本文介绍了基于解离的单细胞非克隆型单层（NCM）生长的人多能干细胞（hPSC）培养方案。这一新方法利用Rho相关激酶抑制剂或层粘连蛋白异构体521（LN-521），适用于大量生产均一的hPSCs，以及进行基因操作和药物筛选。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
人类多能干细胞（hPSCs）在再生医学和生物制药领域具有广阔的应用前景。目前，临床级hPSCs的优化培养与高效扩增是hPSC相关治疗中的关键问题。传统上，hPSCs通常以集落形式在饲养层或无饲养层的培养体系中进行传代培养。然而，这些方法存在若干主要局限性，包括细胞得率低以及产生异质性分化的细胞。为了改进现有的hPSCs培养方法，我们近期开发了一种新方法，该方法基于解离的单细胞进行非集落型单层（NCM）培养。本文详细介绍了基于Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632的NCM培养方案。同时，我们还提供了使用其他小分子化合物进行NCM培养的新信息，包括Y-39983（ROCK I抑制剂）、苯并二氧杂环己烷（ROCK II抑制剂）和噻唑维林（一种新型ROCK抑制剂）。此外，我们在基础方案的基础上进一步拓展，实现了在特定细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白异构体521（LN-521））上培养hPSCs，且无需使用ROCK抑制剂。更重要的是，基于NCM培养体系，我们已成功实现将质粒DNA、慢病毒颗粒以及基于寡核苷酸的microRNA高效转染或转导至hPSCs中，从而对这些细胞进行遗传修饰，以用于分子分析和药物筛选。NCM培养方法克服了传统集落型培养的主要缺陷，因此可能适用于未来临床治疗、干细胞研究及药物发现中大量均质hPSCs的制备。
引言
人多能干细胞（hPSCs）向多种成体组织分化的潜能为治疗患有严重心血管、肝脏、胰腺及神经系统疾病患者的患者开辟了新的途径1-4。来源于hPSCs的各类细胞还可为疾病建模、基因工程、药物筛选和毒理学检测提供强有力的细胞平台1,4。确保其未来在临床和药理学应用中的关键问题，是通过体外（in vitro）细胞培养获得大量符合临床级标准的hPSCs。然而，目前的培养体系要么效率不足，要么本身存在变异性，包括使用饲养层或无饲养层条件下以克隆形态培养hPSCs的各种方法5,6。
人多能干细胞（hPSCs）的集落型生长方式与早期哺乳动物胚胎的内细胞团（ICM）具有许多相似的结构特征。由于存在异质性信号梯度，ICM在多细胞环境中容易分化为三个胚层。因此，早期胚胎发育过程中异质性的获得被认为是分化的必要过程，但在hPSC培养中却是不希望出现的特征。hPSC培养中的异质性通常由过度的凋亡信号以及因非最佳生长条件导致的自发性分化所引起。因此，在集落型培养中，异质性细胞常出现在集落的边缘区域7,8。已有研究显示，人胚胎干细胞（hESC）集落中的细胞对BMP-4等信号分子的反应存在差异 9。此外，由于细胞增殖速率不可控以及凋亡信号通路的影响，集落培养方法的细胞产量较低，且冻存后细胞复苏率极低6,9。近年来，已开发出多种悬浮培养方法用于hPSC的....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
基于单细胞的非克隆型单层（NCM）培养人多能干细胞（hPSCs）。
1. 准备工作
- 制备 500 ml 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）培养用培养基：DMEM 培养基添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和 0.1 mM 非必需氨基酸（NEAA）。
- 按照常规方案16分离来源于 CF1 品系的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），并在经 0.1% 明胶包被的 6 孔细胞培养板中用 DMEM 培养基进行培养。或者，可从商业来源购买第 3 代的 MEF 原代细胞。
- 制备 Matrigel 包被板。
- 将 5 ml 经 hESC 验证的 Matrigel 原液与 5 ml 预冷（约 4 °C）的 DMEM/F12 培养基混合稀释，分装为 50% 的等份，储存于 -20 °C 冰箱中。将冷冻的 Matrigel 原液在冰箱（约 4 °C）中过夜（O/N）解冻，再用预冷的 DMEM/F12 培养基进一步稀释，得到 2.5% 的工作浓度。
- 用 2.5% Matrigel 溶液每孔 1.5 ml 包被 6 孔细胞培养板，包被后的培养板于冰箱中过夜（O/N）储存（注意：Matrigel 包被板需在两周内使用）。
- 将 Matrigel 包被板从冰箱中取出，在细胞培养超净台中室温（RT）平衡 10 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
NCM 培养的一般示意图
图1 展示了典型的NCM培养方案，显示了人多能干细胞（hPSCs）在ROCK抑制剂Y-27632存在下以高密度单细胞接种后的动态变化。这些形态学变化包括接种后细胞间的连接、细胞簇的形成、指数级细胞增殖，随后发生细胞凝聚（图1A）。一个代表性实验显示，WA01（H1）人胚胎干细胞系（hESCs）在第1天以1.9 × 105 个细胞/cm2 的密度在含10 μM Y-27632的条件下以单细胞形式接种（图1B，左图），第2天持续增殖且未形成克隆集落（图1B，中图），至第3天凝聚成均一的单层细胞，适用于后续实验或传代操作（图1B，右图）。
多种 ROCK 抑制剂支持 NCM 培养
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
培养hPSCs主要有两种方法 体外：传统的集落型培养（在饲养层或细胞外基质上的细胞培养）和无饲养层的hPSC聚集体悬浮培养6两种集落型和悬浮培养方法的局限性包括累积的异质性以及可遗传的表观遗传学改变。NCM培养基于单细胞传代和高密度细胞接种，代表了一种新的hPSC生长培养方法。6,18尽管文献中已记载了多种单细胞传代方法，但这些方法均未用于常规传代培养。例如，Wu 及其同事采用单细胞传代方法研究了不同小分子混合物对 hPSC 增殖的影响19然而，这些方法最终获得的培养产物是克隆集落，因此基于低密度的单细胞传代方法仍属于克隆型培养。对于非克隆型培养（NCM），高密度接种将该培养方式转变为一种新方法，因为最终的细胞产物为均一的单层细胞。近期，Dvorak 及其同事采用类似方法，全面分析了人多能干细胞（hPSC）在此生长条件下的特性。18他们的结果也支持了我们的主要结论。目前可以明确的是，NCM 培养是一种新兴的方法，具有多种新特性，并可进一步优化，用于多能干细胞生物学中的诸多潜在应用。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家神经疾病与卒中研究所院内研究计划的支持。我们感谢Ronald D. McKay博士对本项目的讨论和意见。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Countess 自动细胞计数仪 | Invitrogen Inc. | C10227 | 自动细胞计数 |
| Faxitron 机柜式 X 射线系统 | Faxitron X-ray Corporation，Wheeling，IL | Model RX-650 | MEFs 的 X 射线照射 |
