从子宫切除标本中建立原代人子宫内膜基质细胞的两种方法

摘要

从子宫切除标本中建立原代子宫内膜基质细胞培养体系是一种有价值的生物学技术，也是开展多种研究目标之前的关键步骤。本文中，我们描述了两种用于从人患者手术切除的子宫内膜组织中建立基质细胞培养的方法。 

摘要

人们已投入大量努力来建立体外（in vitro）细胞培养系统，这些系统旨在模拟多种体内（in vivo）过程。来源于人子宫内膜样本的细胞培养系统也不例外，其应用范围涵盖正常的周期性生理过程，到诸如妇科癌症、感染性疾病和生殖功能障碍等子宫内膜病理状态。本文提供了两种从手术切除的子宫内膜子宫切除标本中建立原代子宫内膜基质细胞的方法。第一种方法称为“刮取法”，通过手术刀或剃刀进行机械刮取；第二种方法称为“胰蛋白酶法”，利用胰蛋白酶的酶活性促进细胞分离和原代细胞的生长。我们通过数字图像和显微镜图像展示了每一步操作的详细方法，并提供了通过定量实时聚合酶链式反应（qPCR）和免疫荧光（IF）对子宫内膜基质细胞系进行鉴定的示例。

引言

人类子宫体由三层组成，即外膜（或浆膜）、肌层和内膜。区分这三层是建立内膜细胞系的重要步骤。外膜是子宫的最外层，由一层薄的浆液性细胞构成。肌层是子宫较厚的中层，由平滑肌细胞组成。内膜为子宫的内层，包含上皮细胞和间质细胞群体。

子宫内膜进一步分为基底层，其干细胞群体被认为大约每28天重新填充功能层 ¹人类子宫内膜的功能层会因循环激素的作用而发生显著的生化和形态学变化。这些激素来源于垂体和卵巢。

激素的协调产生与释放导致生殖周期的发生。生殖周期旨在使子宫内膜为潜在的胚胎着床做好准备。在人类中，生殖周期被称为“月经周期”，并分为三个阶段——增殖期、分泌期和月经期。增殖期涉及子宫内膜功能层的增殖，而分泌期则以功能层的成熟为特征。具体而言，细胞外结构的改变、分泌物的产生以及细胞分化提示可能发生着床。如果在分泌期末期之前未发生着床，子宫内膜功能层将在月经期脱落。关于月经的重要性及其触发功能层脱落的具体事件，目前仍在讨论之中。在人类中，有观点认为月经是分泌期中期一种特定分化事件的结果，该事件被称为“自发性蜕膜化”。 ²在本论文中，我们提供了两种子宫内膜基质细胞分离方法的详细操作流程，并结合免疫荧光与数字图像技术，展示这些方法的有效性。此外，我们应用了一种常用 体外 自发性蜕膜化模型以验证子宫内膜基质细胞的分离。

方案

本手稿所使用的子宫切除标本均根据大学机构审查委员会批准的伦理协议（编号：IRB-HSR #14424）收集。

1. 来自临床来源的样本采集

1. 在开始之前，获取政府和机构的伦理指南及批准文件。
2. 所有步骤均需在无菌条件下进行。
3. 若样本无法立即进行培养，应将患者来源的组织保存在培养基（RPMI 或 DMEM/High Glucose）中，置于 50 ml 离心管内，4 °C 保存。样本在此状态下最长可保存 24 小时。
4. 用 1X 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织样本三次，每次清洗后弃去上清液。

