脂质双层囊泡代使用微流控喷射

摘要

对液滴界面脂双层微流体喷射提供了一种可靠的方法来产生囊泡膜多不对称，跨膜蛋白的结合，以及材料的封装控制。该技术可用于研究多种生物系统，其中隔离的生物分子是理想的。

摘要

自下而上的合成生物学提出了一种新的方法来调查和重构生化系统和潜在的，最小的生物。这一新兴领域从事工程师，化学家，​​生物学家和物理学家来设计和组装基本生物成分为复杂的，功能从下往上的系统。这种自下而上的系统可能导致人造细胞的基本生物学查询及创新疗法^1,2的发展。巨型单层囊泡（GUVs）可以作为一个模型平台合成生物学，由于其细胞样膜的结构和尺寸。微流喷射，或microjetting，是一种技术，它允许GUVs具有控制尺寸，膜组成，膜蛋白掺入和封装³的生成。该方法的基本原理是利用由压电致动器的喷墨变形暂停升产生多个高频流体脉冲IPID双层成GUV。该过程类似于从肥皂膜吹肥皂泡。通过改变喷出的溶液中，涵盖溶液的组成和/或各组分的组合物包括在双层中，研究人员可以应用这种技术来创建定制的囊泡。本文介绍的程序通过microjetting生成简单的小泡从液滴界面双层。

引言

它已成为越来越明显，细胞生物学是涉及整合我们的理解从分子到细胞的多尺度问题。因此，知道分子正是如何独立工作并不足以理解复杂的细胞行为。这部分是由于多组分系统的涌现行为的存在，作为例证的肌动蛋白网络的互动与脂质双层囊泡^4，有丝分裂纺锤体组装在非洲爪蟾的重建中提取^5，和细菌细胞分裂机械⁶空间动态。补充解剖生命系统的分子过程的还原论的方法的一个办法是采取重构的细胞行为使用一组生物成分最小的相反的做法。这种方法的一个关键部分涉及生物分子在一个密闭容积可靠的封装，细胞的一个关键特征。

e_content">几种策略，用于封装的生物分子为研究仿生系统存在，最生物学相关的系统是脂质双层膜，它模仿了细胞的质膜上施加的生化和物理约束。巨单层囊泡（GUVs）由electroformation ⁷组，最广泛使用的技术GUV代¹⁴之一，通常具有差的包封收率，由于其不兼容的高盐缓冲液^{8。Electroformation}也需要大体积样品（> 100微升），这可能是一个问题，用纯化的蛋白加工和低效地结合由于紧密间隔的脂质层之间扩散的难度大的分子。已经开发了几种微流体方法，用于产生脂质囊泡的双乳剂的方法，它通过多层水 - 油 - 水之间的两个接口传递部件（W / O型/ W）时，依赖于一个VO的蒸发latile溶剂驱动脂质双分子层形成^9。他人已经使用产生的脂质双层囊泡¹⁰或在两个独立的步骤¹¹的连续流微流体装配线。我们已经开发了基于快速应用流体脉冲对液滴的界面双层¹²生产控制规模，组成和封装GUVs的替代技术。我们的做法，被称为微流控喷射，提供了从现有几个小泡生成技术的综合优势，为创建功能生物分子系统研究各种生物问题的方法。

方案

1。无限制造商会

1. 设计的无穷室使用电脑辅助设计（CAD）软件（命名为它的形状），然后保存文件，这样它是用激光切割机兼容。在由中心到中心的距离的0.15英寸在透明的丙烯酸用激光切割器切割腔室从1/8- 3/16创建这种形状，直径0.183分开两个圆。无穷大的形状有利于液滴界面双层的形成和稳定。
2. 通过丙烯酸系室的边缘钻一个1/16英寸的孔到无穷大形井。重复的相反侧。切离为0.2mm的丙烯酸板用剪刀或激光切割器，以充当一个底部至孔中的小矩形。
3. 涂上薄薄但完整层的快干粘合剂，以0.2mm的丙烯酸类的一侧，并且它粘附到所述腔室的底部。持紧密代替0.2毫米丙烯酸对腔室的底部和分配胶在界面以允许胶以形成密封，但避免覆盖可视面积。一定要对齐丙烯酸，使其边缘与室壁的边缘齐平，它完全覆盖了无穷室缺口。这将允许足够的射流穿透和防止井漏。
4. 切成两小块天然橡胶的覆盖钻孔。孔周围施加快干粘合剂。将橡胶过孔，然后按上所有区域有一对钳子固定的。重复这两个钻孔。确保所有胶合连接完成密封，以防止任何泄漏。
5. 在针使用23 G，1，戳在腔室的两侧中的天然橡胶的孔，以便插入在压电喷墨头的。

