基于荧光的钙离子动员检测法表征G蛋白偶联受体

摘要

本文所述的基于荧光的钙流测定法是一种中等通量的反向药理学筛选系统，用于鉴定孤儿G蛋白偶联受体（GPCRs）的功能性激活配体。

摘要

二十多年来，反向药理学一直是发现孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）激活配体的主要策略。反向药理学实验的起始步骤是在细胞表达系统中克隆并转染目标G蛋白偶联受体。随后，将异源表达的受体与候选配体化合物文库进行孵育，以鉴定能够激活该受体的配体。受体激活可通过检测第二信使报告分子（如钙离子或cAMP）浓度的变化来评估。本文所述的基于荧光的钙流测定法是一种常用的中通量反向药理学检测方法。该方法中，将孤儿G蛋白偶联受体瞬时表达于人胚胎肾293T（HEK293T）细胞，并共转染一种广谱性Gα₁₆构建体。配体结合后，Gα₁₆亚基的激活会诱导内质网释放钙离子。在进行配体筛选前，需先用荧光钙离子探针Fluo-4乙酰甲酯（Fluo-4 acetoxymethyl）对表达受体的细胞进行负载。在静息状态下，Fluo-4的荧光信号极弱，但在受体激活后释放的钙离子与其结合时，荧光信号可增强100倍以上。该技术无需耗时建立稳定转染细胞系（即外源遗传物质整合至宿主细胞基因组中的细胞系），仅需通过瞬时转染实现目标基因的临时表达即可完成筛选实验。该体系支持对数百种化合物进行中通量筛选。共转染具有广谱耦合能力的Gα₁₆（可与大多数GPCR耦合），可使细胞内信号通路重定向为钙离子释放，从而不受受体天然信号通路类型的限制。HEK293T细胞易于操作，并在多年的受体去孤儿化实验中验证了其有效性。然而，针对特定受体的实验条件优化可能仍然必要。

引言

G蛋白偶联受体（GPCRs）是所有细胞表面蛋白中最大且最多样化的一类蛋白家族。它们存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物、酵母、黏菌，以及原生动物和最早的双胚层动物中，表明GPCRs是与信号转导相关的最古老的分子之一¹。这些受体的天然激活配体包括多种外界刺激物，如肽类、生物源性胺类、气味分子、糖蛋白以及光子²。因此，这类受体-配体信号系统参与了多种生理过程。其广泛的功能谱使其成为治疗多种人类疾病药物开发的理想靶点。目前约有50%-60%的药物靶点属于GPCRs^3,4。除了在制药工业中的重大意义外，GPCRs也正成为新一代物种特异性杀虫剂^5,6以及广义农药研发的关注焦点。由于许多GPCRs的天然配体尚未被鉴定，它们被归类为孤儿GPCRs。对这些受体进行去孤儿化研究将有助于阐明其在生物体内的生理功能，并可能发现可用于新药开发的潜在靶点⁷。

自基因组时代以来，反向药理学策略已广泛应用于G蛋白偶联受体（GPCR）的去孤儿化研究⁸。该策略的基本思路是利用孤儿受体作为“钩子”，从生物提取物或合成化合物文库中“钓取”其激活配体。因此，首先需要克隆目标GPCR，并将其转染至细胞表达系统中。在目前最常用的方法中，通过检测第二信使分子浓度的变化来判断受体是否被激活⁹。主要的受体筛选检测方法依赖于钙离子敏感的生物发光蛋白（例如，水母素）¹⁰或荧光钙指示剂（例如，Fluo-4）¹¹。基于荧光的检测方法在配体筛选前先将表达受体的细胞负载荧光钙指示剂，具有操作简便、读数时间短以及可在同一块微孔板上灵活筛选多个孤儿受体等优点，因而适用于高通量筛选¹²。

在此，通过孤儿受体去孤儿化过程，详细描述并图示了基于荧光的钙流测定方法 黑腹果蝇 短神经肽F（sNPF）受体。该神经肽信号系统最初由Mertens等人表征 等. 于2002年¹³ 利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行的钙离子生物发光检测¹⁴ 和 Feng 等 2003年采用电生理学检测方法 非洲爪蟾 卵母细胞¹⁵sNPF 信号系统似乎仅限于节肢动物门，该系统参与多种生理过程，包括摄食、生长、应激反应、运动以及昼夜节律的调控。¹⁶.

