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方法文章

一种基于限制性内切酶的克隆方法用于评估 体外 HIV-1 C亚型Gag-MJ4嵌合病毒的复制能力

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DOI：

10.3791/51506

⸱

2014年8月31日

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

HIV-1 发病机制由病毒特性与宿主遗传因素共同决定。本文介绍一种可靠的方法，可实现可重复的测量，用于评估 gag 基因序列变异在 体外 病毒的复制能力

摘要

许多HLA I类等位基因对HIV-1致病过程和疾病进展的保护作用，部分归因于其能够靶向HIV-1基因组中难以发生逃逸的保守区域。在感染过程中，由于细胞免疫压力，HIV-1基因组各区域均可能出现序列变异；若此类变异发生在基因组的保守区域（如Gag），则可能影响病毒的复制能力 体外HLA相关Gag多态性向HLA不匹配受体的传播与较低的病毒载量稳态水平相关。我们假设这可能归因于病毒复制能力的降低。本文提出一种评估病毒复制能力的新型方法 体外 HIV-1复制受以下因素影响的 gag 从感染C亚型的赞比亚人急性期样本中分离的基因。该方法利用限制性内切酶介导的克隆技术插入 gag 将基因插入常见的C亚型HIV-1前病毒骨架MJ4中。这使得该方法比以往基于重组、用于评估C亚型序列的研究方法更加适用于C亚型序列的研究 体外 慢性来源的复制 gag-pro 序列。然而，该方案可轻松修改，用于研究其他亚型的病毒。此外，本方案详细阐述了一种在基于CEM的T细胞系中评估Gag-MJ4嵌合病毒复制能力的稳健且可重复的方法。该方法已被用于研究来自149名赞比亚急性感染HIV-1亚型C个体的Gag-MJ4嵌合病毒，并有助于鉴定出影响病毒复制的Gag蛋白中的关键残基。更重要的是，该技术的应用促进了对病毒复制如何决定早期HIV-1致病特征（如病毒载量设定值和纵向CD4+ T细胞下降）的深入理解。

引言

确定影响 HIV-1 致病机制和疾病进展的宿主与病毒特征，对于合理设计疫苗至关重要。细胞免疫应答是人体对 HIV-1 感染免疫反应的关键组成部分。细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对于急性病毒血症的初始控制必不可少，并使宿主建立稳定的（设定点）病毒载量1,2。实验性清除这些效应细胞会导致病毒控制能力丧失3,4。尽管如此，病毒基因组中仍会出现逃逸突变，从而逃避CTL对病毒感染细胞的识别5-9。

某些HLA等位基因与较低的病毒载量和较慢的疾病进展相关，包括B*57、B*27和B*8110-15。HLA I类等位基因的部分保护作用可归因于它们靶向基因组中功能受限的区域（如Gag），并选择出降低病毒体外复制能力的逃逸突变in vitro16-21。尽管病毒在具有选择性HLA I类等位基因的宿主中逃避免疫系统对其有利，但这些突变在传播给HLA不匹配个体后，可能对宿主产生不同的影响22,23。因此，了解传播过程中HLA相关逃逸突变对病毒复制能力的影响，对于深入理解HIV-1早期致病机制具有重要意义。

尽管在识别和表征与特定HLA I类等位基因相关的单个逃逸突变的适应性缺陷方面已取得诸多进展24-29，但自然发生的HIV-1分离株具有独特且复杂的HLA相关多态性特征，这可能源于不同免疫遗传背景下的HLA介导免疫压力30。在先前的一项分析中，Goepfert et al. 发现，在来自88名急性感染赞比亚个体的传播Gag序列中，HLA相关突变的累积与病毒载量设定值的降低相关31。这表明，有害的逃逸突变（特别是在Gag中）传播至HLA不匹配的受体可带来临床益处，可能归因于病毒复制能力的减弱。未来，迫切需要研究自然发生分离株中复杂的Gag多态性组合如何协同作用，以决定传播病毒的特性（如复制能力），以及早期复制过程反过来如何影响HIV-1的临床参数和晚期致病过程。

