热生物学催化：利用等温滴定 calorimetry 表征酶促反应

摘要

等温滴定 calorimetry 可测量化学反应中释放或吸收的热流。该方法可用于定量分析酶催化反应。本文概述了仪器设置、实验操作和数据分析的方案，并将其应用于刀豆脲酶催化尿素水解的表征研究。

摘要

等温滴定 calorimetry（ITC）是一种已有详尽描述的技术，通过测量化学反应过程中释放或吸收的热量，将其作为内在探针来表征几乎所有的化学过程。如今，该技术被广泛应用于测定生物分子结合平衡的热力学参数。此外，ITC 已被证明能够直接测量酶促反应的动力学和热力学参数（k_cat, K_M, ΔH），尽管这一应用仍尚未得到充分开发。由于在酶催化过程中热量变化会自发产生，ITC 无需对分析体系进行任何修饰或标记，且可在溶液中进行。此外，该方法所需样品量极少。这些特性使 ITC 成为在多种应用中研究酶动力学的一种不可估量、强大而独特的工具，例如药物发现。

本文详细描述了一种基于等温滴定量热法（ITC）的实验方法，用于定量测定酶促反应的动力学和热力学参数。该方法应用于测定刀豆（Canavalia ensiformis）脲酶催化尿素水解反应的k_cat和K_M值，并计算了该反应的固有摩尔焓变（ΔH_int）。所获得的结果与文献中已报道的数据一致，验证了该方法的可靠性。

引言

生化反应的定量测定有助于揭示生命基础的生物学过程。量热法提供了一种无标记的方法，几乎可对溶液中所有化学反应进行定量表征。该技术通过测量反应过程中随时间释放或吸收的热量，实现对反应分子数量的量化，因此是一种通用的检测系统，也是一种极为便捷的定量分析方法。即 结合热力学），以及测量反应速率（即 动力学）。特别是，等温滴定 calorimetry（ITC）已被广泛采用作为表征生物分子平衡热力学的首选方法，涉及蛋白质-配体、蛋白质-蛋白质、蛋白质-金属离子以及蛋白质-DNA 相互作用^1-6此外，ITC 能够提供动力学信息，使其成为测量酶催化作用的非常强大的系统，尽管这一应用的潜力仍未被充分认识^7-9.

米氏方程¹⁰是对酶促反应的定量描述，它提供了反应速率与底物浓度之间的关系，该关系依赖于两个动力学参数：米氏常数（K_M）和催化速率常数（k_cat）。k_cat/K_M 的比值被称为酶的催化效率。在实际应用中，测定特定反应的 K_M 和 k_cat 值，即可对催化过程进行完整的描述。

在典型的酶促反应中（<....

方案

1. 样品制备

1. 每次实验运行前，准备 2 ml 酶溶液和 0.5 ml 底物溶液。使用组成完全相同的缓冲液稀释浓缩的酶和底物储备液，以尽量减少底物加入过程中稀释和混合所产生的热量。
   1. 选择能够有效防止实验过程中 pH 变化的缓冲条件。例如，中性 pH 条件下可使用 20 mM HEPES pH 7。
      注意：如果涉及质子交换，必须考虑所用缓冲液的质子化焓，因为它们会影响反应实测的ΔH。还应考虑缓冲液或添加剂分子对被分析体系可能产生的特异性影响。如果酶溶液中包含有机溶剂（例如 DMSO），则必须在底物溶液中加入完全相同的浓度。
   2. 对于 M1 实验，酶浓度起始范围为 nM 级别（例如 1 nM），底物浓度应至少比酶浓度高三个数量级，并高于 K_M。
   3. 对于 M2 实验，酶浓度起始范围为 pM–nM 级别（例如 15 pM），注射器中的底物浓度为 mM 级别（例如 400 mM）。
      注意：在单次注射的 M1 实验中，浓度应足够以确保在实验时间内底物完全转化为产物。因此，酶浓度取决于酶的反应速率：若研究的是低k_cat的酶，则需使用较高酶浓度（最高可达 10 µM）。而 M2 实验中所用的酶浓度必须确保每次注入的底物仅被轻微消耗（低于 5%），且酶反应处于稳态。因此，酶....

结果

脲酶（EC 3.5.1.5；尿素氨基水解酶）是一种存在于古菌、细菌、单细胞真核生物和植物中的含镍多亚基酶。该蛋白在有机氮矿化的最后一步发挥作用，催化尿素水解为氨和氨基甲酸酯，后者可自发分解生成第二个氨分子和碳酸氢根（方程式 6）¹²。

(6)

该反应导致环境 pH 值整体升高，从而对人类健康和农业产生不利影响¹³。在植物中，脲酶的主要作用是从精氨酸酶来源的尿素中回收营养氮¹⁴。植物脲酶通常是由六个相同亚基组成的同源六聚体 a₆，每个亚基的活性位点含有两个 Ni²⁺ 离子¹⁵。其.......

讨论

等温滴定量热法（ITC）相较于现有方法在研究酶活性方面的意义

除了经典地用于研究结合平衡外，等温滴定 calorimetry 还提供了一种可靠且快速的方法，通过检测反应热来表征溶液中的酶促反应，无需对系统进行修饰或标记。动力学参数 k_cat 和 K_M 通常通过一系列时间进程实验获得，其中通过连续或非连续测定法监测产物生成（或底物消耗）。通常，通过特征波长下的光吸收或荧光来测量底物或产物浓度。然而，大多数底物和/或产物在光谱上无活性，因此必须引入发色团或荧光团以追踪反应。或者，可采用偶联测定法，即将催化反应的产物作为另一反应的底物，而该反应具有可检测的产物。然而，这些方法会引入额外的变量，从而降低所测定的 K_M 和 k_cat 值的准确性。此外，使用传统方法表征小分子配体对酶的抑制作用时，可能会因小分子配体本身具有吸收或荧光特性，干扰光谱测定法的可靠性。其他方法包括停流技术，通过质谱或色谱定量产.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPES	Sigma	H3375	溶于水，并用 NaOH 调节 pH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	溶于水，并用 HCl 调节 pH
磷酸二氢钠	Riedel-de-Haen	4270	溶于水
磷酸氢二钠	Riedel-de-Haen	30427	溶于水
尿素	Sigma	U4128	在 40 °C 下溶于水
Canavalia ensiformis 脲酶（C-3 型）	Sigma	U0251	溶于 20 mM HEPES（pH 7）中，并于 -80 °C 保存
Origin 7.0 上的 VP-ITC	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	仪器
Origin 7.0 上的 VPViewer2000 1.30.00	MicroCal (GE Healthcare)		随仪器提供的数据采集软件