使用简化的原位杂交方案研究Xenopus早期器官发生过程

摘要

由于其体积较大且易于操作，Xenopus laevis 胚胎在早期发育研究中仍然具有极高的应用价值。本文提供了一种简化的整体原位杂交（whole mount in situ hybridization）实验方案，可用于该模型系统中特定器官的鉴定。

摘要

器官发生是研究器官在发育过程中如何被确定，并获得其特定形态和功能的学科。 非洲爪蟾laevis 胚胎因其体积较大，在研究器官发生时非常有用，便于在器官发生的最初阶段识别各种器官。目前，用于识别特定器官或原基的主要方法是整体装片法。 原位 使用针对目标器官中表达的基因的标记反义RNA探针进行杂交。此外，操纵基因或信号通路相对容易 非洲爪蟾 和 原位 杂交可用来检测目标器官在存在性或形态学上的变化。整体装片 原位 杂交是一种需要多天完成且涉及多个步骤的实验流程。本文提供了一种简化后的方案，减少了步骤和试剂的使用数量，适用于常规检测。 原位 杂交机器人极大地简化了该过程，我们详细说明了在流程中如何以及何时使用该技术。一旦 原位 杂交完成后，获取结果的最佳图像可能令人困扰。我们提供有关如何优化成像的建议 原位 杂交结果。尽管该方案描述了器官发生过程的评估 Xenopus laevis，相同的基本方案几乎肯定可以被调整适用于 Xenopus tropicalis 及其他模型系统。

引言

特定基因的表达模式是确定该基因在特定器官或细胞类型发育过程中潜在作用的重要信息。简而言之，若基因未在正确的时间和位置表达，则其发挥关键作用的可能性较小。在 非洲爪蟾，与大多数早期胚胎一样，检测基因表达最常用的检测方法是整体原位杂交 原位 使用标记的反义RNA探针进行杂交。利用抗体染色评估基因表达 非洲爪蟾 随着研究人员发现通常针对哺乳动物蛋白产生的抗体也能与之发生交叉反应，这种情况正变得越来越普遍 非洲爪蟾 同源物或自行生成 ^1-3然而，绝大多数关于 非洲爪蟾 器官发生研究仍普遍使用反义RNA探针。当采用抗体时，每种抗体通常需要针对一抗浓度或固定方案进行优化。相比之下，该方案的 原位 不同探针的杂交条件基本保持不变。其基本概念相对简单，且已有完善的标准化实验方案。 ⁴. 我们的方案是原始方案的简化版本 ⁴ 仍能对早期胚胎中的基因表达模式提供优异的检测效果。胚胎经固定后，通过更换溶液和调整温度进行杂交前处理，以确保标记的反义RNA探针与其靶mRNA实现高严谨性结合。未结合的探针经洗涤去除后，将胚胎进行后续处理，使其与针对RNA探针上标记物的抗体结合。洗去多余抗体后，利用酶促显色反应定位RNA探针在胚胎中的结合位置。目前已有多种转基因爪蟾品系，可在特定组织中驱动荧光蛋白的表达，这些品系可从 非洲爪蟾 如伍兹霍尔的国家非洲爪蟾资源中心等保种中心。尽....

方案

1. 胚胎制备

1. 若胚胎培养过程中未常规进行脱胶处理，则在固定前使用2.5%半胱氨酸（pH 8.0）对胚胎进行脱胶 ⁸虽然并非绝对必要，但在固定前使用精细镊子手动去除受精膜是有帮助的。
   1. 使用玻璃巴斯德移液管转移胚胎。由于移液管口径过窄，无法直接吸取胚胎，因此需使用钻石笔在适当位置将玻璃移液管切割至足够宽的口径，以便吸起胚胎。切割后，迅速将移液管尖端通过本生灯火焰，熔化切口边缘以去除锐利部分。
      注意：尽管玻璃器皿经目视已冷却，但仍可能足够热而造成烫伤，需小心操作。
2. 分阶段进行胚胎固定。首先，准备用于胚胎固定的玻璃小瓶，并在所有步骤（包括最终储存）中均使用这些小瓶。选择瓶身透明、瓶盖带有优质聚四氟乙烯（Teflon）密封垫的玻璃小瓶，以便在操作全过程监测胚胎状态。使用永久性记号笔在小瓶上标注相应的实验信息，再用透明胶带覆盖标签，因为即使使用永久性记号笔书写，在使用酒精及其他有机溶剂的过程中标签仍可能脱落。
   1. 使用 Mempfa 固定胚胎。每次配制 50–100 ml 的 8% 多聚甲醛储备液。使用所需量约 75% 的 H₂O 并加热至 50–60 °C，此温度条件是使多聚甲醛溶解所必需的。
      注意：该溶液与以往发表的方案版本中使用的 Memfa 略有不同，其采用多聚甲醛而非甲醛。
   2. 加入2-3滴10N NaOH，或直至pH值约为....