Brockman 等 首次证明了复制能力与之间的关联 gag-pro C亚型和B亚型感染慢性期分离的序列与病毒载量32-35这些研究中提出的实验方法，尽管适用于考察 体外 从慢性感染者中获得的序列用于研究其复制能力时存在若干技术上的局限性和注意事项，这使得研究HIV-1亚型C在急性感染个体中的复制能力变得困难。该方法依赖于将基于群体的PCR扩增序列重组入亚型B的NL4-3前病毒中，而NL4-3部分来源于LAV，一种实验室适应性病毒毒株。36病毒的产生是通过将基于CEM的T细胞系进行共转染而实现的37 使用PCR扩增子和消化的delta-gag-pro NL4-3 DNA。该方法需要数周至数月的病毒扩增时间，可能导致所获得的病毒毒株在特性上偏离原始的病毒准种群。 体内，从而改变复制能力的测量结果 体外该方法更适合用于研究慢性感染者，因为在这些个体中能够有效筛选出复制能力最强的病毒，而从大量慢性感染者体内克隆出众多不同的病毒变异株则非常耗时耗力，因而不可行。然而，在急性感染个体中，通常仅存在一到两种病毒变异株，因此可消除因克隆过程导致回收病毒株组成偏倚的风险， 体外 选择压力，有助于更准确地评估 体外 复制能力。其次，该方法需要重组C亚型 gag-pro 将序列插入到B亚型衍生的骨架中，可能会在分析中引入骨架不兼容性偏差。由于这些局限性，必须分析大量序列，以克服可能引入的任何偏差。

本文描述了一种适用于研究来自C亚型急性感染个体序列的替代性实验方法。我们采用基于限制性内切酶的克隆策略，将从HIV-1 C亚型感染者急性感染期时间点获得的gag基因插入C亚型前病毒骨架MJ4中。使用MJ4作为克隆gag基因的通用骨架，对于分析源自C亚型的序列至关重要。MJ4来源于一个原代分离株38，因此更不易因骨架与gag基因之间的亚型不兼容而引入偏差。此外，基于限制性酶切的克隆方法使得前病毒构建体可直接转染至293T细胞，并能够获得与克隆的gag序列完全一致的单克隆病毒储备液。

以下方法是一种高通量评估C亚型来源的Gag-MJ4嵌合病毒复制能力的方法。将病毒转染至293T细胞操作简便，且病毒收获仅需三天。体外复制能力检测采用由Brockman 等37建立的相同基于CEM-CCR5的T细胞系，但引入了对C亚型MJ4嵌合病毒成功复制至关重要的实验方案改进。使用合适的T细胞系而非外周血单个核细胞（PBMCs），可实现对大量C亚型MJ4嵌合病毒进行高重复性的检测。最后，采用放射性标记逆转录酶活性检测法对上清液中的病毒进行定量，相比商业化的p24 ELISA试剂盒更具成本效益。该方法还具有更高的动态检测范围，这对于在同一实验中同时检测复制能力较弱和较强的病毒，以及检测不同分离株间复制能力的细微差异尤为重要。

综上所述，本文所提出的方法使得能够深入研究来自赞比亚HIV-1 C亚型急性感染个体的gag序列的复制能力，且按现有形式也可扩展用于研究其他C亚型感染人群。不同Gag分离株之间的复制能力表现出高度变异。此外，我们能够证明传播型Gag的复制能力与病毒载量设定点以及三年期间CD4+细胞下降之间存在统计学关联39。这些结果凸显了研究传播病毒特征（如复制能力）如何与宿主免疫系统相互作用并影响早期感染阶段致病机制的重要性，并将对开发有效的疫苗干预措施和治疗方案起到关键作用。

