该方法展示了如何在发育中的小鼠前脑中靶向中间神经元 在子宫内 电穿孔。该技术在实现定位于皮层浅层的中间神经元亚型中选择性基因表达方面尤为高效。
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本文内容
摘要
摘要
中枢神经系统（CNS）成熟的研究依赖于对特定神经元群体的基因靶向。然而，将目的基因的表达限制在特定神经元亚型中一直面临巨大挑战，其原因在于特异性启动子元件相对稀缺。GABA能中间神经元是一类在遗传和形态上具有高度多样性的神经元群体。事实上，已在小鼠皮层中鉴定出超过11种不同类型的GABA能中间神经元。1在此，我们介绍一种用于选择性靶向GABA能细胞群的改进方案。通过利用同源框转录因子的增强子元件，我们实现了对GABA能中间神经元亚型的选择性靶向。 Dlx5 和 Dlx6 果蝇远端-less（distal-less，Dll）基因的同源基因2,3，以驱动特定基因的表达 在子宫内 电穿孔
引言
大部分皮层GABA能中间神经元起源于两个短暂存在的胚胎结构，即内侧和尾侧神经节隆起（MGE和CGE）4。表达小清蛋白和生长抑素的中间神经元起源于MGE，而表达钙视网膜蛋白（Cr）、血管活性肠肽（VIP）和Reelin（Re）的中间神经元则起源于CGE。这些中间神经元亚型可根据其出生时间加以区分。MGE来源的亚型诞生于胚胎第9.5天（e9.5）至e16.5之间5,6；相比之下，CGE来源的中间神经元诞生时间从e12.5持续到e18.5，其生成高峰出现在e15.56。然而，对这一晚期出生细胞群体的遗传靶向仍不明确。
小鼠远侧基因（Dlx）仅在发育中的腹侧前脑中表达3GABA能中间神经元和纹状体投射神经元表达该蛋白，而皮层锥体细胞不表达 Dlx1,2,5, 和 6 早期发育阶段的基因3确实， Dlx 基因在所有 GABA 能前体细胞的 MGE 和 CGE 室下区（SVZ）中均有表达。在终末分裂后阶段，这些基因的表达逐渐局限于特定亚型。7-9. 既往实验证据表明 Dlx5/6 增强子元件可在转基因小鼠模型中实现对GABA能谱系的特异性靶向2我们测试了其中一个增强子元件在小鼠发育脑中附加体表达体系中的应用。将Dlx5/6增强子元件与一个最小启动子及增强型绿色荧光蛋....
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方案
所有动物的处理均遵循纽约大学医学院机构动物护理和使用委员会的规定与指南。
小鼠品系
实验所用 Swiss Webster 雌性小鼠由 TACONIC 公司提供。为特异性靶向浅层中间神经元，使用了 e15.5 胚胎。
注意：本研究中使用的质粒（Dlx5/6.eGFP 质粒，3 µg/µl）通过标准克隆技术构建。将 eGFP cDNA 克隆至 Dlx5/6-Pmin-polyA 质粒中。该质粒可应要求提供（demarn02@nyumc.org）。
1. 显微注射移液管的制备
- 将拉制仪的加热值 #2 设为 860。
- 将玻璃毛细管放置并固定在灯丝附近。检查移液管的外径（OD）约为 30 μm。
- 按下“拉制”按钮。
- 小心取下毛细管。底部部分为针尖，丢弃上部部分。
2. 麻醉操作步骤
- 准备一个含有异氟烷的麻醉舱。注：异氟烷是首选麻醉剂，因其起效快且副作用发生率低。戊巴比妥钠是另一种选择，但个体对该药物的耐受性差异较大，可能导致比异氟烷更高的死亡率。
- 将异氟烷的流量设置为0.5–1 L/min氧气中的4–5%2....
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结果
我们改进了 在子宫内 电穿孔技术以实现对成熟神经元的细胞类型特异性靶向。为了驱动eGFP在CGE来源的中间神经元中的表达，我们采用了 Dlx5/6 增强子元件，并将注射时间限制在e15.5，即大多数来源于CGE的中间神经元生成的阶段。我们在P8和P15进行分析 11(图1 和 2）。我们通过共电穿孔一个标记物来确认电穿孔神经元的腹侧起源 CAG-mCherry 和一个 Dlx5/6-eGFP 在e15.5时以等摩尔浓度转染质粒。在本实验中，我们观察到仅有位于室下区（SVZ）的腹侧前体细胞同时表达这两种蛋白11荧光蛋白的这种时空表达模式与正常发育过程中基因的表达模式相一致 Dlx5 和 6 基因，在心室区不表达但在室下区表达4此外，我们评估了GABA能特性 Dlx5/6-mCherry 电穿孔的中间神经元在 GAD67-eGFP 基因敲入小鼠品系。我们发现，绝大多数.......
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讨论
该技术的局限性
尽管该技术可用于细胞自主性地分析细胞过程，但不适用于群体分析。电穿孔细胞非常稀疏，每脑组织中电穿孔细胞少于一千个。因此，该技术无法用于评估由CGE来源的中间神经元遗传操作所引发的行为学后果。
尽管在 e13.5-e14.5 时期进行的电穿孔主要靶向MGE来源的亚型，但其效率较低10。我们推测，在染色体外表达的背景下，Dlx5/6增强子在终末分裂后的MGE亚型中活性较低。
相对于现有方法的意义
该技术代表了先前用于研究中间神经元的电穿孔方法12,13的改进。由于这类神经元相对稀少且起源于胚胎腹侧，因此难以对其进行靶向研究。我们的技术提供了对CGE来源的中间神经元进行细胞自主性分析的手段。高水平的eGFP表达使得能够对单个中间神经元进行可视化和分析。
未来应用
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢李红音提供的技术协助。NVD 是 NARSAD 青年研究者奖的获得者，并获得美国国立卫生研究院（NIH）基金（5 K99 MH095825-02）的支持。Fishell 实验室的研究工作得到美国国立卫生研究院、国家精神卫生研究所（5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09）、国家神经疾病与中风研究所（5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972-01A1）以及西蒙斯基金会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带脚踏开关的电穿孔仪 | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm 电穿孔板状电极 | Protech International | CUY650P5 | |
| 加热垫 | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 拉制仪 | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac 麻醉系统 | Harvard Apparatus | 726425 | |
| 精细手术剪 4.75" 直型 锐/锐 | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 黑色丝线编织缝线 18" C-1 36 根/盒 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| 微型夹子施加镊子 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 双夹剪刀 | Roboz | RC-4894 | |
| 持取镊 | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| 玻璃毛细管 | FHC | 27-30-0 | 硼硅酸盐 1.0 mm 外径 × 0.75 mm 内径 |
| 快绿染料 | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| 无菌磷酸盐缓冲液 | Life Technologies | 20012-027 |
参考文献
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K.
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重印与许可