对昆虫神经肽信号系统的研究不仅可能为杀虫剂的开发提供新的靶点，而且由于许多信号系统在进化过程中普遍高度保守，这些研究结果也可外推至其他生物体¹⁷。在过去十年中，昆虫神经肽G蛋白偶联受体（GPCR）的去孤儿化研究取得了显著进展。尽管如此，目前仅有少数受体被成功匹配到其对应的配体，而随着基因组学的快速发展，大量新的孤儿GPCR序列信息已被获得¹⁸。因此，中高通量筛选方法的出现显得尤为宝贵，例如基于荧光的钙流检测技术已被证实为一种广泛应用的技术^9,18。

本文所述的基于荧光的钙流测定法在人胚胎肾293T（HEK293T）细胞系中进行，利用荧光探针检测受体激活后细胞内钙离子浓度的变化。为了确保受体的高水平表达和翻译效率，在受体编码序列的5’端添加了Kozak共有序列¹⁹，随后将其克隆至表达载体中（例如，用于哺乳动物细胞系的pcDNA载体系列）。由于仅基于序列信息难以预测孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）的内源性G蛋白偶联特性，因此在配体被鉴定之前，受体激活后所调控的第二信使分子（例如，钙离子或cAMP）通常尚不明确。为解决这一问题，可共表达G_q家族的广谱性G蛋白（例如，小鼠Gα₁₅或人Gα₁₆［本文使用］）或嵌合型G蛋白（例如，Gα_qi5），这些G蛋白能够与大多数GPCR相互作用并诱导钙离子释放^20,21,22。当配体与其受体结合后，GPCR发生构象改变，从而激活特定的细胞内信号通路。在静息状态下与Gα₁₆亚基结合的鸟苷二磷酸（GDP）分子将被鸟苷三磷酸（GTP）取代。这一过程引发异源三聚体G蛋白解离为Gα₁₆亚基和Gβγ亚基。Gα₁₆亚基激活磷脂酶Cβ（PLCβ），后者进一步水解细胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP₂），生成二酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP₃）。IP₃在胞质中扩散，并激活内质网膜上依赖IP₃的钙离子通道，从而诱导钙离子从内质网释放至胞质中。

受体激活后钙离子的释放发生在数秒之内，可通过在筛选实验前用钙离子敏感性染料（如 Fluo-4 乙酰氧基甲酯（AM）¹¹）对细胞进行负载来检测。AM 酯基团使荧光染料能够穿过细胞膜，进入细胞后被胞质酯酶水解去除。因此，荧光染料的负电荷暴露，使其无法扩散出细胞，从而可与钙离子结合。在静息状态下，细胞内钙离子浓度处于纳摩尔（nM）范围，Fluo-4 的荧光信号极低。然而，当受体激活引发钙离子释放时，荧光信号可随钙离子浓度升高而增加，最高可达100倍以上，从而确保较高的信噪比。Fluo-4 在报告钙离子浓度变化时具有较大的动态范围，其对钙离子的解离常数 K_d 为 345 nM，因此适用于广泛细胞类型中生理相关钙信号变化的检测。Fluo-4 的激发波长为 488 nm，发射荧光在 525 nm 处检测¹¹。荧光检测仪如荧光成像微孔板读板仪（FLIPR）²³、NOVOstar 或 FlexStation（station device）¹² 均为中高通量系统，可在实验板的每个孔中同步实现化合物添加与受体激活后 Fluo-4 信号的检测。本文所述的钙动员实验基于 station device 的 96 孔微孔板系统。

SoftMax Pro 软件（software）用于操作工作站设备以及进行数据分析。该程序会立即以96孔板格式的图表形式显示结果。可同时选择多个孔，以便在同一张图中比较这些孔的实验结果。每个列中各孔的相对荧光单位（RFU）值会在两分钟内被同时测定，测定时间从向孔中加入化合物前开始，持续至受体激活后荧光信号的测量结束。通常情况下，激动剂曲线的趋势在加入激活化合物前与基线保持一致，加入后则导致荧光信号迅速上升。峰值高度与孔中激动剂的最终浓度相关。峰值出现后，荧光信号会缓慢下降，趋近于基线水平。RFU 测量值可转换为浓度-反应曲线，以确定配体的 EC₅₀ 值（半最大效应浓度）。一般而言，应至少进行三次独立实验，每次实验包含一个浓度系列的三个重复孔，以构建可靠的浓度-反应曲线。