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方案

1. 从感染的冷冻血浆中扩增HIV-1gag基因

  1. 使用核酸提取试剂盒从 140 µl 解冻的 HIV-1 感染血浆中提取病毒 RNA。
    1. 在条件允许的情况下，RNA 提取后应立即进行 cDNA 合成，因为未冻存的病毒 RNA 可获得最佳扩增效果。如有可能，在病毒 RNA 提取前，先配制第一轮 DNA 扩增的 PCR 预混液，并将其保存在 4 °C。
  2. 利用逆转录酶和耐热 DNA 聚合酶，通过一步法 RT-PCR 从 RNA 逆转录合成 cDNA，并扩增第一轮 DNA 产物。
    1. 若需冻存，将 RNA 从 -80 °C 冰箱中取出，在室温下短暂解冻后立即置于预冷金属块上。将 5 µl RNA 转移至含有 45 µl 预混液的 PCR 管中，终体积为 50 µl。剩余 RNA 样品应立即放回 -80 °C 冰箱保存。
    2. 在向第一轮 PCR 预混液（表 1A）中加入酶后，按所需反应数将 45 µl 分装至各薄壁 PCR 扩增管中。务必使用带独立管盖的 PCR 管，而非联排管盖，以最大限度减少样本间的交叉污染。将 PCR 管置于预冷金属块上，以保护对温度敏感的逆转录酶和 RNA 模板。注意：为充分代表病毒准种，建议每个样本设置三个重复。此外，应选用具有高保真 DNA 聚合酶的产品，以尽量减少 PCR 过程中引入的错配。推荐产品请参见试剂列表。
    3. 在所有反应管中加入 RNA 模板后，将 PCR 管转移至热循环仪，按照 表 1B 所述程序进行扩增。注意：本步扩增产物将用于第二轮巢式 PCR。
  3. 进行巢式第二轮 PCR 扩增，以第一轮 PCR 扩增产物（1.2）的 1 µl 作为 DNA 模板。
    1. 按所需反应数，将 49 µl 第二轮 PCR 预混液（表 2A）分装至各薄壁 PCR 管中。从第一轮 PCR 扩增产物中取 1 µl 加入各反应管，终体积为 50 µl。注意：此产物将作为第二轮扩增的模板 DNA。同样，应选用具有极高保真度和校对功能的 DNA 聚合酶，以尽量减少 PCR 引入的错配。推荐产品请参见试剂列表。
    2. 将第二轮 PCR 反应体系转移至热循环仪，运行 表 2B 所述程序。注意：程序完成后，需将扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，以确认目标产物的生成。
  4. 向 50 µl 第二轮扩增反应体系中的 5 µl 产物中加入 3 µl 5× 上样缓冲液，在含紫外荧光 DNA 染料的 1% 琼脂糖-TAE 凝胶上以 120 V 电压电泳，直至条带清晰分离。在蓝光透射仪上观察 1.6 kb 条带（见 图 1A）。
  5. 将剩余的 45 µl 反应产物在含 DNA 染料的 1% 琼脂糖-TAE 凝胶上电泳，并用洁净的剃刀切下目标条带。
    1. 使用凝胶回收试剂盒从凝胶片段中提取 DNA，用无核酸酶水洗脱，将每个个体的三个阳性反应产物合并，于 -20 °C 冻存以备后续使用。

2. 通过引入必要的限制性酶切位点制备用于克隆的 gag 扩增子

  1. 扩增 MJ4 质粒的长末端重复序列（LTR）/5’ 非翻译区（UTR）片段（见表3）。
  2. 在照明仪上观察 1.3 kb 的 PCR 产物，切下阳性扩增片段，进行凝胶纯化并按前述方法冷冻保存（1.4,1.5；见图1B）。
  3. 通过"重叠延伸拼接" PCR 方法构建融合的 MJ4 LTR-gag 扩增片段（见表4）。
  4. 观察、切下、纯化并按步骤 1.4 和 1.5 的方法冷冻保存 3.2 kb 的扩增片段（见图1C）。

