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方法文章

电纺将生长因子释放微球融入纤维支架

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DOI：

10.3791/51517

⸱

2014年8月16日

 , 
1Biomedical Engineering, Wayne State University

本文内容

摘要

本方案结合静电纺丝与微球技术，构建可引导神经元生长的组织工程支架。将神经生长因子包裹于PLGA微球中，并将其静电纺丝至透明质酸（HA）纤维支架内。通过在支架上接种原代鸡背根神经节并培养4-6天，检测蛋白质的生物活性。

摘要

本实验描述了一种制备多功能基底以引导神经细胞生长的方法。该系统整合了力学、形貌、黏附和化学信号。基底的力学性能由用于制备电纺纤维的材料类型决定。在本方案中，我们使用30%甲基丙烯酰化透明质酸（HA），其拉伸模量约为500 Pa，以制备柔软的纤维支架。通过在旋转芯轴上进行电纺丝，可形成取向排列的纤维，从而提供形貌学引导信号。支架经纤连蛋白包覆后实现细胞黏附。本研究旨在解决的主要挑战是在较长时间内于支架的整个深度范围内提供稳定的化学信号。本方案描述了制备载有神经生长因子（Nerve Growth Factor, NGF）的 聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）微球，并在电纺丝过程中直接将这些微球掺入支架中的方法。由于制备环境较为严苛，包括高剪切力和电荷作用，因此在制备完成后需检测蛋白质的活性。该系统可实现超过60天的蛋白质持续释放，并已被证实能够促进原代神经细胞的生长。

引言

神经组织工程领域持续面临的挑战之一是构建一种能够模拟细胞外基质的神经导管（NC），以提供神经自然生长的环境。研究表明，细胞会响应其周围环境中的多种因素，包括力学、形貌、黏附以及化学信号1-3。该领域的主要挑战之一是确定这些信号的适当组合，并制造出能够长期维持这些引导信号以支持细胞生长的系统4。已知外周神经元倾向于在柔软的基底上生长，沿取向纤维定向延伸，并对神经生长因子（NGF）产生响应5-7。能够持续提供数周化学信号的神经导管已被证明可实现更佳的功能性恢复，效果接近目前神经修复的金标准——同种异体神经移植8,9。

可采用多种材料和制备方法来产生力学和形貌线索10-13。力学线索是所选材料固有的特性，因此针对具体应用选择合适的材料至关重要1,13。用于调控形貌线索的制备方法包括相分离、自组装和静电纺丝1,13。对于微米尺度的应用，还可采用微流控、光刻图案化、蚀刻、盐浸出或气体发泡等方法14-17。由于静电纺丝具有高度灵活性和易于制备的优点，已成为构建组织培养用纤维基质最常用的方法13,18-23。静电纺纳米纤维的制备原理是通过对聚合物溶液施加高电压，使其因自身排斥而拉伸并跨越短间隙放电24。通过在接地的旋转芯轴上收集纤维可制得取向支架，而在静止平板上收集则获得非取向支架25。可通过在纤维支架上包被纤连蛋白，或在静电纺丝前将粘附性肽（如RGD）共价连接至透明质酸（HA）上，从而实现细胞粘附信号的引入26。

化学信号（如生长因子）由于需要可控释放的来源，因此最难在较长时间内维持其活性。已有多种系统尝试将可控释放功能引入电纺纤维网络，但成功程度各不相同。这些方法包括共混电纺、乳液电纺、核-壳电纺以及蛋白质偶联27。此外，传统电纺通常使用挥发性溶剂，可能影响蛋白质的活性28，因此必须考虑如何保持蛋白质的生物活性。

该方法专门针对整合力学、形貌学、化学和黏附信号，以构建一种可调节的支架，用于外周神经生长。通过合成甲基丙烯酰化透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）可精确控制支架的力学性能。甲基丙烯酰化位点用于连接光反应性交联剂。交联后的材料不再溶于水，且仅能被酶降解29。交联程度的变化可调节材料的降解速率、力学性能及其他物理特性。使用甲基丙烯酰化程度为30%的HA（其拉伸模量约为500 Pa），可形成一种柔软的基底，其力学性能接近神经组织的天然力学环境，通常更受神经元偏爱26,29。通过在旋转芯轴上进行静电纺丝，可形成取向排列的纤维，提供形貌学引导信号。结合使用静电纺丝与微球，可在支架中长期提供化学信号。为支持神经突生长，采用含有神经生长因子（NGF）的微球以产生化学信号。与大多数静电纺丝材料不同，HA可溶于水，因此在制备过程中NGF不会接触 harsh 溶剂。为引入黏附信号，将支架表面涂覆纤连蛋白（fibronectin）。最终构建的系统包含上述四种信号类型：柔软（力学）取向（形貌学）纤维，负载可释放NGF的微球（化学信号），并涂覆纤连蛋白（黏附信号）。本实验方案详细描述了该系统的制备与检测过程。

