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方法文章

一种用于整体封片胚珠中染色质修饰与细胞核结构的高效定量单细胞分析方法 拟南芥

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DOI：

10.3791/51530

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2014年6月19日

 ,  , 
1Institute of Plant Biology and Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich, 2Institut de Recherche pour le Développement (UMR 232), Centre National de la Recherche Scientifique (ERL 5300), Université de Montpellier II

本文内容

摘要

我们在此提供一种高效且可靠的免疫染色和荧光检测方案 在 原位 杂交，DNA染色后对整体样本进行定量高分辨率成像 拟南芥 胚珠。该方法已成功用于分析染色质修饰和核结构。

摘要

在开花植物中，体细胞向生殖细胞命运的转变以成年植物花器官中孢子母细胞（SMC）的特化为标志。雌性 SMC（大孢子母细胞，MMC）在胚珠原基中分化并经历减数分裂。选定的单倍体大孢子随后通过有丝分裂形成多细胞的雌配子体，该雌配子体将产生配子，即卵细胞和中央细胞，同时形成附属细胞。由于 MMC、减数分裂细胞以及雌配子体位于胚珠内部，其可及性有限，因此在单细胞水平上进行细胞学和细胞遗传学分析存在技术上的挑战。特别是，免疫检测细胞或细胞核表位（无论是直接还是间接）受到试剂难以穿透植物细胞的限制，而整体封片组织缺乏光学通透性也严重影响了单细胞成像效果。

因此，我们开发了一种高效的方法，用于在整体包埋的单细胞中以高分辨率分析核内结构和染色质修饰 拟南芥 胚珠。该方法基于将固定后的胚珠在载玻片上的薄层丙烯酰胺凝胶中进行解剖和包埋。包埋后的胚珠接受化学和酶处理，旨在提高组织通透性和透明度，以利于免疫染色试剂的渗透。这些处理可有效保持细胞和染色质结构、DNA及蛋白质表位的完整性。样品可用于多种后续细胞学分析，包括染色质免疫荧光染色、荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）和DNA染色用于异染色质分析。采用高分辨率的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像，结合三维重建，可实现单细胞水平的定量测量。

引言

在开花植物中，生殖细胞系的建立始于孢子母细胞（SMC）的分化，包括雌性的大孢子母细胞（MMC）和雄性的小孢子母细胞。大孢子母细胞由胚珠原基远端珠心表皮下的一细胞发育而来，而小孢子母细胞则由位于花药室内部深处花器官中的孢原组织发育形成。1孢子母细胞（SMCs）经过减数分裂产生单倍体孢子，这些孢子随后通过有丝分裂发育为配子体。雌配子体，即胚囊，包含一个卵细胞、一个中央细胞、两个助细胞和三个反足细胞。雄配子体，即花粉，由一个营养细胞和两个精细胞组成。尽管雄配子体相对易于研究，雌配子体则深埋于胚珠内部，而胚珠本身又被包裹在花的心皮中，因此对雌配子体进行分子和细胞学分析面临特殊挑战。然而，近年来激光捕获显微切割技术提供了一种精巧的解决方案，使得对大孢子母细胞（MMC）及雌配子体细胞的转录组分析成为可能。2-4除了候选基因表达分析外，使用 例如 RNA 原位 杂交或报告基因检测，细胞学分析能够利用特异性的直接细胞染色或间接免疫染色来研究内源性细胞组分的动态变化。特别是，使用荧光原位杂交（FISH）和DNA染色的细胞遗传学染色，结合染色质修饰或染色质组分的免疫染色，是阐明染色质动态变化和细胞核结构的核心方法 拟南芥5通常，减数分裂涉及特定的染色体动态，这一过程在植物雄性减数分裂细胞中已得到深入研究。6,7；在花粉发育过程中，还描述了进一步的大规模、细胞特异性的染色质重排，可能反映了动态的表观遗传重编程8-10相比之下，由于雌性小孢子母细胞和雌配子体较难获取，这些研究在技术上仍然难以开展，通常需要进行切片、人工解剖或酶解处理（见下文）。此外，整体封片样品普遍缺乏光学通透性，这阻碍了对完整胚珠中生殖细胞进行高分辨率成像。