结果

使用组织特异性探针可提供有关特定器官发育状态的出色信息。在以下示例中，胚胎的发育阶段依据 Nieuwkoop 和 Faber 分期表¹¹确定。若使用在分化后表达的基因探针，例如在 28–30 期检测cardiac troponin I（图 1C），则可在分化后的任何阶段评估已分化器官的存在与否或大小。多年前，胚胎学家依靠对早期胚胎组织学的深入知识进行此类分析^12,13，但这种专业知识在目前的胚胎学家群体中已基本失传。尽管这一专业知识的丧失令人遗憾，但原位杂交技术的可靠性和易用性使得任何研究人员均可实现对特定组织的识别。一些相对不明显的组织，例如胚胎 25 期的孵化腺（图 1A），可通过原位杂交清晰标记，而无需依赖特异性抗体或组织学技术（图 1C）。此外，整体胚胎原位杂交技术使得研究人员能够在完整胚胎的背景下观察整个器官，而不必依赖组织切片的推断（图 2）。即使是位于胚胎深层的组织，如视神经.......

讨论

使用的能力 原位 通过杂交技术来可视化特定基因的表达模式，仍是鉴定特定器官或细胞类型最常用的方法 非洲爪蟾 胚胎。这是因为该技术具有多项优势。在出现任何组织学分化迹象之前，基因表达即可识别特定结构，例如 nkx2.5 在心脏前体细胞出现任何明确界定之前的心肌前体细胞中的表达 ¹⁸一旦所有试剂齐备，该方法还具有很高的成本效益。除了获取编码目标基因的质粒外，几乎无需额外的时间和成本投入，即可制备大量可有效重复使用的个体探针。根据我们的经验，尽管每次使用不可避免地会带来少量稀释，探针仍可重复使用多年而活性损失极小。最后，在使用不同探针时，几乎无需进行额外优化。

探针合成的质量是实验方案成功的关键因素。检测RNA探针质量的方法有多种，但在TAE凝胶上直接电泳是一种快速、简便且相当可靠的方法。我们通常使用溴化乙锭对RNA进行染色，但大多数机构要求对此类染料的凝胶进行特殊处理和处置。市面上有无毒的替代染料，但我们尚未系统比较这些替代品在探针可视化方面的效果。RNA探针应呈现为单一条带，尽管在TAE凝胶上其条带相较于DN.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Labguake 试管振荡器	VWR	17-08-2011
VWR 小瓶	VWR	10-07-2012
L-半胱氨酸	BioShop	CYS342.500
核糖核苷三磷酸试剂盒，100 mM	罗氏	11277057001
地高辛-11-UTP	罗氏	11209256910
RNase抑制剂（RNase OUT）	Invitrogen	10777-019
T7 RNA 聚合酶	Fermentas	EPO111
T3 RNA聚合酶	Fermentas	EPO101
SP6 RNA聚合酶	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
羊血清	Wisent	31150
封闭剂	罗氏	11096176001
BM 紫色 AP 底物	罗氏	11442094001
抗地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段	罗氏	11093274910
甲醇	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	电子显微镜	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	电子显微镜	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
多聚甲醛	BioShop	PAR070.500
甲酰胺	VWR	CAFX0420-4
RNA	罗氏	10109223001
马来酸	VWR	CAMX0100-3
三水合柠檬酸钠	BioShop	CIT001
过氧化氢（30% 溶液）	电子显微镜	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
苯甲醇	Sigma	B-1042
苯甲酸苄酯	Sigma	B-6630
UltraPure 琼脂糖	Invitrogen	16500-500