建议在实验设计中包含多个阳性和阴性对照。首先，应设置转染对照，即转染表达已知配体的受体，以验证转染试剂是否有效。还建议设置内源性受体激动剂的对照实验以及阴性对照（例如洗涤缓冲液），以监测细胞的健康状态和存活能力，并排除洗涤缓冲液被可能引起自发荧光反应的因子污染的可能性。常用的激动剂包括来自蛋白酶激活受体-1（PAR₁）的肽段，该肽段作为PAR₁选择性激动剂，或卡巴胆碱（carbachol），可激活乙酰胆碱受体。还应检测转染空表达载体的细胞，以排除活性化合物与细胞内源性受体相互作用的可能性。针对不同信号系统，可能需要对下述方案中描述的多个参数进行优化。基于荧光的钙流测定完整实验流程示意图见Figure 1。

图 1. 基于荧光的钙流检测整体实验流程。 使用由软件控制的多功能酶标仪平台设备进行自动化液体处理和同步荧光检测。该平台设备包含三个抽屉：分别用于放置细胞板、化合物板和移液枪头架。内置移液器将化合物从化合物板的一列转移至细胞板的对应列（步骤 1）。细胞板的每个孔中均含有一层共转染了目标 G 蛋白偶联受体（GPCR）和通用型 Gα₁₆ 亚基的 HEK293T 细胞。当化合物激活受体时，与 Gα₁₆ 结合的 GDP 被 GTP 取代。随后 Gα₁₆ 亚基从 Gβγ 复合物中解离，并激活磷脂酶 Cβ（PLCβ），后者进一步水解磷脂酰肌醇二磷酸（PIP₂），生成二酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP₃）。IP₃ 激活内质网膜上的 IP₃ 依赖性钙通道，促使钙离子释放到细胞质中。钙离子与细胞预先负载的 Fluo-4 相互作用，产生荧光信号（步骤 2）。软件将结果以相对荧光单位（RFU）随时间变化的形式呈现，且峰值高度与配体浓度呈浓度依赖性相关。这些数据可进一步转换为浓度-反应曲线，用于确定配体-受体对的 EC₅₀ 值（步骤 3）。

方案

注意：所有涉及细胞的操作均应在层流罩内的无菌环境中进行。

1. HEK293T 细胞系的培养与维持

1. 在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中，于T-75培养瓶中培养HEK293T细胞。
2. 当细胞融合度达到80%时进行传代。注意：通常需要3至4天。持续培养的细胞可用于筛选的传代次数为20–25次。
   1. 提前半小时将不含氯化钙和氯化镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）、PBS-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（500 ml PBS中加入10 ml胰蛋白酶-EDTA溶液和4.5 ml 4% EDTA）以及生长培养基（500 ml高糖Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]，添加10%胎牛血清[FBS]和1 mM青霉素-链霉素[P-S]）置于室温下平衡。
   2. 移除细胞中的旧生长培养基，用3 ml PBS冲洗去除死细胞，然后再次移除PBS。
   3. 加入3 ml PBS-胰蛋白酶-EDTA，室温孵育1分钟，然后移除溶液。注意：细胞形态将从星形变为球形。
   4. 轻轻敲击培养瓶使细胞从瓶底脱落，并用10 ml新鲜生长培养基反复冲洗瓶底以收集细胞。
   5. 将1 ml细胞培养物转移至含有14 ml新鲜生长培养基的新T-75培养瓶中，在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育。

2. HEK293T 细胞的瞬时转染

1. 在进行钙流测定实验前3天，将HEK293T细胞培养于T-75培养瓶中。请使用三个T-75培养瓶：一个用于转染受体表达质粒，一个用于转染空表达载体作为阴性对照，另一个用于转染对照。注意：细胞传代操作按照步骤1.2所述进行。当需要筛选多个96孔板时，可使用T-150培养瓶以获得更多的细胞产量（此时需将步骤1.2.5、2.3、3.1.3和3.1.4中列出的所有试剂用量加倍）。
2. 将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育20–24小时，直至细胞融合度达到50–70%。
3. 将第一组细胞共转染编码目标G蛋白偶联受体（GPCR）的表达质粒和Gα₁₆表达质粒，第二瓶细胞共转染空载体和Gα₁₆表达质粒，第三瓶细胞共转染转染对照质粒和Gα₁₆表达质粒。注意：本实验方案中，Drosophila sNPF受体被克隆至pcDNA3.1哺乳动物表达载体¹³中。转染使用JetPRIME试剂完成，但也可使用其他转染试剂。
   1. 将总共7.8 µg DNA（3.9 µg受体表达质粒或空载体，以及3.9 µg Gα₁₆表达质粒）加入1.5 ml微量离心管中，并加入500 µl JetPRIME缓冲液。通过涡旋充分混匀后短暂离心。
   2. 加入37.5 µl JetPRIME试剂，涡旋混匀后在14,000 x g条件下离心1 min 。室温孵育转染混合物10分钟。
   3. 将转染混合物逐滴加入细胞培养基中，注意移液时直接加入培养基内，避免接触培养瓶壁。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中继续孵育20–24小时。

