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方法文章

人类多能干细胞培养、维持与遗传分析的替代培养体系

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DOI：

10.3791/51519

⸱

2014年7月24日

 ,  ,  , 
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

本文内容

摘要

本文介绍了基于解离的单细胞非克隆型单层（NCM）生长的人多能干细胞（hPSC）培养方案。这一新方法利用Rho相关激酶抑制剂或层粘连蛋白异构体521（LN-521），适用于大量生产均一的hPSCs，以及进行基因操作和药物筛选。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）在再生医学和生物制药领域具有广阔的应用前景。目前，临床级hPSCs的优化培养与高效扩增是hPSC相关治疗中的关键问题。传统上，hPSCs通常以集落形式在饲养层或无饲养层的培养体系中进行传代培养。然而，这些方法存在若干主要局限性，包括细胞得率低以及产生异质性分化的细胞。为了改进现有的hPSCs培养方法，我们近期开发了一种新方法，该方法基于解离的单细胞进行非集落型单层（NCM）培养。本文详细介绍了基于Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632的NCM培养方案。同时，我们还提供了使用其他小分子化合物进行NCM培养的新信息，包括Y-39983（ROCK I抑制剂）、苯并二氧杂环己烷（ROCK II抑制剂）和噻唑维林（一种新型ROCK抑制剂）。此外，我们在基础方案的基础上进一步拓展，实现了在特定细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白异构体521（LN-521））上培养hPSCs，且无需使用ROCK抑制剂。更重要的是，基于NCM培养体系，我们已成功实现将质粒DNA、慢病毒颗粒以及基于寡核苷酸的microRNA高效转染或转导至hPSCs中，从而对这些细胞进行遗传修饰，以用于分子分析和药物筛选。NCM培养方法克服了传统集落型培养的主要缺陷，因此可能适用于未来临床治疗、干细胞研究及药物发现中大量均质hPSCs的制备。

引言

人多能干细胞（hPSCs）向多种成体组织分化的潜能为治疗患有严重心血管、肝脏、胰腺及神经系统疾病患者的患者开辟了新的途径1-4。来源于hPSCs的各类细胞还可为疾病建模、基因工程、药物筛选和毒理学检测提供强有力的细胞平台1,4。确保其未来在临床和药理学应用中的关键问题，是通过体外（in vitro）细胞培养获得大量符合临床级标准的hPSCs。然而，目前的培养体系要么效率不足，要么本身存在变异性，包括使用饲养层或无饲养层条件下以克隆形态培养hPSCs的各种方法5,6。

人多能干细胞（hPSCs）的集落型生长方式与早期哺乳动物胚胎的内细胞团（ICM）具有许多相似的结构特征。由于存在异质性信号梯度，ICM在多细胞环境中容易分化为三个胚层。因此，早期胚胎发育过程中异质性的获得被认为是分化的必要过程，但在hPSC培养中却是不希望出现的特征。hPSC培养中的异质性通常由过度的凋亡信号以及因非最佳生长条件导致的自发性分化所引起。因此，在集落型培养中，异质性细胞常出现在集落的边缘区域7,8。已有研究显示，人胚胎干细胞（hESC）集落中的细胞对BMP-4等信号分子的反应存在差异 9。此外，由于细胞增殖速率不可控以及凋亡信号通路的影响，集落培养方法的细胞产量较低，且冻存后细胞复苏率极低6,9。近年来，已开发出多种悬浮培养方法用于hPSC的培养，特别是用于在无饲养层和无基质条件下扩增大量hPSC6,10-13。显然，不同的培养系统各有优缺点。总体而言，hPSC的异质性是集落型培养和聚集体培养方法的主要缺陷之一，这些方法在向hPSC递送DNA和RNA等遗传工程材料时效率较低6。

显然，迫切需要开发能够克服现有培养方法某些不足的新体系。小分子抑制剂（如ROCK抑制剂Y-27632和JAK抑制剂1）的发现显著提高了单细胞存活率，为解离态人多能干细胞（hPSC）的培养奠定了基础14,15。利用这些小分子，我们近期建立了一种基于解离态hPSC非克隆形态（NCM）生长的培养方法9。这种新型培养方法结合了单细胞传代与高密度接种技术，可在稳定的生长周期中大量生产均一的hPSC，且不出现主要的染色体异常9。此外，NCM培养还可结合不同的小分子和明确的基质（如层粘连蛋白）进行优化，以适应更广泛的应用需求。本文提供了基于NCM培养的多个详细实验方案，并阐述了基因工程操作的具体步骤。为展示NCM方案的通用性，我们还测试了多种ROCK抑制剂以及单一的层粘连蛋白异构体521（i.e.，LN-521）在NCM培养中的应用效果。