2。实验准备

在氯仿在-20℃下冷冻储存股票脂质的解决方案。在这项研究中，无论是1,2 - diphytano基-sn-甘油基-3 -磷酸胆碱（DPhPC）或1,2 -二油酰-sn-甘油基-3 -磷酸胆碱（DOPC）中的使用。 2毫升25毫克/毫升脂质溶液通常制备在本协议中并储存在-20℃下时，将持续两个月

1. 重悬脂中的正癸烷中，首先从一个股票的小瓶将其传送到一个小的玻璃瓶中，并在氩气或氮气轻轻擦干。握住瓶子成一角度而干燥，从而暴露更多的表面积与气体，从而使脂质干燥更快。
2. 只略微拧在瓶子的盖子，让干燥的溶液中，以在真空下坐于干燥器中1-2小时。然后加入正癸烷再溶解脂质在25毫克/毫升。涡流脂质溶液短暂超声处理它在水浴超声15分钟。存储在正癸烷的重组脂质在-20℃下
3. 准备一只股票的蔗糖溶液。在1.5毫升微量离心管中，加入900微升300mM的蔗糖和100微升的1％甲基纤维素（MC）。甲基纤维素中加入，以使溶液，这有助于喷射的粘度。可选步骤:添加一个可选的1微升的深色食物染料或荧光珠，借出更多的对比度或荧光成像分别。该解决方案是一个300毫渗量的蔗糖溶液，设计用于蜂窝渗透压和microjetting期间提供的对比。
4. 绘制溶液倒入一次性1毫升塑料注射器。握住注射器针尖朝上，反复轻弹轴驱逐向着尖端任何气泡，并推动柱塞弹出被困空中。一定要撤离所有空气，然后再继续注射器，因为它会与适当的压电收缩负责喷射干扰。
5. 在注射器的端部安装一个0.22微米的过滤器。以防止空气被截留在过滤器中，垂直握住注射器和推动柱塞，直到液滴的顶端的上方形成。注意:33毫米直径的注射器过滤器单元被发现工作情况最好，但也可用于替代过滤小至3毫米直径的注射器过滤器，以减少死体积。
6. 拧开喷墨的阴路厄接头，并牢固地压在适当位置在过滤器的端部。同样，喷射流体，以防止截留的空气。旋入喷墨的顶部。流体应行进到喷墨的前端之后它完全附着。

3。准备好装备

1. 使用v型钳，安装在显微镜载物台的注射器组件。从喷墨连接导线到喷墨控制器。注:自定义阶段是专为这个协议，而舞台设计可以由用户来决定，它有注射器和样品架的XY控制的独立XYZ控制是至关重要的。
2. 确定放大率和必要的透镜组合来实现期望的成像。在这里，一个10倍的目标和10X目镜使用。
3. 使用高速摄影机（≥1000帧），以形象化的喷射和囊泡的生成。在此之前成像，进行必要的摄像机标定。利用相机软件中基于图像的自动触发启动图像捕捉。
4. 安装无穷室到显微镜载物台。通过录音到位的舞台上固定室。
5. 小心地将喷墨针尖刺破用在天然橡胶的孔（参见图1b）。要做到这一点，把喷墨靠近腔和调整由眼定位，然后通过显微镜镜头进行更为精确的调整。步步为营，因为粗动作可能会损坏喷墨一角。
6. 一旦喷墨对齐，备份注射器组件远离该腔室，以防止装在井的过程中喷墨的任何损坏。肯定的是，喷墨的运动是单向的，使得它保持与膜中的孔对准。
7. 轻轻按下plun注射器组件的GER直到小液滴形式的喷墨喷嘴。这将提供一些初始背压。
8. 输入喷射参数。对于双极性梯形波，请使用以下参数:20 kHz脉冲频率，3微秒的上升时间，35微秒的脉冲持续时间，3微秒的下降时间，65 V外加电压（脉冲幅度），并触发每100喷气脉冲（脉冲数） 。然而，所施加的电压（脉冲幅度）和脉冲数（每个触发喷射脉冲）可以变化，以控制泡囊的尺寸。

