含有腹腔器官上的固体沉积物，尤其常见于肝脏叶间及胃部周围。3）对于肺等器官，可能存在多个结节，可进行计数以比较个体动物之间的差异（例如参见 ¹³）。
   7. 通过小心取出各腹部器官（肝、脾、肾和胰腺）并用喷瓶中的 PBS 冲洗，识别肉眼可见的肿瘤或异常。
   8. 移除腹部器官后，检查腹部淋巴结，包括腰部、骶部、肾周和肠系膜淋巴结。
   9. 评估膈肌是否存在转移扩散的证据。
      注意：膈肌上广泛转移可能导致其失去收缩能力，引起呼吸困难或呼吸停止。
   10. 移除膈肌，并在胸腔两侧做线性切口，去除前部结构以暴露肺和心脏。
   11. 轻轻夹住并提起食管，于心脏上方剪断气管，取出肺和心脏。检查组织是否存在结节。挤压心脏，若缺乏弹性可能提示存在肿瘤。
   12. 使用手术剪沿颅骨线性剪开。轻轻移除小块颅骨，直至完全暴露脑组织。全面检查脑组织是否存在可见结节或异常着色区域。

结果

图1A 展示了本方案摘要中详细说明的操作流程示意图。每一步骤均需考虑若干重要因素。例如，在步骤1中，展示了将肿瘤细胞植入肾脏包膜下的两种方法。可通过产生微小白色气泡来确认肿瘤细胞被准确地定位于包膜下间隙，同时在拔出针头后小心擦拭溢出的液体，以防止泄漏（图1B-i）。为防止泄漏，也可先将细胞植入肾实质内部，使其进入包膜下空间（图1B-ii），并可与Matrigel混合使用，以阻止肿瘤细胞过早进入血液循环。关于肾脏的手术切除，具体时间取决于所用细胞系的生长速度和转移潜能。最佳的肾切除操作应快速但可控，以尽量减少小鼠的痛苦并促进恢复。使用Vicryl线牢固结扎输尿管、肾动脉和肾静脉是防止出血的关键（见图1C）。可使用电灼止血，但仅在可能出现大量出血时才进行干预。最后，通过非侵入性生物发光检测对自发性疾病进行追踪，可实现对隐匿性病灶及其生长的持续监测，并在实验终点进行定量分析（见图1D）。然而，在自发性转移模型中使用荧光素酶标记的细胞时，有时会导致克隆性肿瘤细胞筛选出不表达转染...

讨论

本实验方案的目的是利用同源肿瘤小鼠模型评估具有临床相关性的自发性转移性疾病，并描述肿瘤植入和切除的技术。目前，大多数评估新型实验性治疗手段的临床前研究并未纳入对转移性疾病的考察，仅有少数研究能够重现原发肿瘤生长、手术切除以及最终自发性转移扩散的各个阶段。迄今为止，为诱导自发性肾细胞疾病进展而构建的基因工程小鼠模型（GEMMs）（详见¹⁴的综述）尚不包括晚期转移阶段，且尚未见报道有关这些模型的外科干预策略。因此，目前自发性转移性肾细胞癌（RCC）的研究仅限于原位肿瘤细胞植入模型。尽管此类模型已有先前的建立 ^2,3，但该方案在新疗法评估中尚未被广泛应用，尤其是在围手术期治疗评估中，其可能具有最高的预测价值。本方案旨在详细阐述必要的操作步骤，以促进该模型在治疗评估中的更广泛使用。在执行本方案所述技术时可能存在若干潜在问题，需特别注意几个关键因素，这些因素可能影响实验结果。首先，肿瘤细胞植入后发生泄漏可能导致腹膜内疾病播散，从而无法代表初始的局部原发性肿瘤生长。其次，必须针对所使用的每种细胞系确定最佳切除时间。这一点至关重要，因为过早地对荷瘤肾脏进行手术肾切除可能不足以引发疾病转移（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM-高糖，含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺	康宁	10-013-CV
FBS	Invitrogen	10437-028
0.25% 胰蛋白酶 EDTA	康宁	25-053-CL
不含钙的1x DPBS &和镁	康宁	21-031-CV
Matrigel	BD 生物科学	354234	必须保持在冰上
人工泪液-润滑性眼膏	Akorn动物健康	17478-162-35
口袋式宠物修剪器	布雷因特里科学公司	CLP9931B
酒精棉片	VWR	326895
聚维酮碘溶液棉签	VWR	67618-152-01
直头微解剖剪，钝头 - 25 mm 刀片 - 4.5"	南点外科手术	RS-5982
虹膜镊，带齿，弯曲型，10 cm 长	Kent scientific	INS15915	需要两个这样的
10 µ10 微升汉密尔顿注射器	Hamilton	7635-01
30 G，45度，RN针头	Hamilton	7803-07
无菌棉签	VWR	10805-144
高温电烙器套件	Kent scientific	INS500392
5-0 涂层薇乔线，普通切割针	Ethicon	J834
7 mm 结扎夹自动施夹器	Kent scientific	INS500343
反射夹，7 mm，非无菌	Kent scientific	INS500344
移除镊子，12 cm 长	Kent scientific	INS500347
0.9% 氯化钠	Baxter Healthcare	2B1322
布托啡诺 0.01 mg/ml
25 G 5/8" 针	VWR	BD305122
1 ml 无针注射器	VWR	BD309659
D-荧光素	Gold Bio technology	LUCK-1G