该过程首先通过水包油包水双重乳化法制备微球。乳化过程使用聚乙烯醇（PVA）作为表面活性剂进行稳定。内水相中含有目标蛋白。当其被加入含有溶解于二氯甲烷（DCM）中的PLGA壳材料的油相时，表面活性剂在两相之间形成屏障，保护蛋白免受DCM的影响。随后，将该乳液分散到另一含有PVA的水相中，以形成微球的外表面。将稳定的乳液搅拌，使DCM挥发。经过洗涤和冻干后，即可获得含有蛋白的干燥微球。

微球制备完成后，即可用于静电纺丝以形成支架。首先配制静电纺丝溶液。溶液的黏度对纤维的正常形成至关重要。单纯的透明质酸（HA）溶液无法满足这一要求，因此需加入聚环氧乙烷（PEO）作为载体聚合物以实现静电纺丝。将微球加入该溶液中并进行静电纺丝，最终得到含有均匀分布微球的纤维支架。

生产完成后，应测试蛋白质以验证其活性。为此，可使用对神经生长因子（NGF）有反应的原代细胞。本方案采用8至10天龄鸡胚胎的背根神经节（DRG）。将细胞团接种到含有填充NGF微球的支架或空支架上。如果NGF仍具有活性，则应在含NGF的支架上观察到神经突显著生长；如果NGF已失活，则不会促进神经突延伸，其形态应与对照组相似。

本文所述的精确操作步骤主要针对神经支持，但通过对材料、静电纺丝方法以及蛋白质进行简单修改，该系统可针对多种细胞和组织类型进行优化。

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方案

1. 水/油/水双乳液微球的制备

  1. 首先配制 2% 和 0.5%（w/v）的聚乙烯醇（PVA）水溶液，使用去离子水。在 50 °C 下搅拌溶液至澄清，此过程可能需要数小时。另配制 2%（v/v）的异丙醇水溶液，使用去离子水。
  2. 配制所需亲水性蛋白的水溶液。下表提供了一些示例配方。

蛋白质浓度表；PBS稀释剂中的BSA、NGF；检测说明，释放量不足。
表 1： 蛋白质溶液示例。 以下蛋白质溶液已成功通过本方案实现包封并进行电纺。可根据需要使用其他亲水性蛋白质溶液。

  1. 将 40 ml 的 0.5% PVA 溶液加入 50 ml 离心管中，备用。
  2. 在 15 ml 离心管中，将 300 mg 的 65:35 聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）溶解于 3 ml 二氯甲烷中。可使用涡旋混合器加速 PLGA 的溶解。
  3. 混合 200 µl 蛋白质溶液与 4 µl 的 2% PVA 溶液。将该蛋白质混合物倒入 PLGA 溶液中（步骤 1.4）。两种溶液将基本保持分离状态。
  4. 将离心管置于盛有冰水的烧杯中。使用探头式超声仪（约 10 瓦特 RMS）振荡数秒（5–10 秒），直至形成均匀的乳白色乳剂。
  5. 将乳剂倒入含有 0.5% PVA 的 50 ml 离心管中（步骤 1.3）。在涡旋混合器上高速混合约 20 秒。溶液将呈现浑浊外观。
  6. 将乳剂转移至 200 ml 烧杯中，并置于搅拌器上以 350 rpm 搅拌 2 分钟。在搅拌中的烧杯中加入 50 ml 的 2% 异丙醇。继续搅拌至少 1 小时，使二氯甲烷挥发，PLGA 固化。
  7. 将微球溶液转移至离心管中。
  8. 以 425 × g 离心 3 分钟。微球将聚集在管底并呈白色。小心移除微球上方的上清液，并将其储存于 500 ml 瓶中。
  9. 用去离子水清洗微球：将离心管加水至约四分之三满，振荡以使微球在液体中重新分散。
  10. 重复步骤 1.10 和 1.11 四次。
  11. 最后一次清洗后，再次移除上清液，并与之前收集的样品一同存入 500 ml 瓶中。将离心管中收集的微球冷冻，随后冻干至少 24 小时。
  12. 在光学显微镜或扫描电子显微镜下观察微球。直径不超过 60 µm 的微球适用于有效的电纺丝。若微球过大，则可能需要在步骤 1.6 或 1.7 中延长超声或涡旋时间。
  13. 将干燥后的微球储存于 -20 °C 冰箱中。
  14. 可选：按照试剂盒制造商说明，使用蛋白检测试剂盒检测步骤 1.10 中收集于 500 ml 瓶内的蛋白含量。通过从生产过程中使用的蛋白总量中减去溶液中的蛋白量，可计算微球中蛋白的包封率30。