4。囊泡生成

1. 添加悬浮于正癸烷的无穷室25-30微升脂质溶液，覆盖两孔的全部表面上。
2. 加25μl的葡萄糖（同渗容摩为蔗糖溶液）的一个孔中，移液缓慢而平稳的最外边缘。当沉积，减少葡萄糖的形成应​​该的，因为血糖和血脂的解决方案不要混用。添加另一个251; l葡萄糖的相对良好，这将使得再次下降，并在5-10分钟，形成在腔室中部的脂双层膜。
3. 插入喷墨穿过天然橡胶，并小心地引导它向着液滴界面双层。接近双层慢慢地，随着引进喷墨将取代量和断裂能的双层。
4. 当喷墨内〜200微米，适用于喷射与步骤3.8中所述的设置。从双层的距离可以变化，主要取决于电压和脉冲数，除其他参数。本协议建议缓慢增加设置（​​电压和脉冲数），并观察双层变形。

5。清洁设备

1. 从显微镜载物台取下注射器组装，并处理1毫升的塑料注射器和过滤器。
2. 要清洁喷墨，浸渍尖端的solutio吸，以下列解决方案ñ7-10x的各:70％乙醇，2％Neutrad在温水中，70％的乙醇和双蒸₂ O溶液如果喷墨不会对吸液管牢固地配合，切枪头，以形成一个变压器。
3. 干燥室与组织。将无穷室在250毫升烧杯中，用2％体积/体积Neutrad在温水中，并超声处理5-10分钟。超声处理后，彻底干燥下的压缩空气的水井。任何水分的井可以妥协的脂双层膜的稳定性，因此它也被建议该室被置于烘箱中在60℃下持续15分钟。

结果

我们已经组建了一个微流体喷射建立在传统的倒置荧光显微镜用自定义的阶段，从加工零件和人工微米组装（ 图1）。喷墨表征提供了洞察囊泡生成过程。不同的喷墨喷嘴和脂质双分子层之间的距离会影响所施加的力，以使膜的变形。靠近双层聚焦的喷流，并防止所述膜从分散能量相差囊泡产生点。涡流行程随施加到压电致动器，与我们的预期（ 图2）相一致的电压。囊泡形成和有代表性的喷出泡示于图3。图3a示出由microjetting为囊泡形成一个代表图像序列。下面形成，囊泡稳定性趋于随泡地径r，其中小囊泡更稳定。

图1:插图的技术和设备。

讨论

许多技术已被开发为小泡的产生，包括electroformation，乳液和微滴产生^14〜16。然而，新的实验技术是必要的，以允许生物系统的不断增长的相似度来生活系统的设计。特别是微流控方法都提供控制水平的增加管膜unilamellarity，尺寸的单分散性和内部内容^17,18，使泡囊模型更接近生物学。此外，使用微流体喷射特性和实验表明定向膜蛋白的有效结合，膜的不对称性，以及封装^3,13。

这种技术很简单，但包含了一些措施，其中应采取谨慎。无论是亚克力板材和天然橡胶必须形成制造过程中的无穷室完全密封。否则，无边形井将泄漏和rISK双分子层的稳定性。在实验准备，研究者必须确保完全排空空气的注射器组装，最初并附带每个组件之后。此组件内的气泡造成射流内的可压缩体积和减轻或否定的压电致动器的喷射效果。同时准备好设备，主要关注的是损害脆弱的喷墨喷嘴。最后，葡萄糖的沉积需要最关注中囊泡代前面的步骤，因为这建立了后续喷射脂质双分子层。

囊泡代微流体喷射可靠和可重复的，但是，喷墨...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
压电式喷墨	MicroFab Technologies	MJ-AL-01-xxx	xxx 表示孔径，单位为微米
Jet Drive III 控制器	MicroFab Technologies	CT-M3-02
高速相机	Vision Research	MiroEX2
DPhPC 脂质，溶于氯仿	Avanti	850356C	瓶装
33 mm PVDF过滤器，0.2 和微量;m	Fisher Scientific	SLGV033RS
1 ml 注射器	Fisher Scientific	14823434
正癸烷	Acros Organics	111871000
葡萄糖	Acros Organics	410950010
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903-1KG
甲基纤维素	Fisher Scientific	NC9084958
可根据要求提供 1/8 英寸丙烯酸	McMaster Carr	8560K239	无限形腔室的 CAD 设计
0.2 毫米 丙烯酸	Astra 产品	Clarex clear 001
丙烯酸水泥	TAP 塑料	10693
乐泰 495 强力胶	Fisher Scientific	NC9011323
乐泰 3494 UV 增强胶粘剂	Strobels供应	30765
天然橡胶	McMaster Carr	85995K14
定制舞台	自制	N/A	CAD 设计可根据要求提供