| 多孔 6 孔板 | Becton Dickinson Labware | 353046 | 聚苯乙烯板 |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | MEF 培养基的配制 |
| 丝裂霉素C | 罗氏 | 107409 | 有丝分裂抑制剂 |
| 胰蛋白酶 | Invitrogen Inc. | 25300-054 | 用于MEF解离 |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | 用于hPSC培养基 |
| Opti-MEM I 减血清培养基 | Invitrogen Inc. | 31985-062 | 用于hPSC转染 |
| 热灭活胎牛血清 | 英潍捷基公司 | 16000–044 | MEF 培养基组分 |
| 敲除血清替代物 | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR，hPSC 培养基组分 |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS，不含 Ca2+/毫克2+ |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11140–050 | hPSC 培养基组分，NEAA |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030–081 | hPSC 培养基组分 |
| mTeSR1 &和补充剂 | StemCell Technologies | 5850 | 无动物蛋白 |
| TeSR2 &和补充剂 | StemCell Technologies | 5860 | 无异源成分培养基 |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M7522 | hPSC 培养基组分 |
MEF（CF-1）ATCC | 美国典型培养物保藏中心 (ATCC) | SCRC-1040 | 用于hPSCs的饲养层培养 |
| hESC认证级Matrigel | BD Bioscience | 354277 | 用于hPSCs的无饲养层培养 |
| 层粘连蛋白-521 | BioLamina | LN521-02 | 人源重组蛋白 |
| FGF-2（重组FGF，碱性） | R&D Systems, MN | 223-FB | hPSC 培养基中的生长因子 |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | 创新细胞技术 | AT-104 | 1X 混合酶溶液 |
| JAK抑制剂I | EMD4 Biosciences | 420099 | Janus激酶抑制剂 |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK抑制剂 |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK抑制剂 |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I 抑制剂 |
| 苯并二氧杂环己烷 | Stemgent | 04-0030 | ROCK II 抑制剂 |
| 噻唑维林 | Stemgent | 04-0017 | 一种新型ROCK抑制剂 |
| BD Falcon 细胞筛 | BD Bioscience | 352340 | 40 µm细胞筛 |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | 赛默飞世尔科技 | C6516F-1 | “Mr. Frosty” 冻存容器 |
| Lipofectamine 2000 | 英吉诺公司 | 11668-027 | 转染试剂 |
| DharmaFECT Duo | 赛默飞世尔科技 | T-2010-02 | 转染试剂 |
| 非靶向 miRIDIAN miRNA 转染对照 | 赛默飞世尔科技 | IP-004500-01-05 | 用 Dy547 标记，以监测 microRNA 的递送 |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | 待确定 | 慢病毒载体 |
| pmaxGFP | amaxa公司（Lonza） | 每个转染试剂盒均包含 | 用于转染对照的表达质粒 |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | 小鼠 IgG2b，多能性标志物 |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | 小鼠IgM，分化标志物 |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | 小鼠 IgG3，多能性标志物 |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | 小鼠 IgM，多能性标志物 |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | 小鼠 IgM，多能性标志物 |
| CK8（C51） | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | 小鼠 IgG1，抗细胞角蛋白 8 |
| α甲胎蛋白 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | 甲胎蛋白（AFP），小鼠 IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2，山羊多克隆抗体 |
| 肌钙蛋白T（Av-1） | 赛默飞世尔科技 | MS-295-P0 | 小鼠 IgG1 |
| 结蛋白 | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | 兔IgG |
| 抗 NANOG | ReproCELL Inc, 日本 | RCAB0004P-F | 多克隆抗体 |
| 大鼠抗GFAP | Zymed | 13-0300 | 胶质纤维酸性蛋白 |
| 白蛋白（克隆 HSA1/25.1.3） | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | 小鼠 IgG1 |
| 平滑肌肌动蛋白（克隆 1A4） | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | 小鼠 IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | 兔多克隆抗体 |
| TUBB3 | 康维公司 | MMS-435P | Tuj1，小鼠 IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | 细胞信号传导技术 | 3113 | 兔单克隆抗体 |
| 多聚甲醛（溶液） | 电子显微镜科学公司 | 15710 | PFA，固定剂，用 D-PBS 稀释 |
参考文献
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