一种用于整体花器官中染色体结构细胞学分析的经典方法是采用Feulgen染色法11-13。该方法涉及使用次氯酸对DNA进行酸水解，导致蛋白质变性，从而破坏染色质结构。另一种方法是利用DAPI染色和免疫染色技术，在半薄切片或分离的胚囊及大孢子母细胞（MMC）上观察雌性减数分裂细胞和配子体细胞中的染色体组织（例如见14-18）。然而显然，人工解剖和切片操作费时费力，限制了对大量染色质表位进行定性和定量分析的可行性。

在此，我们提供一种高效方案，用于制备大量 拟南芥 适合多种下游整体细胞学染色的胚珠。简言之，将花蕾置于固定液中孵育，从心皮中解剖出成行的胚珠，并将其在载玻片上包埋于丙烯酰胺中，操作方法与花粉母细胞相同。19,20将包埋的胚珠进一步用甲醇、乙醇和二甲苯清除并固定，随后进行细胞壁消化和通透处理。本文讨论了这些步骤可能存在的变异。处理后的样品可用于DNA染色、免疫染色和荧光原位杂交（FISH）。该制备方法效率高，可实现平行实验设置（每天最多可制备16张载玻片，用于不同的下游分析）。所述处理方法可在整体装片中获得均一的信号，同时良好保存生殖细胞及其周围珠心细胞的组织学、细胞及细胞核结构，有利于不同细胞类型之间的定性和定量比较。通过校准的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行高分辨率成像，并结合三维重建，可实现对荧光信号的有意义的定量测量。我们已成功应用此方法分析减数分裂前大孢子母细胞（MMC）中染色质的动态变化。21 雌性配子体的发育22；本文展示了在整体胚珠中进行异染色质分析、染色质免疫染色、GFP免疫染色以及FISH的代表性结果。我们进一步认为，本实验方案适用于其他植物组织和物种。

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方案

该操作流程如图1所示的工作流程中所述，组织解剖与包埋的装置设置如图2所示。

1. 组织固定

  1. 在冰上，将20-30个心皮收集到含有新鲜配制的BVO固定液的微量离心管中。
  2. 在室温下轻轻振荡固定组织30分钟。
  3. 将含有心皮和固定液的离心管在台式微量离心机中以400 × g离心1分钟。
  4. 小心移除固定液，加入1 ml PBT，将离心管置于冰上。

2. 解剖与包埋

  1. 准备五个 Eppendorf 管，每管加入 200 μl 新鲜配制的 5% 丙烯酰胺混合液。
  2. 准备五张 Superfrost 载玻片，用 70% 乙醇预清洁，并用铅笔标记。
  3. 将一份 20% 过硫酸铵（APS）和一份 20% 四甲基乙二胺（NaPS）分别在冰上解冻。
  4. 用剪切尖端的移液器吸头取 4–5 个子房，置于洁净载玻片上，吸去多余液体。
  5. 用细针进行纵向切割，分离子房壁以释放成排的胚珠，如图 2所示；通过覆盖 PBS（不超过 10 μl）避免样品干燥。
  6. 迅速向 200 μl 丙烯酰胺混合液中加入 12 μl NaPS 和 12 μl APS，并混匀。
  7. 将 30 μl 活化后的丙烯酰胺溶液加至解剖好的胚珠上。
  8. 盖上 20 × 20 mm 盖玻片，在室温下静置聚合 45–60 分钟。
  9. 用刀片小心移除盖玻片。此阶段样品可置于含 PBS 的 Coplin 染色缸中，在 4 °C 下保存过夜。

3. 组织处理

注意：除步骤 3.2.1、3.2.3、3.3.2 和 3.4.3 外，所有步骤均在室温下的化学通风橱中，使用含 80 ml 溶液的 Coplin 染色缸进行。载玻片使用平头镊子转移。