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方案

基于单细胞的非克隆型单层（NCM）培养人多能干细胞（hPSCs）。

1. 准备工作

  1. 制备 500 ml 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）培养用培养基：DMEM 培养基添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和 0.1 mM 非必需氨基酸（NEAA）。
  2. 按照常规方案16分离来源于 CF1 品系的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），并在经 0.1% 明胶包被的 6 孔细胞培养板中用 DMEM 培养基进行培养。或者，可从商业来源购买第 3 代的 MEF 原代细胞。
  3. 制备 Matrigel 包被板。
    1. 将 5 ml 经 hESC 验证的 Matrigel 原液与 5 ml 预冷（约 4 °C）的 DMEM/F12 培养基混合稀释，分装为 50% 的等份，储存于 -20 °C 冰箱中。将冷冻的 Matrigel 原液在冰箱（约 4 °C）中过夜（O/N）解冻，再用预冷的 DMEM/F12 培养基进一步稀释，得到 2.5% 的工作浓度。
    2. 用 2.5% Matrigel 溶液每孔 1.5 ml 包被 6 孔细胞培养板，包被后的培养板于冰箱中过夜（O/N）储存（注意：Matrigel 包被板需在两周内使用）。
    3. 将 Matrigel 包被板从冰箱中取出，在细胞培养超净台中室温（RT）平衡 10 至 30 分钟（注意：切勿将培养板置于细胞培养箱中升温），在接种 hPSCs 前吸除 DMEM 培养基。
  4. 制备 500 ml hESC 培养基：80% DMEM/F12 培养基、20% KSR、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM 非必需氨基酸、0.1 mM β-巯基乙醇和 4 ng/ml FGF-2。
  5. 制备 10 ml 2X hPSC 冻存液：含 60% FBS、20% DMSO 和 20 µM Y-27632 的 mTeSR1 培养基，经过滤除菌，一周内使用。

2. 方案1（基础）：在饲养层上培养人多能干细胞集落

  1. 使用传代次数为5或6（记为p5和p6）的MEF用于hPSC培养，以获得稳定一致的结果。通过用10 μg/ml的药物处理细胞，使MEF有丝分裂失活 用丝裂霉素C在37 °C处理3小时，用1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D-PBS）洗涤细胞3次，然后使用含0.53 mM EDTA的0.05%胰蛋白酶消化MEF细胞。或者，使用X射线照射仪以8,000 rad剂量照射MEF细胞。
  2. 使用台盼蓝染色排除法在显微镜下计数细胞数量。或者，使用自动细胞计数仪。
  3. 将经照射的MEFs以1.88 × 10⁵细胞/孔的密度接种于6孔聚苯乙烯培养板中，培养板预先用0.1%明胶包被5 每孔细胞数（即，1.96 × 104 细胞/平方厘米2）。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 24 小时
  4. 用巴斯德吸管抽吸去除MEF培养基（注意：此时无需洗涤步骤）。
  5. 将前次培养的hPSC集落吹打成小细胞团，于显微镜下观察，确保其直径大小在50至100 μm范围内，并将hPSC细胞团接种至含2 ml培养基的一孔中，置于MEF饲养层顶部 人多能干细胞（hPSC）培养基
  6. 每日更换hESC培养基，持续3至5天，通过拍照记录细胞集落生长情况，标记任何形态改变或已分化的集落（约5%），并用巴斯德吸管轻柔抽吸，手动去除标记的集落。
  7. 用 D-PBS 将残留在 MEF 上的克隆洗涤两次（每次 2 分钟），然后加入 2 ml 培养基孵育克隆 1 mg/ml 在hPSC培养基中使用IV型胶原酶消化10至30分钟，观察hPSC集落从MEF包被表面的脱落情况（注意：仅当集落与培养皿结合紧密时，可使用细胞刮辅助脱落过程）。
  8. 加入 5 ml 将 hPSC 培养基加入每个孔中，以尽量减少 酶促反应，将菌落转移至15 ml 试管，室温下静置3至5分钟，使hPSC细胞集落自然沉降，并通过直接观察试管底部的细胞确认集落已沉降（注意：此步骤中不要离心试管）。
  9. 移除含有残留MEF和解离的单个细胞的上清液，用5 ml重悬集落 加入hESC培养基，并重复沉淀步骤两次。
  10. 移除培养基，将hPSC集落吹打成小团块，置于1X hPSC冻存液（或CryoStore CS10冻存液）中进行冻存（每支冻存管对应一个汇合度达100%的孔），或接种至6孔板中用于细胞传代。