2. 使用刮取法制备原代细胞系

1. 向组织中加入 4-10 ml 生长培养基（RPMI 或 DMEM/高葡萄糖，添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素），并加入 Fungizone（终浓度为 0.25 µg/ml），作用 30 分钟。
2. 弃去生长培养基。
3. 用 1X PBS 洗涤组织两次。
4. 将组织置于 6 cm 细胞培养皿中，以区分肌层与内膜层 （参见图 2A-2C 以获取进一步说明）。分离出内膜组织。
5. 使用手术刀或剃须刀片在 6 cm 细胞培养皿表面刮擦的同时将组织切成小块。这些刮痕有助于原代子宫内膜细胞的贴壁。与胰酶消化法相比，此方法需要更多的组织 （参见图 2D 以了解大致用量）。
6. 轻柔地向已刮擦的培养皿中加入 2 ml 生长培养基（组织碎片应可见，并因刮擦动作而理想地固定）。
7. 将培养皿转移至指定的细胞培养孵育箱中（37 °C，5% CO₂）。为原代细胞系指定专用区域，远离其他细胞培养皿。原代培养物对感染和污染更为敏感。
8. 每天在光学显微镜下观察细胞。通常在第 2 至第 3 天，可见少量细胞从切开的组织周围开始出现 （参见图 3B）。
9. 为维持培养，每三天用 1X PBS 轻柔洗涤一次，并更换新鲜生长培养基（2 ml）。当细胞增殖速度加快时，可向 6 cm 培养皿中添加更多生长培养基（3-4 ml）。
   注意：在洗涤和换液过程中，组织碎片可能被吸走。这不会影响贴壁细胞的生长。在后续步骤（2.10）中应将组织碎片吸除，因为一周后几乎不会再有新的细胞克隆出现。
10. 当 6 cm 培养皿中的细胞融合度达到约 75–80% 时 （参见图 3B），使用 0.05% 胰酶进行传代。原代细胞无法无限传代——一旦维持了两到三个培养皿的细胞，应立即冻存一个培养皿的细胞。如需更多传代次数，请遵循永生化实验方案（见参考文献³综述）。

3. 使用胰蛋白酶法准备原代细胞系

1. 取一小块子宫内膜组织 （见图2D作为参考），放入含有0.25%胰蛋白酶和卡那霉素（终浓度0.03 mg/ml）的2 ml溶液中。
2. 将组织置于37 °C、旋转平台上孵育30分钟。
3. 短暂涡旋振荡组织。
4. 以200–400 ×g离心2分钟 ，弃去上清液。
5. 加入新鲜的胰蛋白酶和卡那霉素。
6. 将组织在37 °C下旋转孵育1小时。
7. 涡旋振荡组织5–10秒。
8. 加入2 ml生长培养基（添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素），以灭活胰蛋白酶。
9. 以200–400 ×g离心细胞2–3分钟。
10. 弃去上清液，并向细胞沉淀中加入2 ml生长培养基。
11. 接种至6 cm细胞培养皿中。无需执行使用刮取法制备原代细胞系中第2.5步的刮皿操作，但该操作可增强原代细胞的贴壁和生长。
12. 每日在光学显微镜下观察细胞。通常在24–48小时后可在光学显微镜下观察到细胞 （见图3C）。
13. 为维持培养，应定期观察细胞，并参照第2.9步，每2–3天更换一次培养基。
14. 传代细胞时，当细胞融合度达到75–80%时，使用0.05%或0.25%胰蛋白酶进行消化 （见图3C）。

4. 为分析保存额外组织（速冻与福尔马林固定）

1. 用 1× PBS 清洗样本两次。
2. 尽可能吸尽液体。
3. 进行速冻时，将子宫内膜组织样本放入 1.7 mL 离心管中 （见图 2F 和 2G）。将装有样本的 1.7 mL 离心管置于液氮中 10 秒 ，或直至观察到组织完全冻结。
   注意：制备样本时切勿直接接触液氮。样本可在 -80 °C 下保存，直至后续处理或分析。
4. 进行福尔马林固定时，切取一小块子宫内膜组织 （见图 2H），浸入 10% 缓冲锌福尔马林溶液中。24 小时后，弃去福尔马林溶液，向组织样本中加入 70% 乙醇，保存至后续处理。

5. 免疫荧光（IF）

1. 细胞固定
   1. 在培养皿或培养板上接种细胞。
   2. 用 1× PBS 轻柔洗涤细胞。
   3. 加入预冷的（4 °C）甲醇和丙酮（按1:1比例混合），孵育5分钟。
   4. 将玻片风干后再进行后续操作。如需存放，可将玻片置于4 °C保存1-2周。
2. 处理 IF
   1. 用 1×PBS 重悬细胞，孵育 10 分钟。以下步骤 1–6 中的所有洗涤和孵育步骤均在旋转平台上进行。
   2. 使用含1%牛血清白蛋白（BSA）和1%物种特异性血清（来源为2）的1×PBS进行封闭^nd 抗体）孵育 30 分钟 室温（RT）下
   3. 在一抗中孵育（请参阅抗体稀释比例的生产商建议）。参考 材料 针对特异性抗体。将一抗用新鲜的封闭缓冲液稀释，步骤同5.2.2。该孵育可进行至少2小时。 在室温下或4 °C过夜。
   4. 用1×PBS洗涤3次，每次5分钟 每个。
   5. 在二抗中孵育（参见制造商推荐的抗体稀释比例）。将二抗按步骤5.2.2的方法用新鲜封闭缓冲液稀释。为防止光漂白，此步骤及后续操作需避光进行。
   6. 用1×PBS洗涤3次，每次5分钟 每个。
   7. 彻底干燥载玻片。
   8. 加入封片剂和DAPI复染溶液。
   9. 加盖盖玻片，并使用封片剂密封边缘。载玻片可在避光条件下于4 °C保存，最长可达2周。

