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皮层中间神经元亚型选择性电穿孔

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DOI：

10.3791/51518

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2014年8月18日

 , 
1NYU Neuroscience Institute, New York University School of Medicine, 2Brain and Mind Research Institute, Weill Cornell Medical College

本文内容

摘要

该方法展示了如何在发育中的小鼠前脑中靶向中间神经元 在子宫内 电穿孔。该技术在实现定位于皮层浅层的中间神经元亚型中选择性基因表达方面尤为高效。

摘要

中枢神经系统（CNS）成熟的研究依赖于对特定神经元群体的基因靶向。然而，将目的基因的表达限制在特定神经元亚型中一直面临巨大挑战，其原因在于特异性启动子元件相对稀缺。GABA能中间神经元是一类在遗传和形态上具有高度多样性的神经元群体。事实上，已在小鼠皮层中鉴定出超过11种不同类型的GABA能中间神经元。1在此，我们介绍一种用于选择性靶向GABA能细胞群的改进方案。通过利用同源框转录因子的增强子元件，我们实现了对GABA能中间神经元亚型的选择性靶向。 Dlx5 和 Dlx6 果蝇远端-less（distal-less，Dll）基因的同源基因2,3，以驱动特定基因的表达 在子宫内 电穿孔

引言

大部分皮层GABA能中间神经元起源于两个短暂存在的胚胎结构，即内侧和尾侧神经节隆起（MGE和CGE）4。表达小清蛋白和生长抑素的中间神经元起源于MGE，而表达钙视网膜蛋白（Cr）、血管活性肠肽（VIP）和Reelin（Re）的中间神经元则起源于CGE。这些中间神经元亚型可根据其出生时间加以区分。MGE来源的亚型诞生于胚胎第9.5天（e9.5）至e16.5之间5,6；相比之下，CGE来源的中间神经元诞生时间从e12.5持续到e18.5，其生成高峰出现在e15.56。然而，对这一晚期出生细胞群体的遗传靶向仍不明确。

小鼠远侧基因（Dlx）仅在发育中的腹侧前脑中表达3GABA能中间神经元和纹状体投射神经元表达该蛋白，而皮层锥体细胞不表达 Dlx1,2,5, 和 6 早期发育阶段的基因3确实， Dlx 基因在所有 GABA 能前体细胞的 MGE 和 CGE 室下区（SVZ）中均有表达。在终末分裂后阶段，这些基因的表达逐渐局限于特定亚型。7-9. 既往实验证据表明 Dlx5/6 增强子元件可在转基因小鼠模型中实现对GABA能谱系的特异性靶向2我们测试了其中一个增强子元件在小鼠发育脑中附加体表达体系中的应用。将Dlx5/6增强子元件与一个最小启动子及增强型绿色荧光蛋白（eGFP）一起亚克隆至蓝脚本（BS）骨架质粒中图1）。我们通过以下方式引入质粒： 在子宫内 在E15.5时期通过电穿孔选择性靶向Cr-、VIP和Re-亚型3,8,10我们的技术可实现稀疏电穿孔，有助于单个细胞形态特征的重建。此外，皮层GABA能神经元中异常高水平的基因表达为功能研究提供了便利。我们利用多种野生型和显性负性基因进行了基因功能缺失和功能获得研究。11.

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方案

所有动物的处理均遵循纽约大学医学院机构动物护理和使用委员会的规定与指南。

小鼠品系
实验所用 Swiss Webster 雌性小鼠由 TACONIC 公司提供。为特异性靶向浅层中间神经元，使用了 e15.5 胚胎。

注意：本研究中使用的质粒（Dlx5/6.eGFP 质粒，3 µg/µl）通过标准克隆技术构建。将 eGFP cDNA 克隆至 Dlx5/6-Pmin-polyA 质粒中。该质粒可应要求提供（demarn02@nyumc.org）。

1. 显微注射移液管的制备

  1. 将拉制仪的加热值 #2 设为 860。
  2. 将玻璃毛细管放置并固定在灯丝附近。检查移液管的外径（OD）约为 30 μm。
  3. 按下“拉制”按钮。
  4. 小心取下毛细管。底部部分为针尖，丢弃上部部分。