3. 钙离子动员实验

1. 收集转染后的细胞，并将其接种至96孔黑色壁、透明底板中。
   1. 将 PBS、PBS-胰蛋白酶-EDTA 和 DMEM 转移培养基（500 ml DMEM 添加 10% 透析胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）提前半小时置于室温。
   2. 用 60 µl 含纤连蛋白（0.0025%）的 PBS 每孔包被 96 孔黑壁透明底板（每板加入 5.85 ml PBS 和 150 µl 纤连蛋白 [0.1%]）。盖上盖子，室温孵育 1 小时。吸除孔内溶液，再将板子敞盖于室温孵育 1 小时。 alternatively，可使用预包被板以增强细胞贴附。
   3. 从细胞中移除旧的培养基，用 3 ml PBS 洗去死细胞，然后吸除 PBS。
   4. 加入3 ml PBS-胰蛋白酶-EDTA，孵育1分钟，然后移除溶液。注意：细胞形态由星形变为球形。
   5. 轻轻敲击培养瓶底部使细胞脱落，用10 ml DMEM转移培养基反复冲洗收集细胞，将细胞悬液转移至50 ml Falcon管中。
   6. 按每毫升计数细胞数量（此处使用 NucleoCounter，也可使用血球计数板）。取 100 µl 细胞培养液加入 1.5 ml 微离心管中。加入 100 µl 裂解缓冲液，通过轻弹管壁混匀。加入 100 µl 稳定缓冲液，通过轻弹管壁混匀。
   7. 将细胞悬液加入NucleoCassette中，并使用计数仪对细胞进行计数。将计得的细胞数乘以3，因为在步骤3.1.6中加入裂解液和稳定缓冲液时，细胞被稀释了3倍。
   8. 将细胞稀释至终浓度为 600,000 个细胞/ml，每孔加入 150 µl 细胞悬液至包被好的培养板中，使每孔细胞密度约为 90,000 个细胞/孔。避免产生气泡，轻敲培养板使细胞均匀分布，以获得连续的细胞层。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 湿润培养箱中培养16-24小时。
2. 用荧光染料负载细胞，并准备化合物板。
   1. 配制 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）/HEPES/Ca²⁺/牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：加入165 µl CaCl₂ 储存液（1 M CaCl₂）₂ 在蒸馏水 [dH₂O] 中₂O] – 室温保存），500 µl HEPES 储存液（1 M HEPES 溶于 dH₂O）₂O，pH 7.4——室温保存），并将 0.05 g BSA 加入 50 ml HBSS 中。注意，钙流检测中需使用无脂肪酸 BSA，因为脂肪酸可激活特定受体，从而干扰目标受体的钙信号。
   2. 配制丙磺舒溶液（100倍，250 mM）：将0.71 g丙磺舒溶解于5 ml NaOH（1 M）中，加入50 µl HEPES储备液和5 ml HBSS/HEPES/Ca²⁺/BSA缓冲液——务必现配现用。注意：丙磺舒可抑制无机阴离子转运体，而这些转运体可能会将Fluo-4从细胞质中排出，从而降低荧光信号。建议在加载染料时分别在有无丙磺舒的条件下进行，以确定所研究的特定细胞系中无机阴离子转运体是否可能造成问题，因为丙磺舒甚至可能减弱激动剂介导的信号。
   3. 配制洗涤缓冲液：将 500 µl 丙磺舒溶液加入 50 ml HBSS/HEPES/Ca 中²⁺/BSA 缓冲液，调节 pH 至 7.4，并过滤缓冲液。务必新鲜配制，每块板需要 50 ml 缓冲液。
   4. 配制10%普鲁利克酸溶液：将50 µl普鲁利克酸（20% w/v，溶于二甲基亚砜[DMSO]）与50 µl DMSO混合——若出现结晶，于37 °C加热，并务必现配现用。
   5. 配制Fluo-4 AM溶液（1 mM）：向含有50 µg Fluo-4 AM的离心管中加入44 µl 10% Pluronic酸溶液，涡旋振荡至完全溶解。避免光照，以防荧光染料漂白。
   6. 配制上样缓冲液：将8.8 ml含10 mM HEPES和2.5 mM probenecid（pH 7.4）的DMEM加入Fluo-4 AM溶液（44 µl）中，涡旋混匀。始终使用新鲜配制的缓冲液。
   7. 弃去细胞培养液，每孔用 200 µl PBS 洗涤细胞，然后吸除 PBS。
   8. 每孔加入 55 µl 上样缓冲液，室温孵育 1 小时。用铝箔纸包裹板子，避免暴露于光线下。
   9. 确保在筛选前将化合物充分干燥，如果它们溶解于对筛选有害的溶剂中例如，乙腈）用于细胞表达系统。
   10. 在硅化处理的1.5 ml微量离心管中，用洗涤缓冲液溶解肽段。制备一系列稀释浓度，用于进行浓度-反应关系分析并确定EC₅₀ 配体的值。在化合物板（V型96孔板）的相应孔中加入70 µl配体，并在每块板上设置阳性对照（内源性激动剂）和阴性对照（洗涤缓冲液）。注意：如果化合物在洗涤缓冲液中不溶解，可尝试对所研究细胞无害的其他溶剂，例如水或能够乳化和溶解油类及其他水不溶性物质的溶液。例如，Kolliphor EL）
   11. 所有样品均需设置三个复孔。注意，在检测过程中，会将50 µl来自化合物板的配体转移至含有100 µl洗涤缓冲液的细胞板孔中，因此化合物溶液应配制为其目标终浓度的3倍。
   12. 弃去细胞板中的上样缓冲液，每孔加入100 µl洗涤缓冲液。室温孵育15分钟，并避免光照。
   13. 弃去细胞板中的洗涤缓冲液，每孔加入100 µl新鲜洗涤缓冲液。
   14. 将细胞板、化合物板和一个吸头架（96孔，工作站设备移液吸头）在37 °C孵育15分钟。