6. RNA 提取

1. 通过离心沉淀 1 × 10⁷ 个细胞。本方案中所有材料和试剂均应为无 RNA 酶的。
2. 用 1 ml TRIZOL 试剂裂解细胞，将匀浆样品在室温下孵育 10 分钟 ，以彻底解离核蛋白复合物。
3. 每 1 ml TRIZOL 加入 200 µl 氯仿，手动剧烈振荡 15 秒 ，然后在室温下孵育 2–3 分钟 。
4. 在 4 °C 下以最大转速（15,000 × g）离心 15 分钟 。离心后将形成三层。
5. 将上层水相转移至新的微量离心管中。加入 1 µl 甘油原以提高 RNA 产量；但此步骤仅在预期 RNA 产量较低时才必要。
6. 向水相中加入 0.5 ml 异丙醇，倒置混匀 3–5 次。在室温下孵育 10 分钟。为提高产量，可将样品置于 -20 °C 或 -80 °C 中 30 分钟。
7. 在 4 °C 下以最大转速离心 10 分钟 。
8. 此时应可见少量 RNA 沉淀。弃去上清液。
9. 用 1 ml 75% 乙醇洗涤 RNA。
10. 在 4 °C 下以最大转速离心 5 分钟 ，弃去上清液。可再洗涤一次以去除无机污染物，但此步骤非必需。
11. 短暂干燥 RNA 沉淀，直至沉淀完全干燥（通常需 7–10 分钟）。
    注意：可采用一个额外步骤以减少无机物残留并缩短干燥时间。乙醇洗涤后弃去上清液，再以最大转速离心 1 分钟，并吸除残留液体。注意勿吸走沉淀。
12. 根据 RNA 沉淀的大小，用无 RNA 酶的水溶解 RNA。体积通常为 10–50 µl。
13. 在 55 °C 下孵育 10 分钟，然后测定 RNA 浓度。
14. 将样品储存于 -20 °C，待后续处理。

7. 逆转录

1. 用 H₂O 将样品 RNA（1-3 µg）补至 9 µl。
2. 将 RNA 在 70 °C 加热 10 分钟。
3. 为制备 AMV 预混液，混合以下试剂：5 µl dNTP（工作浓度为 50 µM）、5 µl N6 DNA 寡核苷酸（工作浓度为 80 µM）、5 µl 5X AMV 缓冲液和 1 µl AMV。该预混液按每份样品配制。
4. 向加热后的 RNA 中加入 16 µl 预混液。最终反应体积为 25 µl。
5. 使用以下 PCR 条件进行逆转录：（第一阶段）42 °C 反应 90 分钟，（第二阶段）95 °C 反应 5 分钟，（第三阶段）4 °C 保存至后续处理。

8. 实时 PCR

1. 使用 表1 中列出的引物、退火温度、循环次数和试剂进行PCR反应。
   注意：使用PCR试剂时，建议遵循生产商的说明（参见 材料 部分中的公司名称和目录编号）。

9. 体外 蜕膜化方案（源自参考文献） ⁴ 和 ⁵)

1. 接种子宫内膜细胞。
2. 培养至细胞融合度达到75-85%。
3. 细胞融合后，用1×PBS洗涤一次。
4. 迅速加入无激素培养基（含5%活性炭处理胎牛血清和1%青霉素-链霉素的酚红-free RPMI培养基）。
5. 24小时后，加入含有醋酸甲羟孕酮（MPA）（终浓度1 µM）和8-溴腺苷酸环磷酸（cAMP）（终浓度0.5 mM）的无激素培养基。
6. 至少48小时后，终止反应，并保留培养板用于后续处理。

结果

正如方案部分所强调的，在处理和制备人体组织时，务必遵守政府、机构及伦理准则。

本论文包含建立原代子宫内膜细胞培养所用的“刮取法”（图1A）和“胰酶法”（图1B）的一般操作流程示意图。这两种方法在实验方案部分（见第1.-3.步）中有详细描述。两种方法均能成功培养原代子宫内膜细胞。其中，“刮取法”的优势在于准备时间较短；然而，与“胰酶法”相比，观察到活细胞所需的时间通常要长2至4倍。

提供的是从组织获取处收到的初始人体组织的数字图像。子宫各层可通过其组织粗糙程度加以区分，即肌层较厚且呈肌性，而子宫内膜较薄且质地较软。我们已在两个不同子宫切除样本的图像中用白色高亮显示厚的平滑肌层（肌层），并用黑色勾勒出感兴趣的子宫内膜层（图2A和2B）。在图2C中，组织的摆放方向为肌层朝上，子宫内膜朝下。薄的浆膜层（外膜）已被手术...