3. 将扩增的gag基因克隆至MJ4 A亚型感染性分子克隆中

  1. 消化1.5 µg MJ4质粒和1.5 µg纯化的LTR-gag 使用BclI（甲基化敏感）限制性内切酶在50 °C下孵育1.5小时进行PCR产物消化（见 表 5A).
  2. 加入1 µl NgoMIV至消化反应体系中，37 °C孵育1小时。
  3. 向限制性消化反应中加入5倍上样染料，将全部体积缓慢电泳至含DNA凝胶染料的1%琼脂糖-TAE凝胶中，100 V条件下电泳1–2小时。按照先前所述方法观察、切下并纯化目标条带用于克隆（参见 图2).
  4. 使用纯化的LTR制备连接反应gag 以3:1的插入片段与载体比例连接插入片段和MJ4载体DNA。在4 °C下孵育连接反应过夜（参见 表 5B).
  5. 将连接产物转化至JM109感受态细菌中，涂布于含100 µg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，30 °C培养22小时以上。
    1. 将JM109感受态细胞置于冰上解冻15分钟。标记1.5 ml微量离心管并置于冰上预冷。
    2. 将50–100 µl JM109细胞分装至预冷的1.5 ml微量离心管中。向JM109细胞中加入2.5–5 µl连接反应产物，轻轻弹击管壁混匀，立即放回冰上。将感受态细胞与连接产物在冰上孵育30 min。
    3. 将含有 JM109 感受态细胞和连接反应产物的 1.5 ml 微量离心管置于 42 °C 金属浴中热激 45 秒，随后立即放回冰上冷却至少 3 分钟。
    4. 向每个微量离心管中加入 50 µl SOC 培养基，将全部转化反应液接种至含有 100 µg/ml 氨苄青霉素的室温 LB-琼脂平板上。
    5. 将培养皿转移至30 °C培养箱中，孵育20小时，或直至菌落明显形成。
  6. 挑取单菌落，接种于含100 µg/ml氨苄青霉素的4 ml LB培养基中，30 °C培养22小时以上。
  7. 在 3,200 × g 离心 15 分钟收集菌体，倒去上清液，提取质粒 DNA。
  8. 为验证克隆保真度，使用 NgoMIV 和 HpaI 限制性内切酶对质粒小提 DNA 进行双酶切消化，37 °C 反应 2 小时。在 1% 琼脂糖-TAE 凝胶上进行分析（参见 表 5C).
  9. 使用以下引物对各质粒的LTR-gag插入区进行测序：GagInnerF1、GagF2、Rev1、Rev3和GagR6（表6以确认序列一致性。
  10. 将获得的克隆序列与来自1.5.1中初始纯化扩增子的群体序列进行比较。注意：最终必须评估两个独立克隆的复制能力，以确保任何观察到的差异并非由克隆过程中的随机变异所致 体外 复制表型并非由克隆过程中引入的载体骨架错误所致。

4. 复制能力型 Gag-MJ4 嵌合病毒的生成与滴定

  1. 使用Fugene HD，按照Prince et al39所述方法，以4:1的比例将1.5 µg嵌合型MJ4质粒小量提取DNA转染至293T细胞中，以产生具有复制能力的病毒。
  2. 按照以下步骤及Prince et al39所述方法，在TZM-bl细胞上滴定收获的病毒储备液。
    1. 在病毒感染前24小时，将TZM-bl细胞接种，使次日形成30–40%汇合度的单层细胞。通常可通过在24孔板中每孔加入5 × 104个细胞，总体积为800 µl来实现。
    2. 向孔中加入细胞后，轻轻前后移动24孔板，再左右移动，以有效分散细胞。切勿旋转摇晃——这会导致细胞聚集在孔中央。
    3. 次日，配制含1% FBS的DMEM培养基；该培养基将用于稀释DEAE-葡聚糖及病毒储备液。DEAE-葡聚糖储备液浓度为10 mg/ml（即125倍浓缩液），工作终浓度为80 µg/ml（即1倍浓度）。
    4. 从-80 °C冰箱中取出待测病毒储备液，置于摇床上室温解冻。
    5. 使用多通道移液器，在带盖的圆底组织培养处理96孔板中对病毒储备液进行连续稀释。本方案采用3倍梯度稀释法。稀释方案见表7。
    6. 使用真空抽吸装置移除已接种TZM-bl细胞的24孔板中的培养基，注意不要扰动细胞单层。每次仅移除一个24孔板的培养基，以防细胞干燥。
    7. 使用1,000 µl移液器，向每孔加入150 µl含1× DEAE-葡聚糖和1% FBS的DMEM混合液。请勿使用重复移液器，以免破坏细胞单层。
    8. 向对应孔中加入150 µl各病毒稀释液。将病毒加至孔中央，并轻轻旋转混匀，使病毒均匀分布于细胞单层表面。将感染后的细胞置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中孵育2小时。
    9. 2小时孵育后，向每孔加入0.5 ml含10% FBS的DMEM培养基，并将培养板放回孵箱继续孵育48小时。
    10. 48小时后，细胞应达到100%汇合。由于MJ4为具有复制能力的病毒，会出现一定程度的细胞死亡，此现象属正常预期。
    11. 移除每孔中的培养基，每孔加入400 µl固定液（配方见表8A）。每次仅固定一块板。使用1,000 µl移液器加入固定液，室温静置5分钟。
    12. 移除固定液，用含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤3次。使用冲洗瓶将PBS轻轻加至孔壁侧面，避免破坏细胞单层。第三次洗涤后，将板在吸水纸上轻拍至干燥。
    13. 向24孔板每孔加入400 µl染色液（配方见表8B），于37 °C孵育至少2小时。允许更长的孵育时间，但在不同滴定实验间应保持孵育时间一致。
    14. 用含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤2次后直接计数感染情况，或加入PBS后于4 °C保存以备后续计数。只要保持细胞单层湿润，培养板可在4 °C保存最多四天。
    15. 计数感染情况时，使用永久性记号笔将24孔板的每孔划分为四个象限。在200倍总放大倍数下，对每个孔的四个象限分别计数视野内所有蓝色细胞。
    16. 按以下公式计算每微升的感染单位（IU/µl）：[(每孔蓝色细胞数/4) × 67] /（加入的病毒体积 µl）= IU/µl。加入每孔的病毒体积（µl）请参见表8C。应合并多个孔的数据取平均值；为获得准确滴定结果，各孔数值应较为接近。