3. 方案2：将饲养层上的hPSC克隆转化为无饲养层培养

  1. 用 D-PBS 清洗 hPSC 细胞团一次，然后将细胞团与 1 ml 使用1× Accutase消化10分钟，并在显微镜下观察酶解反应，以确保细胞完全解离为单细胞。
  2. 通过在5 ml溶液中轻轻重悬细胞来终止酶促反应 含10 μM Y-27632的mTeSR1培养基，随后以200 x g离心 g 室温下离心5分钟（注意：避免使用过高的离心力，以免造成细胞损伤）。
  3. 加入 5 ml 加入 mTeSR1 培养基至细胞沉淀中，将沉淀重悬为单细胞，并通过 40 µm 细胞滤网过滤解离后的细胞（以去除任何残留的细胞团块）。
  4. 种子 1.3-2 × 106 将hPSCs加入一个孔中（1.4-2.1 x 105 细胞/厘米²2) 加入 mTeSR1 培养基至 2.5 ml，并在培养基中添加 10 µM Y-27632（以促进最初 24 小时的细胞存活） hr 单细胞铺板）。或者，可使用以下小分子替代 10 μM Y-27632 以增强单细胞铺板效率：1 µM Y-39983（ROCK I 抑制剂）、1 µM phenylbenzodioxane（ROCK II 抑制剂）、1 µM thiazovivin（一种新型 ROCK 抑制剂）和 2 μM JAK inhibitor 1。
  5. 第二天（24小时内）更换为不含药物的mTeSR1培养基，从额外的一个孔中消化细胞并计数，以确定单细胞铺板效率（注意：此阶段单细胞铺板效率通常可达50%至90%）。
  6. 让细胞在3 ml培养基中生长数天，形成由单层细胞构成的单层。 mTeSR1 培养基。每天更换培养基。
  7. 根据细胞密度，凭经验确定适应性 NCM 的传代时间。当细胞生长在第 3 天或第 4 天达到汇合状态时进行传代，或在第 4 天 小时 细胞间边界消失后的指定时间点。在1 ml中解离细胞 的Accutase，使用1至 3 分裂比例即，将细胞接种于6孔板的3个孔中，每孔1个汇合度良好的细胞孔，用于细胞传代，并通过连续5次传代使NCM适应并稳定。
  8. 细胞冻存
    1. 利用一个汇合的孔（约 5-6 x106 细胞）每支冻存管：用1 ml将细胞从一个汇合的培养孔中解离 使用Accutase消化10分钟。
    2. 用5 ml稀释 mTeSR1 培养基，并按上述方法离心细胞。
    3. 将沉淀重悬于500 μl中 mTeSR1 培养基，然后缓慢加入 500 μl 在冻存管中加入含20 μM Y-27632的2X hPSC冻存培养基。或者，将细胞重悬于含2 μM JAK抑制剂1的1X hPSC冻存培养基中，或含10 μM Y-27632或2 μM JAK抑制剂1的1X CryoStor CS10培养基中。
    4. 将冻存管放入装有异丙醇的冰浴式冻存盒中（底部填充异丙醇），并立即转移至-80 °C超低温冰箱中。
    5. 将细胞从 -80 °C 冰箱转移至液氮罐中（次日），用于长期冷冻保存。
  9. 细胞解冻
    1. 使用一个冻存管接种6孔板中的1个孔。
    2. 将 mTeSR1 培养基在 37 °C 水浴中预热 10 分钟，于同一水浴中解冻细胞 2 分钟，然后将细胞逐滴加入 5 ml 加入含10 µM Y-27632的预热mTeSR1培养基，按上述方法离心。
    3. 轻轻用 2 ml 重悬细胞沉淀 含10 µM Y-27632的mTeSR1培养基，缓慢转移至预先包被Matrigel的孔中（注意：避免产生气泡）。
    4. 每天更换培养基，预期hPSC生长在第3或第4天达到汇合。