注意：为了在微球中可视化蛋白质的位置，可在PLGA溶液中加入罗丹明（Rhodamine）至终浓度为2 µg/ml31，并包封FITC标记的蛋白质。图1展示了一个示例。

2. 含微球的静电纺丝

  1. 在配制静电纺丝溶液之前，将光引发剂溶于去离子水中，于37 °C下配制成0.5% w/v的溶液。此过程可能需要数小时。
  2. 在去离子水中配制含2% w/v甲基丙烯酰化透明质酸（MeHA）（MeHA的合成方法见Burdick et al.29）、3% w/v 900 kD聚环氧乙烷（PEO）和0.05% w/v光引发剂的溶液。
    1. 根据所需体积计算MeHA和PEO的正确用量。例如，配制10 ml静电纺丝溶液需要200 mg MeHA和300 mg PEO。
    2. 将PEO溶于占最终体积90%的去离子水中（本例中为9 ml）。此过程可能需要数小时，可使用37 °C的加热磁力搅拌器或水浴以加速溶解。
    3. 随后加入MeHA，并使用涡旋混合器搅拌至溶液澄清。此步骤仅需几分钟。
    4. 最后加入0.5%光引发剂溶液，补足剩余10%体积（本例中为1 ml）。
  3. 按所需浓度加入微球，最高可达400 mg/ml。使用涡旋混合器混合溶液，直至微球在溶液中均匀分布。
  4. 将溶液转移至注射器中，并安装一根6英寸18号钝头针头。
  5. 将注射器放入注射泵中，并设定流速为1.2 ml/hr。
  6. 在收集板或芯轴上贴一层铝箔。这有助于成品支架的清洁和储存。使用旋转芯轴可制备取向排列的纤维，而使用平板或静止芯轴则会形成随机排列的纤维。
  7. 将高压电源的接地线连接至收集装置，将正极导线连接至针头。
  8. 调节注射泵和收集表面，使针尖与收集表面之间的距离为15 cm。
  9. 启动聚合物流动，当在注射器末端观察到溶液时，开启电压源并将电压调至24 kV。注意：一旦开启电压，切勿触碰系统的任何金属部件。电荷还可能从带电部件短距离跳跃至皮肤。
  10. 持续纺丝直至达到所需支架厚度。完成后关闭电压源和注射泵。
  11. 取下附有支架的铝箔。含有蛋白质的成品支架应储存在-20 °C冰箱中。

3. 蛋白质生物活性检测

  1. 准备细胞培养基。向杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）中加入10% v/v 胎牛血清、1% v/v L-谷氨酰胺和1% v/v 青霉素-链霉素。
  2. 选择能够完全放入孔板孔中的玻璃盖玻片。
  3. 按照制造商说明，使用3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯处理盖玻片。甲基丙烯酰化可增强支架材料在盖玻片上的附着性。
  4. 在电纺丝前，使用可移除的双面胶带将甲基丙烯酰化处理后的盖玻片固定在电纺丝装置的收集区域。直接在盖玻片上纺丝可方便后续操作和观察。
  5. 按照上述方法电纺至所需厚度。
  6. 电纺丝完成后，小心地从转鼓上取下盖玻片。将带有支架的盖玻片放入透明氮气室中，并确保完全去除氧气。
  7. 将氮气室及支架置于强度为10 mW/cm2、波长为365 nm的光照下15分钟。交联完成后，将盖玻片转移至合适尺寸的孔板中，确保支架面朝上。
  8. 将支架置于杀菌灯下照射30分钟以进行灭菌。如需增强细胞黏附，可使用纤连蛋白或其他蛋白作为涂层。请按照制造商说明对支架进行包被处理。
  9. 按照Hollenbeck32先前描述的方法收获背根神经节（Dorsal Root Ganglia, DRG）。每个待测试的支架覆盖盖玻片需要一个DRG。
  10. 在孔板中每个支架上加入100–200 µl培养基。小心地将一个DRG置于每个支架上的液滴中。对于较厚的支架，可能需要更多培养基；确保DRG完全浸没，不漂浮。
  11. 将支架与DRG在37 °C下孵育4小时，以使细胞充分黏附于支架上。
  12. 向孔中补充培养基至适当液面高度，并放回培养箱继续孵育4–6天。
  13. 孵育结束后，小心吸去每孔中的培养基，并用PBS轻轻洗涤一次。使用4% w/v 多聚甲醛固定细胞30分钟。
  14. 使用神经丝蛋白抗体对细胞进行染色，以便观察并量化神经突的生长情况。也可使用DAPI染色以观察细胞核。Sundararaghavan及其同事14曾描述过一个示例染色方案。
  15. 使用荧光显微镜观察细胞。
    1. 将孔板放置在显微镜载物台上。
    2. 使用DAPI对应的滤光片和激发设置定位细胞团块。
    3. 找到细胞后，切换至FITC滤光片以观察延伸的神经突。利用显微镜的图像拼接功能，采集并合并足够数量的图像以观察整个结构。对DAPI、FITC和明场图像均重复此步骤。

