定量，单细胞在全安装胚珠在染色质修饰和核体系结构分析的有效方法拟南芥

Summary

我们在这里提供了一个高效，可靠的协议进行免疫染色，荧光原位杂交，DNA染色后在整个安装拟南芥胚珠定量，高分辨率成像。该方法已成功地用于分析染色质修饰和核架构。

Abstract

在开花植物的体细胞到生殖细胞命运转变是在成人的植物花器官标志着孢子母细胞的规范（校董会）。女性SMC（大孢子母细胞，MMC）区分在胚珠原基和经历减数分裂。所选择的单倍体孢子然后经历有丝分裂，以形成多细胞雌配子体，这将产生配子，卵细胞和中央细胞，连同附件细胞。在MMC，meiocyte和雌配子体的胚珠内的有限的辅助功能是进行细胞学技术挑战性和细胞遗传学分析在单细胞水平上。具体地讲，蜂窝式或核抗原表位直接或间接的免疫检测是由植物细胞和单细胞成像内的试剂的渗透差的障是由缺乏在整个安装组织的光学透明性的批租。

因此，我们开发了分析原子核的有效方法耳组织和染色质修饰在整个安装嵌入式拟南芥胚珠高分辨率单细胞。它是基于解剖和固定胚珠嵌入在丙烯酰胺凝胶上的显微镜载玻片的薄层。嵌入式胚珠受到旨在提高组织的清晰度和通透的免疫染色试剂化学和酶处理。这些治疗维持细胞和染色质组织，DNA和蛋白质的表位。样本可以用于不同的下游细胞学分析，包括染色质免疫染色，荧光原位杂交（FISH），和DNA染色为异分析。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像，分辨率高，其次是三维重建允许在单细胞分辨率的定量测量。

Introduction

在开花植物，建立生殖谱系始于平滑肌细胞的分化，MMC女性和男性孢子母细胞。在MMC来自于胚珠原基的远端子珠心表皮细胞发育和小孢子母细胞从造孢组织发展中的花药药室，分别位于花器官¹深处。校董会经过减数分裂，产生单倍体的孢子，然后产生在有丝分裂的配子体。雌配子体，或胚囊，由一个卵细胞，一个中央单元，两个助和三个antipodals的。雄配子体，或花粉，由一个营养细胞和两个精子细胞。而雄配子体仍然是一个相对平易近人对象 - 的研究中，雌配子体嵌入在胚珠内，自己包围在花心皮，从而造成分子和细胞学分析具体的挑战。然而，最近，激光辅助显微切割提供了一个优雅的解决方案，允许在MMC和雌性配子体细胞^2-4转录组分析。除了 ​​候选基因表达分析， 例如使用RNA 原位杂交或报告基因检测，细胞学分析允许调查使用特定的直接细胞染色或间接免疫源性细胞成分的动态。特别是在使用FISH和DNA染色，与染色质修饰或染色质免疫成分一起细胞遗传学染色是核心的方法来阐明染色质动力学和核组织在拟南芥 ^5。通常情况下，减数分裂嗣继承已被很好地研究植物雄性meiocytes ^6,7特定的染色体动态;进一步规模化，细胞特异性染色质重组，可能反映动态的表观遗传修饰已经花粉发育过程中^8-10被描述。相比之下，由于到阴meiocyte和配子体的相对不便，这些调查保持在技术上难以适用，并且经常需要切片或手工剥离和酶消化（....

Protocol

该过程在图1中的工作流描述，并设置为夹层和组织的嵌入在图2中给出。

1，组织固定

1. 收集20-30心皮中含有冰新鲜的BVO固定缓冲液离心管。
2. 修复组织30分钟轻微振荡在室温下。
3. 旋转含有固定剂的心皮中台式微量离心机1分钟，在400×g下的管中。
4. 小心地取出固定缓冲液和加入1 ml的PBT，把试管放在冰。

2，解剖与嵌入

1. 准备5 Eppendorf管各200微升新鲜的，5％的丙烯酰胺组合。
2. 制备5的Superfrost载玻片预清洗，用70％乙醇及标记用铅笔。
3. 解冻20％的APS之一等份，每20％的国家行动方案，在冰上。
4. 取4-5心皮与切断端尖，地点他们在一个干净的玻片，去除多余的液体。
5. 使纵向切口用微细针取下心皮壁以释放列胚珠所示图2中 ，避免覆盖，用PBS（不超过10微升）的干燥。
6. 快速添加和混合12微升国家行动方案，12微升的APS与200微升丙烯酰胺混合等分。
7. 加入30微升的激活丙烯酰胺到解剖胚珠。
8. 盖在一个20×20毫米的盖玻片，让聚合在室温下，45-60分钟。
9. 用刀片去....