4. 方案3：将Matrigel上的人多能干细胞集落转化为NCM培养

  1. 从冰箱中取出一块Matrigel包被的培养板，将其放入组织培养超净台中静置10至30分钟，吸去每孔中的培养基，并向每孔加入2 ml 预热的mTeSR1培养基。
  2. 将经吹打重悬的hPSC细胞团块从饲养层培养物（基础方案第2.10步）转移至上述Matrigel包被的培养板中，每孔补加mTeSR1培养基至终体积2.5 ml 。
  3. 每日更换培养基，持续3至4天，直至细胞集落达到80%至90%融合度。
  4. 进行细胞传代时：用D-PBS洗涤集落两次，每孔加入1 ml 浓度为2 mg/ml 的dispase溶液，在37 °C条件下处理15至20分钟，随后将细胞团块沉淀并以团块形式进行传代。
  5. 进行NCM培养时：重复方案 2中所述的步骤3.1至3.9。

5. 方案4：hPSCs在LN-521上的NCM培养

  1. 在使用前一天于 4 °C 条件下解冻重组 LN-521 溶液，并用含 Ca2+/Mg2+ 的 1× D-PBS 将解冻后的层粘连蛋白稀释至终浓度为 10 μg/ml，配制层粘连蛋白包被液（LCS）。
  2. 向 6 孔板的每个孔中加入 1 ml  LCS（注意：包被过程中避免液体干涸）。
  3. 用 Parafilm 密封包被好的培养板以防止蒸发，并将培养板置于冰箱（4 °C）中过夜（O/N）保存（注意：请在 1 周内使用该培养板）。
  4. 用巴氏吸管轻轻吸除 LCS，避免接触包被表面，然后向每孔加入 2 ml  mTeSR1 培养基。
  5. 将所有培养液（包括 D-PBS）在 37 °C 水浴中预热 25 分钟。
  6. 将 hPSC 克隆转化为 NCM
    1. 按照方案 2 所述，使用 Accutase 将细胞聚集体消化为单细胞。
    2. 在无 ROCK 抑制剂存在的条件下，将 1.3–2 × 106  hPSC 接种至一个 LN-521 包被的孔中（1.4–2.1 × 105  细胞/cm2）。
    3. 连续 3 至 4 天每天更换培养基。
    4. 在第 3 或第 4 天，用 1 ml  Accutase 消化细胞，按 1:3 的传代比例进行后续细胞传代。

6. 方案5：用于质粒DNA转染的NCM培养

  1. 按照方案2至4所述，将hPSC集落适应于NCM培养。
  2. 将解离后的人多能干细胞以 7.5 × 10⁵ 细胞/孔的密度接种于 12 孔板中5 细胞/孔，使用 mTeSR1 培养基，并添加 10 μM Y-27632。
  3. 细胞接种后4-8小时内，将mTeSR1培养基更换为不含药物的mTeSR1培养基。
  4. 每次转染时，将 2.5 μg 表达质粒例如，pmaxGFP）以及分别在125 μl中加入5 μl Lipofectamine 2000至不同的Eppendorf管中 Opti-MEM 低血清培养基
  5. 5分钟后，混合稀释后的试剂，在室温下孵育20分钟（以形成转染复合物）。
  6. 加入 250 μl 将转染复合物加入含有1 ml mTeSR1培养基的各孔hPSC中，并将细胞在37 °C、CO₂培养箱中孵育2 孵育24小时
  7. 在荧光显微镜下观察转染效率，并随机拍摄图像以计算实际的转染效率。