讨论

其他研究团队已描述并改进了子宫内膜基质细胞培养的制备方法，其中大多数方法采用胶原酶 ^{4,12,13,15-18}。在本文中，我们提供了两种简化的原代子宫内膜基质细胞培养方法及其相关证据，本实验室出于经济性以及胰蛋白酶和/或剃刀片易于获取的考虑，正在使用这两种方法。

在比较我们的两种方法时，两种方法均能成功建立可存活的原代培养细胞。我们更倾向于使用胰蛋白酶法，因为该方法通常产量更高，且所需样本量较小。然而，如果准备时间有限，刮取法仅需30分钟，而使用胰蛋白酶法接种细胞则需要一个半小时以上。

值得注意的是，本研究采用子宫切除术样本而非子宫内膜活检样本进行方法学展示。子宫内膜活检侵入性较小，通常获得的标本量较少。然而，本文所述方法（尤其是胰蛋白酶法）应同样适用于子宫内膜活检样本并获得培养物。

原代子宫内膜基质细胞具有多种应用价值。比较人类与其他哺乳动物的子宫内膜基质细胞培养，可能为长期存在争议的问题提供线索：为何人类会发生月经。此外，尚有其他尚未深...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25 胰蛋白酶或 0.05% 胰蛋白酶	Hyclone	SH3023602 或 SH30004202
1.7 微型离心管	Genesee Scientific	22-272A
1 µl、20 µl、200 ml 和 1,000 µl 移液器	Genesee Scientific	24-401、24-402、24-412、24-430
15 ml 锥形管	Hyclone	339650
50 ml 锥形管	Hyclone	339652
6 cm 细胞培养皿	Thermo scientific	12-556-002
8 孔板室	Thermo Scientific	AB-4162
乙酸盐	Fisher scientific	C4-100
AMV 逆转录酶/缓冲液	Bio Labs	M077L
牛血清白蛋白 (BSA)	Fisher Scientific	BP-1605-100
缓冲锌福尔马林	Thermo	59201ZF
活性炭处理胎牛血清 (FBS)	Fisher	NC9019735
氯仿	Fisher Scientific	BP1145-1
盖玻片	Fisher Brand	12-544D
环磷酸腺苷 (cAMP)	Sigma	B7880
DMEM/高葡萄糖	Hyclone	SH30243FS
dNTP	Bioline	BIO-39025
驴抗山羊-TRITC	Santa Cruz	SC-3855
驴血清	Jackson’s lab	017-000-002
E-钙黏蛋白抗体	Epitomics	1702-1
乙醇	Fisher Scientific	BP2818-1
胎牛血清 (FBS)	Fisher Scientific	03-600-511
两性霉素B（Fungizone）	Gibco	15290-018
GAPDH 探针	Life Technologies	HS99999905
糖原	5Prime	2301440
山羊抗小鼠-FITC	Jackson’s Lab	115-096-003
异丙醇	Fisher Scientific	BP2618-1
卡那霉素	Fisher Scientific	BP906-5
醋酸甲羟孕酮 (MPA)	Sigma	M1629
甲醇 (MeOH)	Fisher Scientific	A4-08-1
封片剂（含DAPI）	Vector Labratories	H-1500
N6 DNA 寡核苷酸	Invitrogen
15 号刮铲	BD	371615
广谱细胞角蛋白  小鼠单克隆抗体	Cell Signaling	4545
PBS（磷酸盐缓冲液）	Fisher Scientific	BP-399-4
青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液 100X	Hyclone	SV30082.01
PML 山羊多克隆抗体	Santa Cruz	SC-9862
引物(s)	Eurofins
RPMI	Hyclone	SH30027FS
RPMI（无酚）	Gibco	11835
Sybr Green	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	Thermo	AB-4138
Trizol	Life Technologies	15596018
波形蛋白抗体	Epitomics	4211-1