4. 在Station设备上进行检测

1. 使用软件创建并加载所需的实验方案文件，启动读板室的温度控制单元。在此，以37 °C测量钙离子响应，每次测量一行，持续2分钟，连续读数之间间隔1.52秒（测量完整的96孔板约需25分钟），检测波长为525 nm。将Fluo-4的激发波长设为488 nm，并在读数开始后18秒，以26 µl/sec的加样速度和135 µl的移液高度，向细胞板中加入总计50 µl的化合物。
2. 将化合物板、细胞板以及吸头架放置于仪器设备相应的抽屉位置。
3. 在启动FLEX模式的实际筛选前，先以ENDPOINT模式在相同的激发和发射波长下对细胞板进行一次单次读数。注意：该测量可获得相对荧光单位（RFU）值，用于检测板内各孔之间的变异情况。RFU值在20,000至40,000之间视为可接受。
4. 启动检测实验，并使用软件分析数据。

结果

浓度梯度范围从 50 µM 到 0.001 nM，对全部四种物质进行了测试 果蝇 sNPF 肽（果蝇-sNPF-1：AQRSPSLRLRF酰胺， 果蝇-sNPF-2：SPSLRLRF酰胺， 果蝇-sNPF-3：PQRLRW酰胺， 果蝇-sNPF-4（PMRLRW酰胺）对瞬时表达的HEK293T细胞的作用 果蝇 sNPF受体与广谱Gα₁₆ 亚基。该G蛋白偶联受体可被所有四种肽在终浓度低至0.1 nM时激活，且受体激活呈浓度依赖性。 图2 显示了三个重复实验中其中一个的相应图表 果蝇-sNPF-1 浓度梯度系列。阴性对照（洗涤缓冲液）未诱导出荧光信号，而阳性对照（PAR₁ – 1 µM）可强烈激活内源性蛋白酶激活受体-1（protease-activated receptor-1），导致产生较强的荧光信号（约 ± 30,000 RFU）。需要注意的是，典型曲线的偏离可能提示存在异常情况。例如，曲线持续上升而未能恢复至基线水平，可能与非受体介导的信号有关，如存在钙离子载体（calcium ionophores），或脂质双分子层结构受损导致钙离子泄漏。