5. GXR25 细胞培养基的制备与扩增 体外 复制实验

  1. 准备用于扩增 GXR25 细胞的完全 RPMI 培养基（cRPMI）。注意：计划进行重复实验前，必须至少提前 4 个月培养 GXR25 细胞（见表 9）。
  2. 每周以 1:10 的比例传代两次，并将细胞密度维持在 1 × 105 至 2 × 106 个细胞/ml 之间。

6. 体外 Gag-MJ4 嵌合体在 GXR25（CEM-CCR5-GFP）细胞中的复制

  1. 感染前一天，将细胞传代至浓度为 2–3 × 105 个细胞/ml，使其在感染当天处于对数生长期。
  2. 感染当天，从 -80 °C 冰箱中取出病毒储备液并解冻。根据 TZM-bl 细胞检测所得的病毒滴度（IU/µl），使用以下公式计算感染 5 × 105 个 GXR25 细胞（感染复数为 0.05）所需的每种病毒储备液的体积：
    感染所需病毒体积（µl）= 1 µl/X IU × 0.05 × 500,000
    注意：我们选择 0.05 的感染复数（MOI），因为该条件可使我们测试的所有病毒均呈现对数生长阶段。建议首先开展预实验，以确定待测病毒实现对数生长的最佳 MOI。
  3. 将病毒用 cRPMI 培养基稀释至 100 µl 体积（以达到 0.05 的 MOI），加入至经组织培养处理的 V 型底 96 孔板的孔中。注意：每次复制实验均需设置阳性对照（MJ4 WT 感染）和阴性对照（模拟感染细胞）。设置实验板时，每隔一列留空，以减少孔间交叉污染。阳性对照至关重要，后续将用作标准化参照，以校正反映实验重复组病毒复制速率的复制斜率。
  4. 使用自动细胞计数仪对 GXR25 细胞进行计数。计算所有感染实验所需细胞总数（5 × 105 × 感染孔数）。将所需体积的细胞悬液转移至 50 ml 锥形管中，离心以收集细胞沉淀。始终按比实际所需多 25% 的感染数量进行计算。
  5. 小心吸除培养基，将细胞重悬于 cRPMI 培养基中，调整浓度为 5 × 105 个细胞/100 µl。
  6. 用移液器将细胞转移至无菌槽中并充分混匀。使用多通道移液器，将 100 µl 细胞悬液加入含稀释病毒的 96 孔板各孔中，充分混匀。
  7. 向每孔中加入 2 µl 的 5 mg/ml（100 倍浓缩）聚凝胺（polybrene）溶液，并充分混匀细胞。
  8. 将培养板置于含 5% CO2 的组织培养孵箱中，37 °C 培养 3 小时。
  9. 为洗涤感染后的细胞，将 96 孔 V 型底板离心以收集细胞沉淀。小心吸除 150 µl 培养基，加入 150 µl 新鲜 cRPMI 培养基，避免扰动细胞沉淀。重复此洗涤步骤两次（包括离心），以充分去除残留病毒和聚凝胺。
  10. 最后一次离心并加入 150 µl cRPMI 后，用多通道移液器将各孔中的细胞沉淀充分重悬，并将每孔的全部细胞-病毒混合液（约 200 µl）分别转移至 24 孔组织培养板的各孔中，每孔预先加入 800 µl cRPMI 培养基。
  11. 将 24 孔板置于 37 °C、含 5% CO2 的组织培养孵箱中继续培养。
  12. 每隔两天，从培养孔表面吸取 100 µl 上清液，转移至 96 孔 U 型底板中，并于 -80 °C 冻存，待进行病毒定量检测。注意：合理安排 96 孔板中上清液的位置，可在后续通过放射性标记的逆转录酶（RT）活性检测对病毒颗粒进行定量时，使用多通道移液器进行高效转移。每块检测板均应包含一个感染标准品样本，以校正 RT 检测中不同板之间的信号差异。
  13. 每次取走 100 µl 上清液后，将细胞按 1:2 比例传代：充分重悬细胞后，移除剩余体积的一半（450 µl），并向每孔中加入 550 µl 新鲜 cRPMI 培养基，恢复至原始体积（1 ml）。