Results

我们提供了一个强大的协议大规模制备适合于在全安装细胞学染色拟南芥胚珠和处理。由于嵌入，胚珠保留的3维结构（ 图3）。此外，该组织处理，包括光学澄清，使成像的亚细胞结构的高分辨率。 图4显示了DNA染色在异染色质出现明亮，明确显眼灶（无反褶积用于此图片）整个安装胚珠原基。这些图像被用于分析在MMC和珠心（ 图^4）21异的内容。

此外，我们成功地利用这个协议来定量分析染色质动力学通过免疫组化的大孢子母细胞，功能大孢子，发展女性配子和早期胚胎^{21，22-24。}在图5中拟南芥胚珠代表性的结果。 图5A显示免疫检测在胚珠原基，包括大孢子母细胞一个常染色质相关的许可标志，（H3K4me3的）和异染色质相关的镇压标记的一个例子（H3K27me1）。 图5B示出了在成熟的胚珠，包括胚囊（在这种情况下，该协议被略加修改，使用GFP的助推器.......

Discussion

在开花植物中，女性生殖谱系是由几个细胞层，包括珠心和胚珠teguments包围，从而使细胞学染色整个安装技术上的挑战。在这里，我们提出了一个高效的协议使得大量适合细胞学染色，如免疫，DNA染色和荧光在整个贴装原位杂交胚珠的准备和处理。我们成功地使用它在拟南芥 ^21,22女性生殖生殖系的分析。该方法是高效的多张幻灯片可以并行进行不同的染色处理。它也是鲁棒并给出均匀的信号分布，并允许可再现的定量分析。与此相反，以经典的方法，如福尔根染色，涉及染色质结构的变性，我们的协议保留染色质组织和核抗原表位。加载中银行足球比赛，组织澄清，使高分辨率成像的信号在单细胞水平。

这个协议可以通过省略在3.1中描述的步骤加快，如果花儿也被固定在4％多聚甲醛代替BVO缓冲液（1.1）（在PBS +1％吐温）。而这更短的程序证明功能性的一些免疫染色^22-24，我们发现它衰减了染色的样本之间，抗体和批次的细胞壁消化酶混合物的鲁棒性（见下文）。此外，我们没有成功的这短短的过程FISH杂交。对于GFP的使用升压分子。 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
解决方案
BVO 固定缓冲液（基于32）			2 mM EGTA，pH 7.5,1% （v/v） 甲醛，10% DMSO，1x PBS，0.1% 吐温-20
PBT			1x PBS，0.1% 吐温-20
PBT-F			1x PBT，2.5% （v/v） 甲醛
30% 丙烯酰胺：双丙烯酰胺			3 g 丙烯酰胺，0.33 g 双丙烯酰胺，1x PBS（制备 10 ml，以 4 °C 储存;C）
200 ml 5% 丙烯酰胺在 PBS			34 ml 30% 丙烯酰胺：双丙烯酰胺，166 ml 1x PBS（从 30% 原液新鲜制成）
20% 过硫酸			0.2 g 过硫酸铵，1 ml 无菌水（用 1 ml 制备等分试样并储存在 -20 °C;C）
20% 亚硫酸钠			0.2 g 亚硫酸钠，1 ml 无菌水（用 1 ml 制备等分试样，并在 -20 °C 下储存;C）
细胞壁酶混合物			0.5% （w/v） 纤维素酶、1% （w/v） 浆化酶、0.5% （w/v） 果胶裂解酶
试剂和材料
甲醛	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
乙醇	Schaurlau	ET00102500
甲醇	Schaurlau	ME03062500
二甲苯	ROTH	4436.1
纤维素酶	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
果胶溶解酶	Sigma	P5936
吐温-20	默克	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
丙烯酰胺	Sigma	A-3553
双丙烯酰胺	Sigma	M2022	有毒
过硫酸铵	Sigma	A9164
亚硫酸钠	Fluka	71988
抗三甲基组蛋白 H3 （Lys4）	上州	07-473
抗单甲基组蛋白 H3 （Lys27）	上州	07-448
Alexa Fluor 488~山羊 ~抗 ~兔 （H+L）	分子探针	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
碘化丙啶	Sigma	P4170	毒性
DAPI	Sigma	D9542	毒性
RNAse A	罗氏	10109169001
Coplin 罐	Huber &CO	10.055
镊子	DUMONT BIOLOGY
摇床	Heidolph	543-12310-00-0
潮湿室			一个塑料盒，里面有湿纸巾，一个塑料支架被放入盒子中，用于支撑载玻片并防止载玻片接触水。
Superfrost Plus 滑轨	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH 标签 DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP 助推器	Chromotek