该软件允许输入公式以计算不同浓度下的激活百分比或标准误差等参数。所得数据用于绘制初步的浓度-反应曲线，以估算EC₅₀值，如图3中四种Drome-sNPF肽所示。图3的曲线还包含了阴性对照的数据，即在转染了空载体pcDNA3.1的HEK293T细胞上测试Drome-sNPF肽浓度系列的结果。结果表明，这些肽对细胞内源性受体无影响，但确实能够激活目标受体。随后，基于初始筛选的初步浓度-反应曲线，独立重复进行了三次基于荧光的钙流动员实验，并调整测试浓度以覆盖曲线的动态范围（见图4）。Drome-sNPF-1（2.04 ± 1.48 nM [95%置信区间]）、Drome-sNPF-2（5.89 ± 3.74 nM）、Drome-sNPF-3（5.55 ± 3.95 nM）和Drome-sNPF-4（0.50 ± 1.01 nM）的EC50值相近，表明它们在激活受体方面具有相似的效力。

图 2. 软件生成的受体介导荧光反应在一系列浓度下的图形输出结果。对 Drome-sNPF 受体测试了 12 种终浓度（范围从 50 µM 到 0.001 nM）的 Drome-sNPF-1 肽。激活信号以相对荧光单位（RFU）表示。上方图显示六个最高浓度的结果，下方图显示六个最低浓度的结果。阳性对照（+）为 PAR₁（1 µM），阴性对照（-）为洗涤缓冲液。

图3. 初步浓度-反应曲线 果蝇 由单个确定的sNPF肽 基于荧光的钙流测定法 浓度-反应曲线 黑腹果蝇 在HEK293T细胞中瞬时表达的sNPF受体，用于四种 果蝇 sNPF 肽段以蓝色表示。阴性对照（以红色表示）为在转染空载体 pcDNA3.1 的 HEK293T 细胞上测试的肽段。荧光反应以最高值（100% 激活）的相对百分比（%）表示。曲线来自一次实验，每种浓度梯度均设三个重复。垂直条表示平均值的标准误（SEM），有时该误差小于所用符号的尺寸（此时仅显示符号）。

图4. 浓度-反应曲线及相应的EC₅₀ 值 黑腹果蝇 通过三个独立的基于荧光的钙流测定实验确定的sNPF肽。 浓度-反应曲线 果蝇 在HEK293T细胞中瞬时表达的四种sNPF受体 果蝇 sNPF 肽的检测结果来自三次独立实验，每次实验均设三个重复（n ≥ 9）。荧光反应以最高值（100% 激活）为基准，表示为相对百分比（%）。星号标注的是 n ≤ 9 的浓度点。误差线表示标准误（SEM），有时误差线小于所用符号大小（此时仅显示符号）。EC₅₀ 数值以95%置信区间表示。

讨论

基于荧光的钙流测定法已成功应用于验证以下功能表征 果蝇 已由Mertens完成了sNPF肽能信号系统的相关研究 等通过生物发光检测法和冯 等通过电生理学检测方法^13,15. 内皮细胞₅₀ 在HEK293T细胞中通过荧光检测法获得的数值比在CHO细胞中通过生物发光检测法获得的数值低约10倍（果蝇-sNPF-1：fluo = 2.04 nM，lumi = 51 nM； 果蝇-sNPF-2：fluo = 5.89 nM，lumi = 42 nM； 果蝇-sNPF-3：fluo = 5.55 nM，lumi = 31 nM； 果蝇-sNPF-4：fluo = 0.50 nM，lumi = 75 nM）。这些差异可由多种因素解释，包括所使用的表达系统之一可能更适用于特定受体的功能性表达，或某些受体在特定细胞类型中的折叠效率较低。EC₅₀ 四个值 果蝇-sNPF 肽在其受体上的荧光和生物发光检测中均处于纳摩尔浓度范围，通常支持其肽-受体相互作用的生理相关性 体内.