7. 细胞培养上清液中逆转录酶（RT）的分析

方案改编自 Ostrowski 等40。

  1. 在BSL-3设施中为使用放射性材料设置生物安全柜。
    1. 在安全柜内铺设吸水纸，并更换专用于放射性操作的抽吸装置。注意：所有放射性废物必须按照安全规定妥善处理。
  2. 向每1 ml RT主混合液（参见表10及Ostrowski et al.40）中加入1–2 µl浓度为10 mCi/ml的[α-33P] dTTP和4 µl 1 M二硫苏糖醇（DTT）。
  3. 使用1,000 µl移液器小心混匀每支含RT主混合液、DTT和[α-33P] dTTP的1.5 ml微量离心管，然后转移至无菌槽中。
  4. 将标记好的RT混合液各25 µl分装至96孔薄壁PCR板的每个孔中。注意：需预留阳性对照（MJ4 WT感染）和阴性对照（模拟感染）的位置。
  5. 向含有RT主混合液的PCR板各孔中加入5 µl上清液。
  6. 用自粘性铝箔封膜密封PCR板，并在热循环仪中37 °C孵育2小时。出于安全考虑，使用Amphyl冲洗移液器吸头，并将吸头弃入盛有Amphyl废液的小容器中，随后统一作为放射性废物处理。
  7. 孵育后，使用200 µl多通道移液器在铝箔封膜上打小孔。注意：若移液器吸头接触孔内液体，则在移至下一列或行前必须更换吸头。
  8. 将样品上下吹打混匀5次，然后将每份样品各5 µl转移至DE-81滤纸。室温晾干10分钟。
  9. 用1x SSC（氯化钠-柠檬酸钠缓冲液）洗涤印迹5次，每次5分钟，再用90%乙醇洗涤2次，每次5分钟。晾干。
    1. 将每张印迹单独放入一个洗涤容器（如三明治储存盒）中，加入足量洗涤缓冲液（1x SSC或90%乙醇）以浸没印迹，摇床洗涤5分钟。
    2. 将洗涤缓冲液倒入专用容器并重复操作。注意：前3次洗涤液具有放射性，应妥善处理；后2次洗涤液可按常规方式废弃。
  10. 印迹干燥后，小心用保鲜膜包裹，并在室温下置于密闭暗盒中与磷光成像屏过夜曝光。
  11. 使用磷光成像仪分析磷光屏，并定量放射性转录产物。
  12. 使用OptiQuant软件在每个放射性信号周围画圈，绘制数字光单位（DLU）值以生成复制曲线。
  13. 为计算复制能力评分，对DLU值进行以10为底的对数转换（log10），并利用第2、4、6天的时间点计算斜率。然后将各复制斜率除以WT MJ4的斜率，从而获得复制能力评分。重要的是，应基于同一批RT板中获得的MJ4 WT数值进行归一化处理，以降低实验内变异。