2. 麻醉操作步骤

  1. 准备一个含有异氟烷的麻醉舱。注：异氟烷是首选麻醉剂，因其起效快且副作用发生率低。戊巴比妥钠是另一种选择，但个体对该药物的耐受性差异较大，可能导致比异氟烷更高的死亡率。
  2. 将异氟烷的流量设置为0.5–1 L/min氧气中的4–5%2.
  3. 确保腔室的阀门处于打开状态，而头部适配器的阀门处于关闭状态。
  4. 将怀孕的小鼠放入实验舱内。
  5. 让小鼠进入麻醉状态，此过程大约需要2-3分钟。观察呼吸频率，若小鼠出现过度通气，应降低异氟烷剂量。
  6. 小鼠麻醉后，立即从麻醉舱中取出，腹侧朝上置于加热垫上，并将头部插入面罩，术中持续通过面罩输送异氟烷。确保将异氟烷气流从麻醉舱切换至连接头部适配器的导管。每只眼睛滴一滴眼用润滑剂，并闭合眼睑。
  7. 将加热垫设置为36 °C，以尽量减少低体温的发生。
  8. 通过捏后肢脚掌和尾巴，检查足部和尾部反射是否消失。

3. 手术

  1. 用70%乙醇清洁腹部皮肤。
  2. 使用镊子将皮肤向上提起。每次手术后，用洗涤剂和水清洗所有器械，并在72 °C下过夜灭菌。
  3. 沿腹中线做一小段垂直切口（约2 cm），起始位置位于第三和第四对乳腺之间中点处。使用精细手术剪刀，注意不要损伤腹壁。
  4. 轻柔地将皮肤与腹膜分离。
  5. 观察腹壁上的动脉和静脉。在避开血管的前提下，通过腹膜再做一段约2 cm的垂直切口，以暴露腹腔。
  6. 在两侧用夹子固定皮肤和腹壁，注意避免夹住动脉。注意：若不慎刺破动脉，应立即通过颈椎脱位或异氟烷过量处死动物。
  7. 将无菌PBS预热至37 °C。用PBS浸湿的Kimwipe纸巾覆盖夹子。
  8. 用PBS润湿暴露的腹腔。手术过程中需多次重复此步骤。
  9. 使用圆头镊子轻柔地将胚胎串（e15.5）从腹腔中拉出，使其置于湿润的擦拭纸上。先暴露子宫的一侧半部分；待该侧胚胎完成电穿孔后，将其放回体内，再对另一侧进行操作。

4. 电穿孔

  1. 继续使用圆头镊子操作胚胎。
  2. 观察侧脑室。侧脑室沿中线走行（图1b).
  3. 向DNA溶液中加入快绿（储存液：10% w/v），配制成1:20的混合液，以便在注射过程中观察。通过标准大提纯试剂盒纯化流程获得质粒沉淀后，将其溶解于蒸馏水中，制备DNA溶液。
  4. 使用带推杆的预拉制微量移液管注入1 ml DNA溶液（Dlx5/6-eGFP 用Fast Green将DNA溶液（3 µg/µl）染色。使用Dumont #5精细镊子剪切微量移液针尖，使针尖从肩部起始处至末端长度保留6 mm，然后装入移液针。用圆形镊子固定胚胎头部。以45°角将移液针插入脑部，目标为靠近中线的侧脑室。若针头穿透脑室，边缓慢回撤移液针边用活塞推注DNA溶液。当溶液开始填充脑室时，脑室应呈现绿色。此时停止移动移液针，注入1 ml DNA溶液，然后轻柔地抽出移液针。
  5. 将CUY21电穿孔仪设置为5次脉冲，每次45 V，持续50毫秒，间隔950毫秒。
  6. 使用5 mm的桨状电极对e15.5胚胎进行操作。将电极浸入PBS中，以确保电流有效传导。
  7. 将电极板放置于胚胎头部周围，正极电极板置于含有DNA溶液的脑室一侧。将正极电极板相对于负极电极板略微下移，以在神经节隆起处形成向腹侧的电流。该操作可最大限度减少锥体细胞中的异位表达。
  8. 放置电极后，通过踩下脚踏开关一次来施加脉冲。
  9. 移除电极并将其擦拭干净。对每个胚胎重复步骤 4.6–4.9。
  10. 所有胚胎电穿孔后，向腹腔内注入 3 ml PBS，并将胚胎放回腹腔。
  11. 首先使用弯针和5-0丝线缝合腹壁，然后缝合皮肤。在伤口处涂抹利多卡因（4%）。经口给予120 mg/kg阿司匹林 腹膜用于镇痛。
    注意：整个操作应在20分钟或更短时间内完成。建议初学者仅对少量胚胎进行电穿孔，以缩短操作时间。手术时间过长会降低胚胎存活率。
  12. 将动物从麻醉管路中取出，置于铺有纸巾的加热垫上使其恢复。
  13. 将动物放回笼中，置于37 °C加热垫上，并监测其健康状况。动物通常对手术耐受良好，在脱离麻醉管后不久即可开始缓慢活动。若观察到大量出血或嗜睡现象，应立即按照IACUC批准的安乐死程序（如颈椎脱位或麻醉过量）处死动物。
  14. 将笼子放回动物饲养室。雌鼠将自然分娩。