  1. 组织透明化与固定：
    1. 在甲醇中孵育 5 分钟。
    2. 在乙醇中孵育 5 分钟。
    3. 在乙醇:二甲苯（1:1）中孵育 30 分钟。
    4. 在乙醇中孵育 5 分钟。
    5. 在甲醇中孵育 5 分钟。
    6. 在甲醇与 PBT（1:1）中孵育 15 分钟，加入 2.5% 甲醛。
    7. 用 PBT 洗涤 2 次，每次 10 分钟。此步骤后，载玻片可在 4 °C 下保存过夜。
  2. 细胞壁消化：
    1. 将一份细胞壁消化混合液置于冰上解冻。
    2. 从 Coplin 染色缸中取出一张载玻片，将其垂直置于纸巾上以去除多余液体。
    3. 在丙烯酰胺垫上加入 100 μl 细胞壁消化混合液，并覆盖 23 × 46 mm 的盖玻片。对其他载玻片重复此操作。在湿润 chamber（见材料部分）中 37 °C 孵育 2 小时。
    4. 用 PBT 洗涤载玻片 2 次，每次 5 分钟。
  3. RNase A 处理：
    1. 从 Coplin 染色缸中取出一张载玻片，按前述方法去除多余液体。
    2. 每张载玻片加入 100 μl 含 1% Tween-20 的 PBS 溶液，其中 RNase A 浓度为 100 μg/ml，在湿润 chamber 中 37 °C 孵育 1 小时。
    3. 用 PBT 洗涤载玻片 2 次，每次 5 分钟。
  4. 后固定与通透处理：
    1. 在新配制的 PBT-F 中后固定 20 分钟。
    2. 用 PBT 洗涤 10 分钟。
    3. 在含 2% Tween-20 的 PBS 中于 4 °C 通透 2 小时。
    4. 用 PBT 洗涤 2 次，每次 5 分钟。

4. 免疫染色

注意：此步骤中，必须通过使用不同稀释度（1:200、1:500、1:1000）的抗体来测试一抗的最佳浓度。

  1. 将每张玻片与100 μl用含0.2% Tween-20的PBS稀释的一抗在4 °C孵育12-24小时。
  2. 在室温下轻轻振荡，用PBT洗涤玻片2-4小时。
  3. 加入1:200稀释于PBS + 0.2% Tween-20中的二抗，在4 °C孵育24小时。
  4. 在室温下轻轻振荡，用PBT洗涤玻片1小时。
  5. 用含10 μg/ml碘化丙啶的PBS对玻片进行复染15分钟，然后在室温下轻轻振荡，用PBS漂洗15分钟。
  6. 用含有10 μg/ml碘化丙啶的抗荧光淬灭封片液封片。封片剂硬化1小时后，再进行CLSM成像。

5. 定量成像

  1. 图像采集：
    1. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获取高分辨率图像，理想情况下采用共振扫描模式，该模式可在长时间成像过程中更好地保留荧光信号23，并使用63倍甘油浸没物镜。
    2. 在实验开始时测试激光强度、增益、针孔、体素大小和缩放因子等采集参数，以确定标准的采集流程，并在所有样本中严格遵循，确保定量测量的一致性。
    3. 验证不同荧光染料之间是否存在串扰。若存在串扰，应设置为顺序扫描。透射光图像应单独采集，而非同时采集。
    4. 在x和y维度上以尽可能高的分辨率进行连续的三维图像采集，并在z维度上进行2倍过采样（遵循奈奎斯特准则）。
  2. 图像处理：
    1. 使用商业或开源软件对连续图像进行三维重建。
    2. 在三维空间中为每个感兴趣的细胞核（或细胞）定义轮廓表面。
    3. 将每个通道的荧光信号量化为每个对象内像素强度的总和。
    4. 将数据导出至Excel进行统计分析。将抗体信号相对于e.g. DNA染色信号进行归一化处理。

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结果

我们提供了一种可靠的方案，用于大规模制备和处理适用于整体细胞学染色的拟南芥胚珠。由于采用了包埋处理，胚珠能够保持三维结构（图3）。此外，组织处理过程包括光学透明化，可实现亚细胞结构的高分辨率成像。图4展示了整体胚珠原基中的DNA染色，其中异染色质呈现为明亮、清晰且显著的焦点（该图像未使用去卷积处理）。这些图像被用于分析大孢子母细胞（MMC）和珠心组织中的异染色质含量（图4）21。

此外，我们成功应用该方案通过免疫染色对大孢子母细胞、功能大孢子、发育中的雌配子体以及早期胚胎中的染色质动态进行了定量分析21, 22-24. 在 图5，我们展示了整体免疫染色的代表性结果 拟南芥 胚珠 图5A 展示了胚珠原基（包括大孢子母细胞）中与常染色质相关的活性标记（H3K4me3）和与异染色质相关的抑制性标记（H3K27me1）的免疫检测示例。