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结果

为正确执行本方案——该方案旨在构建能够组装出具有完全功能、具感染性的Gag-MJ4嵌合体的前病毒质粒——必须极为谨慎地生成适当的PCR扩增产物。判断PCR是否生成了大小正确的gag扩增产物至关重要。产物大小应在约1,700 bp扩增子（如图1A所示）的100个碱基对(bp)范围内。该片段的精确长度会因所研究的gag基因而异。接下来，必须扩增MJ4分子克隆的5'长末端重复序列(LTR)部分，并将其与gag扩增子拼接，以便进行后续克隆。MJ4 LTR扩增子长度应为1,474 bp。图1B展示了一张代表性凝胶图像，其中标明了正确的条带大小。在完成拼接重叠延伸PCR41后，组合的LTR-gag产物长度应约为3,200 bp，如图1C所示。

一旦通过将 gag 基因与来自 MJ4 的 5' LTR（其含有必要的 NgoMIV 限制性酶切位点）融合，使其适合克隆后，载体和 g...

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讨论

由于本实验方案篇幅较长且具有较强的技术性，因此在嵌合型 Gag-MJ4 质粒的构建以及病毒复制能力的定量分析过程中，有多个步骤至关重要。尽管本方案中所述的利用限制性内切酶介导的克隆策略将外源 gag 基因插入 MJ4 的方法相较于先前使用的基于重组的方法具有诸多优势，但如果未能严格遵循关键步骤，该实验仍可能在技术上具有挑战性。

首先，必须使用在缺乏 dcm 和 dam DNA 甲基化酶的感受态细菌菌株中制备的 MJ4 质粒 DNA。这是因为用于将 gag 基因克隆至 MJ4 载体骨架中的 BclI 限制性内切酶的酶活性对 dam/dcm 甲基化敏感。JM110 和 SCS110（一种 endA 缺失的 JM110 衍生菌株）E. coli 菌株适用于制备未甲基化的 MJ4 质粒 DNA。此外，在切取载体和插入片段条带时，强烈建议使用蓝光透射仪进行观察。这可减少紫外线波长依赖性的 DNA 损伤，显著提高克隆效率。若无蓝光透射仪，可通过使用 SYBR Safe DNA 凝胶染料替代溴化乙锭对 DNA 进行染色，并尽量缩短紫外线暴露时...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

研究人员感谢所有在赞比亚参与本研究的志愿者，以及位于卢萨卡的赞比亚埃默里艾滋病研究项目的所有工作人员，正是他们的努力使本研究得以实现。研究人员特别感谢 Jon Allen、Smita Chavan 和 Mackenzie Hurlston 在技术协助和样本管理方面提供的支持。我们还要感谢 Mark Brockman 博士在讨论中的贡献以及慷慨提供 GXR25 细胞。