需要注意的是，本次筛选未包含已知激活配体的受体作为转染对照，因为在实验设置中，果蝇（Drosophila）sNPF 信号系统通常被用作转染对照。筛选中包含了 HEK293T 细胞内源性配体的阳性对照（PAR₁）以及阴性对照（洗涤缓冲液）。PAR₁ 的结果表明细胞状态良好。阴性对照（洗涤缓冲液）未引发荧光信号，说明溶解肽的培养基中不含可能影响实验结果的任何污染物。

本研究利用先前已表征的 Drosophila sNPF 信号系统，以说明基于荧光的钙动员检测方法。为此，可立即测试激动配体的浓度梯度。然而，当在筛选实验中对孤儿受体进行过表达，以检测包含数百种化合物的文库时，建议首先使用相对较高的配体终浓度（例如，10 或 1 µM）进行初筛。在鉴定出具有激活作用的化合物后，可进一步对该化合物进行系列稀释，以开展浓度-反应曲线检测，并确定其 EC₅₀ 值。

一旦确定了受体的激活配体，可通过调整实验方案进一步研究其细胞内信号通路。该检测可按上述方法进行，但无需共转染Gα₁₆ 亚基。当检测到钙反应时，意味着该受体与内源性Gα偶联_q 细胞表达系统的亚基。当未观察到荧光信号时，可采用检测其他第二信使浓度变化的实验方案（例如，cAMP）可被应用。

还可以开展构效关系（SAR）研究，以确定肽段中激活受体所必需的核心序列。首先，通过评估截短序列来确定仍能激活受体的最短氨基酸序列。随后，可测试一系列系统性地将每个氨基酸替换为丙氨酸残基的肽段。在受体上测试合成的丙氨酸替换系列，有助于确定每个氨基酸在受体激活中的重要性^24,25。

尽管该检测方法应用广泛且已证实有效，但仍需强调，本文所述的检测方案可能需要针对特定受体进行一些调整，以获得最佳结果。Gα₁₆亚基的优点在于其可与大多数G蛋白偶联受体（GPCR）结合，但可能对内源性通过Gα_q²²偶联的受体产生显性负效应。在此情况下，在优化新型钙流检测时，可尝试不同的G蛋白组合，并比较Gα_q偶联受体在有或无Gα₁₆存在时的检测结果。此外，也可采用不依赖G蛋白相互作用的替代性检测方法来评估受体激活，例如GFP标记的arrestin转位实验，或检测膜电位变化（例如，使用FLIPR膜电位检测试剂盒）。除本实验所用的Fluo-4 AM外，目前已有多种其他钙离子敏感型荧光染料可供选择，每种染料均具有独特的光谱和化学特性。最合适的荧光染料应根据具体的GPCR类型、细胞种类以及可用的酶标仪进行选择，但需通过实验验证其适用性。转染DNA的用量以及DNA与转染试剂的比例，需针对每一种受体-转染试剂-细胞系组合进行优化确定。最后，需注意连续培养的细胞仅能提供20至25代可用于筛选实验的有效传代次数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEK293T 细胞
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	D8537
胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%）	Sigma-Aldrich	T4049
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	MP Biomedicals	195173
杜氏改良伊格尔培养基-高糖 （DMEM）	Sigma-Aldrich	D5796
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F7524
青霉素-链霉素（P-S）	Sigma-Aldrich	P4333
jetPRIME	Polyplus transfection	114-01	FuGENE HD 转染试剂（Promega）；Lipofectamine LTX & Plus 试剂（Life technologies）
透析胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F0392
人血浆来源的纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F0895
试剂 A100，裂解缓冲液	Chemometec	910-0003
试剂 B，稳定缓冲液	Chemometec	910-0002
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4503
HBSS 缓冲液：Hank's 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H8264
丙磺舒	Sigma-Aldrich	P8761
NaOH（1 M）	Vel	2781
普鲁尼克酸	Invitrogen	P-3000MP
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluo-3、Rhod-2、Fluo-5、Calcium Green-1 等（Invitrogen）
TPP 细胞培养瓶（T-75 和 T-150）	Sigma-Aldrich	Z707503 和 Z707554
FlexStation 仪器	Molecular Devices		NOVOstar（BMG Labtechnologies）；FLIPR（荧光成像板读取仪）（Molecular Devices）
黑色壁、透明底的聚苯乙烯板（96 孔）	Greiner Bio-One	655090	Corning 96 孔平底透明黑色聚苯乙烯多聚赖氨酸包被微孔板
NucleoCassette	Chemometec	941-0001
NucleoCounter NC-100	Chemometec
硅化微量离心管	BioCision	BCS-2470
聚苯乙烯 V 型 96 孔板	Greiner Bio-One	651101
96 孔 FlexStation 移液吸头	Molecular Devices	9000-0912
Soft Max Pro 软件	Molecular Devices