7. 方案6：用于microRNA转染的NCM培养

  1. 在6孔板中，每孔加入1 ml Accutase，于NCM条件下对第2天的半融合hPSCs进行解离。
  2. 加入10 ml mTeSR1培养基以稀释酶反应，并在200 × g下离心5分钟。
  3. 用mTeSR1培养基重悬细胞沉淀，以每孔7.5 × 105个细胞的密度将细胞接种至12孔板中，培养基为含10 μM Y-27632的mTeSR1，并让细胞贴壁4小时。
  4. 更换为不含Y27632的mTeSR1培养基。
  5. 使用市售的microRNA（例如，用Dy547标记的非靶向miRIDIAN miRNA转染对照）。根据提供的试剂，使用0–160 nM范围内的不同浓度进行滴定，并遵循生产商的说明。
  6. 通过在转染后24小时于显微镜下观察活细胞的Dy547荧光，优化各浓度下hPSC系的转染效率。
  7. 根据Dy547阳性细胞占所有成像细胞的百分比，计算转染效率。

8. 方案7：用于慢病毒载体转导的NCM培养

  1. 重复方案6中的步骤7.1至7.4。
  2. 计算用于转导的病毒颗粒用量：使用以下公式：TU = (MOI × CN) / VT，其中TU表示转化单位总数，MOI为孔中期望的感染复数（MOI或TU/细胞），CN表示每孔中的细胞数量，VT表示病毒原液滴度（TU/mL）。例如，若SMART-shRNA载体的病毒原液滴度为1 × 109 TU/mL （每毫升转化单位），转导时每孔细胞数为7.5 × 105，期望MOI为20，则每孔使用15 μL 病毒原液（注：此条件适用于瞬时慢病毒诱导）。
  3. 将含10 mg/mL 聚凝胺的300 μL mTeSR1培养基预热30分钟。
  4. 将15 μL 病毒原液加入含聚凝胺的预热mTeSR1培养基中，轻轻混匀。
  5. 将细胞培养基更换为含病毒颗粒的300 μL 预热培养基。
  6. 孵育4小时后，观察turboGFP荧光（shRNA表达的标记），以确定转导效率。
  7. 当细胞开始表达turboGFP时，在转导孔中加入额外的300 μL mTeSR1培养基。
  8. 孵育12–16小时后，重新观察turboGFP表达情况。
  9. 在转导后72小时内，对这些转导细胞进行所需的后续实验。

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结果

NCM 培养的一般示意图

图1 展示了典型的NCM培养方案，显示了人多能干细胞（hPSCs）在ROCK抑制剂Y-27632存在下以高密度单细胞接种后的动态变化。这些形态学变化包括接种后细胞间的连接、细胞簇的形成、指数级细胞增殖，随后发生细胞凝聚（图1A）。一个代表性实验显示，WA01（H1）人胚胎干细胞系（hESCs）在第1天以1.9 × 105 个细胞/cm2 的密度在含10 μM Y-27632的条件下以单细胞形式接种（图1B，左图），第2天持续增殖且未形成克隆集落（图1B，中图），至第3天凝聚成均一的单层细胞，适用于后续实验或传代操作（图1B，右图）。

多种 ROCK 抑制剂支持 NCM 培养

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讨论

培养hPSCs主要有两种方法 体外：传统的集落型培养（在饲养层或细胞外基质上的细胞培养）和无饲养层的hPSC聚集体悬浮培养6两种集落型和悬浮培养方法的局限性包括累积的异质性以及可遗传的表观遗传学改变。NCM培养基于单细胞传代和高密度细胞接种，代表了一种新的hPSC生长培养方法。6,18尽管文献中已记载了多种单细胞传代方法，但这些方法均未用于常规传代培养。例如，Wu 及其同事采用单细胞传代方法研究了不同小分子混合物对 hPSC 增殖的影响19然而，这些方法最终获得的培养产物是克隆集落，因此基于低密度的单细胞传代方法仍属于克隆型培养。对于非克隆型培养（NCM），高密度接种将该培养方式转变为一种新方法，因为最终的细胞产物为均一的单层细胞。近期，Dvorak 及其同事采用类似方法，全面分析了人多能干细胞（hPSC）在此生长条件下的特性。18他们的结果也支持了我们的主要结论。目前可以明确的是，NCM 培养是一种新兴的方法，具有多种新特性，并可进一步优化，用于多能干细胞生物学中的诸多潜在应用。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家神经疾病与卒中研究所院内研究计划的支持。我们感谢Ronald D. McKay博士对本项目的讨论和意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Countess 自动细胞计数仪Invitrogen Inc.C10227自动细胞计数
Faxitron 机柜式 X 射线系统Faxitron X-ray Corporation，Wheeling，IL Model RX-650MEFs 的 X 射线照射
多孔 6 孔板Becton Dickinson Labware353046聚苯乙烯板
DMEMInvitrogen Inc.11965–092MEF 培养基的配制
丝裂霉素C罗氏107409有丝分裂抑制剂
胰蛋白酶Invitrogen Inc.25300-054用于MEF解离
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330–032用于hPSC培养基
Opti-MEM I 减血清培养基 Invitrogen Inc.31985-062用于hPSC转染
热灭活胎牛血清英潍捷基公司16000–044MEF 培养基组分
敲除血清替代物Invitrogen Inc.10828–028KSR，hPSC 培养基组分
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液Invitrogen Inc.14190-144D-PBS，不含 Ca2+/毫克2+
非必需氨基酸Invitrogen11140–050hPSC 培养基组分，NEAA
L-谷氨酰胺Invitrogen 25030–081hPSC 培养基组分
mTeSR1 &和补充剂StemCell Technologies5850无动物蛋白
TeSR2 &和补充剂StemCell Technologies5860无异源成分培养基
β-巯基乙醇Sigma M7522hPSC 培养基组分