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结果

我们改进了 在子宫内 电穿孔技术以实现对成熟神经元的细胞类型特异性靶向。为了驱动eGFP在CGE来源的中间神经元中的表达，我们采用了 Dlx5/6 增强子元件，并将注射时间限制在e15.5，即大多数来源于CGE的中间神经元生成的阶段。我们在P8和P15进行分析 11(图1 和 2）。我们通过共电穿孔一个标记物来确认电穿孔神经元的腹侧起源 CAG-mCherry 和一个 Dlx5/6-eGFP 在e15.5时以等摩尔浓度转染质粒。在本实验中，我们观察到仅有位于室下区（SVZ）的腹侧前体细胞同时表达这两种蛋白11荧光蛋白的这种时空表达模式与正常发育过程中基因的表达模式相一致 Dlx5 和 6 基因，在心室区不表达但在室下区表达4此外，我们评估了GABA能特性 Dlx5/6-mCherry 电穿孔的中间神经元在 GAD67-eGFP 基因敲入小鼠品系。我们发现，绝大多数...

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讨论

该技术的局限性

尽管该技术可用于细胞自主性地分析细胞过程，但不适用于群体分析。电穿孔细胞非常稀疏，每脑组织中电穿孔细胞少于一千个。因此，该技术无法用于评估由CGE来源的中间神经元遗传操作所引发的行为学后果。

尽管在 e13.5-e14.5 时期进行的电穿孔主要靶向MGE来源的亚型，但其效率较低10。我们推测，在染色体外表达的背景下，Dlx5/6增强子在终末分裂后的MGE亚型中活性较低。

相对于现有方法的意义

该技术代表了先前用于研究中间神经元的电穿孔方法12,13的改进。由于这类神经元相对稀少且起源于胚胎腹侧，因此难以对其进行靶向研究。我们的技术提供了对CGE来源的中间神经元进行细胞自主性分析的手段。高水平的eGFP表达使得能够对单个中间神经元进行可视化和分析。

未来应用

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢李红音提供的技术协助。NVD 是 NARSAD 青年研究者奖的获得者，并获得美国国立卫生研究院（NIH）基金（5 K99 MH095825-02）的支持。Fishell 实验室的研究工作得到美国国立卫生研究院、国家精神卫生研究所（5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09）、国家神经疾病与中风研究所（5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972-01A1）以及西蒙斯基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带脚踏开关的电穿孔仪 Protech InternationalCUY21
5 mm 电穿孔板状电极 Protech InternationalCUY650P5
加热垫 Kent ScientificDCT-15
Sutter Instruments P30 拉制仪 Sutter Instruments3282322
Fluovac 麻醉系统Harvard Apparatus726425
精细手术剪 4.75" 直型 锐/锐RobozRS-6702
5-0 黑色丝线编织缝线 18" C-1 36 根/盒RobozSUT-1073-21
微型夹子施加镊子 5.5"RobozRS-5410
双夹剪刀RobozRC-4894
持取镊 Fine Science Tools11031-15
玻璃毛细管 FHC27-30-0硼硅酸盐 1.0 mm 外径 × 0.75 mm 内径
快绿染料Sigma-AldrichF7258 
无菌磷酸盐缓冲液Life Technologies20012-027

参考文献

  1. Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
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GABA Dlx5 Dlx6 DNA GFP

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