本研究由 R01 AI64060 和 R37 AI51231（EH）以及国际艾滋病疫苗倡议组织资助。本工作的完成部分得益于美国人民通过美国国际开发署（USAID）提供的慷慨支持。 研究内容由研究作者负责，不一定反映 USAID 或美国政府的观点。本工作还部分得到了埃默里大学艾滋病研究中心病毒学核心（资助编号 P30 AI050409）的支持。DC 和 JP 部分由 Action Cycling 奖学金支持。本工作还部分得到了耶基斯国家灵长类动物研究中心基础拨款（2P51RR000165-51）的支持。本项目还部分由国家研究资源中心 P51RR165 资助，目前由研究基础设施项目办公室/OD P51OD11132 提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>PCR 试剂
GOF：5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
VifOR：5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
GagInnerF1：5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
BclIDegRev2：5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
MJ4For1b：5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
MJ4Rev：5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
BclIRev：5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
GagF2：5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
For3：5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
GagR6：5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
Rev3：5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
Rev1：5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT DNA定制寡核苷酸25 nmol，标准脱盐
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
无核酸酶水FisherSH30538FS由 Hyclone 生产
QIAamp病毒RNA小型试剂盒Qiagen52906
Simport PCR 8联管，蓝色（平盖）DaiggerEF3647BX
SuperScript III 一步法 RT-PCR 系统Life Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II DNA聚合酶FisherF-549L
PCR 核苷酸混合物罗氏4638956001
琼脂糖，高凝胶强度Fisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb DNA LadderFisherPRG5711由 Promega 生产
Sybr Safe DNA凝胶染料，10,000倍稀释液Life Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV 凝胶与 PCR 纯化系统PromegaA9282
单边刀片Fisher12-640由 Surgical Design 生产
Thermocycler，PTC-200MJ Research
<强>微生物学 &和克隆试剂
LB 琼脂，MillerFisherBP1425-2
LB培养基，Lennox配方FisherBP1427-2
无菌 100 x 15 mm 聚苯乙烯培养皿Fisher08-757-12
氨苄青霉素钠盐Sigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml 聚丙烯圆底管BD 生物科学352059
NgoMIV 限制性内切酶New England BioLabsR0564L
BclI 限制性内切酶New England BioLabsR0160L
HpaI 限制性内切酶New England BioLabsR0105L
T4 DNA连接酶，5 U/μLμl罗氏10799009001
JM109 感受态细胞， >108 cfu/μgPromegaL2001
PureYield 质粒小提系统PromegaA1222
Safe Imager 2.0 蓝光透射仪InvitrogenG6600
Microfuge 18 离心机贝克曼库尔特367160
<强>细胞培养试剂
Amphyl 清洁剂/消毒剂Fisher22-030-394
Fugene HD，1 mlVWRPAE2311由 Promega 生产
六亚甲基溴化铵（Polybrene）Sigma-AldrichH9268-5G
Costar 培养板，6 孔，平底Fisher07-200-83由康宁生命科学生产
Costar 培养板，24 孔，平底Fisher07-200-84由康宁生命科学生产
Costar 96孔圆底板Fisher07-200-95由康宁生命科学生产
锥形瓶，康宁滤盖/斜颈，75 cm²2Fisher10-126-37
锥形瓶，Corning 带滤膜瓶盖/斜颈，150 cm²2Fisher10-126-34由康宁生命科学生产
锥形管，50 ml，蓝色盖帽Fisher14-432-22由 BD Biosciences 生产
15 ml 圆锥形管，蓝色盖Fisher14-959-70C由 BD Biosciences 生产
胰蛋白酶-EDTAFisherMT25052CI由 Mediatech 生产
RPMI，500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM，500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
青霉素/链霉素/谷氨酰胺，100倍浓缩液Life Technologies/Invitrogen10378-016
含镁和钙的 PBS，500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
不含镁和钙的 PBSLife Technologies/Invitrogen20012-050
Sarstedt 管，多种颜色Sarstedt72.694.996
55 ml 多通道储液槽Fisher13-681-501
DEAE-葡聚糖FisherNC9691007
康宁96孔透明V型底组织培养处理微孔板Fisher07-200-96由 Corning Life 生产
HEPES，1 M 缓冲液Life Technologies/Invitrogen15630-080
FBS，定义型，500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941由 Promega 生产
戊二醛，II 级，25% 水溶液2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M 氯化镁溶液Sigma-AldrichM1028-100ML
甲醛溶液，分子生物学用，36.5%Sigma-AldrichF8775-500ML
三水合六氰合铁(II)酸钾Sigma-AldrichP9387-100G
铁氰化钾(III)Sigma-AldrichP8131-100G
Allegra X15-R 离心机贝克曼库尔特392932
TC10 自动细胞计数仪伯乐（Bio-Rad）1450001
VistaVision 倒置显微镜VWR
<强>逆转录酶定量检测实验试剂
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl，pH 8.0Life Technologies/Invitrogen15568025必须用KOH调节至pH 7.8
2 M 氯化钾（KCl）Life Technologies/InvitrogenAM9640G调节至 1 M 溶液
0.5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40罗氏11333941103
多聚腺苷酸钾盐（Poly rA） Midland Reagent Co.P-3001
寡核苷酸dT引物Life Technologies/Invitrogen18418-012
二硫苏糖醇（DTT）Sigma-Aldrich43815-1G
SR，超分辨率磷光屏，小型Perkin-Elmer7001485
康宁科斯特 Thermowell 96 孔板，型号 (M)，聚碳酸酯材质Fisher07-200-245由康宁生命科学生产
康宁96孔微孔板铝封膜，非无菌Fisher07-200-684由康宁生命科学生产
DE-81 阴离子交换滤纸Whatman3658-915
二水合柠檬酸三钠Sigma-AldrichS1804-1KG
氯化钠FisherS671-3
放射自显影盒FisherFB-CA-810
旋风式存储磷屏帕卡德

参考文献

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