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讨论

在开花植物中，雌性生殖细胞系被包括珠心和胚珠珠被在内的多层细胞包裹，这使得整体样本的细胞学染色在技术上具有挑战性。本文介绍一种高效实验方案，可用于制备和处理大量适合细胞学染色（如免疫染色、DNA 染色和荧光染色）的胚珠 原位 整体原位杂交。我们已成功将其用于雌性生殖系生殖细胞的分析 拟南芥21,22该方法效率高，可同时对多个载玻片进行不同染色处理。方法稳定性好，信号分布均匀，支持可重复的定量分析。与传统的Feulgen染色等需破坏染色质结构的方法不同，本方案可保持染色质的组织结构及核内表位的完整性。此外，组织透明化处理使得能够在单细胞水平上以高分辨率成像检测信号。

如果花朵已使用4%多聚甲醛（溶于PBS + 1% Tween）而非BVO缓冲液（1.1）进行固定，则可省略步骤3.1中所述操作，从而加快本实验流程。尽管该简化流程在多个免疫染色实验中已被证实可行22-24，但我们发现其在不同样本、抗体以及细胞壁消化酶混合物批次间的染色稳定性有所下降（见下文）。此外，我们尝试使用该简化流程进行FISH杂交时未获...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢苏黎世大学的 Ueli Grossniklaus 提供的技术和资金支持。感谢 Valeria Gagliardini、Christof Eichenberger、Arturo Bolanos 和 Peter Kopf 提供的实验室日常支持。本研究由苏黎世大学资助，并获得瑞士国家科学基金会向 CB（项目编号：31003A_130722）和 Ueli Grossniklaus（项目编号：31003A_141245 和 31003AB-126006）提供的资助，以及法国国家研究署向 DG 提供的资助（ANR-BLANC-2012 计划）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
溶液
BVO固定缓冲液（基于32）2 mM EGTA，pH 7.5，1% (v/v) 甲醛，10% DMSO，1× PBS，0.1% Tween-20
PBT1× PBS，0.1% Tween-20
PBT-F1× PBT，2.5% (v/v) 甲醛
30% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺3 g 丙烯酰胺，0.33 g 双丙烯酰胺，1× PBS（配制10 ml，4 °C 保存）
200 ml 5% 丙烯酰胺-PBS混合液34 ml 30% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺，166 ml 1× PBS（现用现配，从30%储备液稀释）
20% 过硫酸铵0.2 g 过硫酸铵，1 ml 无菌水（分装成1 ml 每份，-20 °C 保存）
20% 亚硫酸钠0.2 g 亚硫酸钠，1 ml 无菌水（分装成1 ml 每份，-20 °C 保存）
细胞壁酶混合液0.5% (w/v) 纤维素酶，1% (w/v) 果胶酶裂解酶，0.5% (w/v) 果胶酶
试剂与材料
甲醛Sigma-AldrichF1635
DMSOSigmaD5879
TrisAmaresco0497
乙醇SchaurlauET00102500
甲醇SchaurlauME03062500
二甲苯ROTH4436.1
纤维素酶Sigma1794
果胶酶裂解酶SigmaD8037
果胶酶SigmaP5936
Tween-20Merck8.22184.0500
EGTASigmaE-4378
丙烯酰胺SigmaA-3553
双丙烯酰胺SigmaM2022有毒
过硫酸铵SigmaA9164
亚硫酸钠Fluka71988
抗三甲基化组蛋白H3（Lys4）抗体Upstate07-473
抗单甲基化组蛋白H3（Lys27）抗体Upstate07-448
Alexa Fluor 488~山羊~抗~兔（H+L）Molecular ProbeA11008
ProlongGoldInvitrogenP36934
碘化丙啶SigmaP4170有毒
DAPISigmaD9542有毒
RNase ARoche10109169001
柯普林瓶Huber & CO10.055
镊子DUMONT BIOLOGY
摇床Heidolph543-12310-00-0
湿盒一个内放湿润纸巾的塑料盒，盒内放置塑料支架用于支撑载玻片，防止载玻片接触水分。
Superfrost Plus 载玻片Thermo FisherJ1800AMNZMenzel-Gläser
FISH Tag DNA 试剂盒InvitrogenF32947
GFP增强剂Chromotek

参考文献

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