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结果

直径为 50±14 µm、蛋白包封率超过 85% 的微球已实现稳定制备，并通过静电纺丝技术加工成支架。微球尺寸通过三批独立制备样品的成像结果确定，图像在光学显微镜下采集，并使用商用实验室软件测量长度。图 1展示了粒径分布的直方图。包封率也通过三批独立微球样品进行检测，方法是定量分析制备过程中逸出的蛋白含量。

图2 显示了具有代表性的微球，其PLGA壳中含有罗丹明（2 µg/ml），内部包封有牛血清白蛋白（BSA）-FITC。图像使用荧光显微镜拍摄。可清晰观察到外壳（红色），而蛋白质则集中在内部（绿色）。

为评估包封效果，将微球负载牛血清白蛋白（BSA），并通过 Bradford 蛋白质测定法检测蛋白质的释放。PLGA 通过酯键的水解降解，从而形成更大的孔隙，促进蛋白质的释放。微球的释放持续超过 60 天（图 3）。释放过程始于初始的突释阶段，随后随着微球的降解而持续释放。

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讨论

许多研究表明，神经细胞可受到形貌线索（纤维取向）和化学线索（生长因子）的引导1,2,10,11,35。静电纺丝是一种制备取向纤维的简便方法。生长因子能够促进神经生长，但为了将其引入神经导管（NC），需要一种可持续释放的方法。为了构建同时具备这两种信号的更有效系统，应将这两种信号结合起来。此前已有多种方法被研究用于在静电纺纤维支架中实现蛋白质的长效释放，以促进神经再生，但迄今为止尚无任何方法可实现超过60天的持续释放。此外，生长因子释放的空间模式化也尚未实现。本文中，我们描述了一种将静电纺丝与PLGA微球递送系统相结合的策略，以同时提供这两种信号。

传统的PLGA微球制备方法（如de Boer et al. 所述的方案）产生的微球尺寸较大33（300±100 µm），无法耐受静电纺丝过程。多次尝试将其掺入支架均未成功。因此，改用超声波破碎仪替代涡旋混合器，以更有效地分散第一相乳液并形成更小的微球。当微球尺寸减小至足够小时，便可顺利通过针头，并随溶液其余成分一同进行静电纺丝。本方案中，主要的静电纺丝溶液溶于水中，而非使用剧烈...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由理查德·巴伯基金会和托马斯·拉姆尔奖学金（TJW）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DAPIInvitrogenD1306
Irgacure 2959BASF24650-42-8避光保存
PEO 900 kDaSigma-Aldrich189456
甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰罗丹明BPolysciences, Inc.23591-100用DMSO配制储备液
注射泵KD ScientificKDS100
电源Gamma High VoltageES30P-5W
电机Triem Electric Motors, Inc0132022-15必须连接至定制芯轴
转速计Network Tool WarehouseESI-330用于监测芯轴转速
带准直适配器的Omnicure紫外点固化系统EXFOS1000
针头Fisher Scientific14-825-16H
盖玻片Fisher Scientific12-545-81
聚乙烯醇Sigma-AldrichP8136-250G
异丙醇Sigma-AldrichI9030-500mL
牛血清白蛋白（BSA）Fisher ScientificBP9703-100
BSA-FITCSigma-Aldrich080M7400
β-神经生长因子（NGF）R&D Systems1156-NG
65:35 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）Sigma-Aldrich1001554270
二氯甲烷Sigma-Aldrich34856-2L
考马斯亮蓝（Bradford）蛋白检测试剂盒Thermo Scientific1856209
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯Sigma-Aldrich1001558456
纤连蛋白Sigma-AldrichF2006
DMEMLonza12-604F
FBSAtlanta BiologicalsS11150
PBSHycloneSH30256.01
谷氨酰胺Fisher ScientificG7513
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4333
多聚甲醛Alfa AesarA11313 

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电纺将生长因子释放微球融入纤维支架
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