MEF（CF-1）ATCC		美国典型培养物保藏中心 (ATCC) SCRC-1040用于hPSCs的饲养层培养
hESC认证级MatrigelBD Bioscience354277用于hPSCs的无饲养层培养
层粘连蛋白-521BioLaminaLN521-02人源重组蛋白
FGF-2（重组FGF，碱性）R&D Systems, MN223-FBhPSC 培养基中的生长因子
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
Accutase创新细胞技术AT-1041X 混合酶溶液
JAK抑制剂IEMD4 Biosciences420099Janus激酶抑制剂
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK抑制剂
Y-27632Stemgent04-0012ROCK抑制剂
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I 抑制剂
苯并二氧杂环己烷Stemgent04-0030ROCK II 抑制剂
噻唑维林Stemgent04-0017一种新型ROCK抑制剂
BD Falcon 细胞筛BD Bioscience35234040 µm细胞筛
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C赛默飞世尔科技 C6516F-1“Mr. Frosty” 冻存容器
Lipofectamine 2000英吉诺公司11668-027转染试剂
DharmaFECT Duo赛默飞世尔科技T-2010-02转染试剂
非靶向 miRIDIAN miRNA 转染对照赛默飞世尔科技IP-004500-01-05用 Dy547 标记，以监测 microRNA 的递送 
SMART-shRNAThermo Scientific 待确定慢病毒载体
pmaxGFPamaxa公司（Lonza）每个转染试剂盒均包含用于转染对照的表达质粒
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279小鼠 IgG2b，多能性标志物
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702小鼠IgM，分化标志物
SSEA-4Santa Cruz Biotechnologysc-21704小鼠 IgG3，多能性标志物
Tra-1-60Santa Cruz Biotechnologysc-21705 小鼠 IgM，多能性标志物
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706小鼠 IgM，多能性标志物
CK8（C51）Santa Cruz Biotechnologysc-8020小鼠 IgG1，抗细胞角蛋白 8
α甲胎蛋白Santa Cruz Biotechnologysc-8399甲胎蛋白（AFP），小鼠 IgG2a
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2，山羊多克隆抗体
肌钙蛋白T（Av-1）赛默飞世尔科技MS-295-P0小鼠 IgG1
结蛋白Thermo ScientificRB-9014-P1兔IgG
抗 NANOGReproCELL Inc, 日本RCAB0004P-F多克隆抗体 
大鼠抗GFAPZymed13-0300胶质纤维酸性蛋白
白蛋白（克隆 HSA1/25.1.3）Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513A小鼠 IgG1
平滑肌肌动蛋白（克隆 1A4）DakoCytomation IncIR611/IS611小鼠 IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326兔多克隆抗体
TUBB3康维公司MMS-435PTuj1，小鼠 IgG2a
HNF4α (C11F12)细胞信号传导技术3113兔单克隆抗体
多聚甲醛（溶液）电子显微镜科学公司15710PFA，固定剂，用 D-PBS 稀释

参考文献

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人类多能干细胞培养、维持与遗传分析的替代培养体系
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