斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的半自动化成像

摘要

本文介绍了一种对斑马鱼胚胎中组织特异性荧光进行半自动化成像的实验方案。

摘要

斑马鱼胚胎是进行小分子大规模筛选的有力工具。表达荧光报告蛋白的转基因斑马鱼常用于鉴定能够调节基因表达的化学物质。针对活体斑马鱼荧光表型的化学筛选通常依赖昂贵且专用的高内涵筛选设备。本文介绍一种利用配备电动载物台的标准落射荧光显微镜，自动成像斑马鱼胚胎并检测组织特异性荧光的方法。我们利用一种通过表达绿色荧光蛋白（GFP）来报告雌激素受体活性的转基因斑马鱼，建立了一种半自动化的筛选流程，用于寻找能够以组织特异性方式激活报告系统的雌激素受体配体。本视频中，我们描述了将受精后24-48小时（hpf）的斑马鱼胚胎排列于96孔板中，并加入可结合雌激素受体的小分子化合物的操作步骤。在受精后72-96 hpf时，自动采集整块96孔板各孔的图像，并人工检查是否存在组织特异性的荧光信号。该方案展示了检测能够在心脏瓣膜中激活受体但不在肝脏中激活的雌激素类物质的能力。

引言

已开发出转基因斑马鱼，可在活体胚胎中直接可视化多种信号通路的活性，例如成纤维细胞生长因子¹、视黄酸²和雌激素³信号通路。此类工具可用于筛选干扰信号通路的化学物质（通过荧光强度变化进行检测）或以组织特异性方式调节信号通路的化学物质（通过荧光定位变化进行检测）⁴。自动化图像采集可显著提高化学筛选的通量^5,6。目前许多针对活体斑马鱼的自动化荧光检测依赖昂贵且专用的设备。所谓高内涵筛选虽能实现高分辨率、定量成像，但需配备共聚焦显微镜的专用微孔板读板仪，成本较高^7,8。本方法旨在利用常规的落射荧光显微镜，在96孔板中自动检测斑马鱼胚胎的组织特异性荧光。该技术可有效区分组织特异性荧光，对于缺乏专用微孔板读板仪或高内涵筛选设备的实验室而言，可能是一种切实可行的替代方案。

在本实验方案中，我们采用自动化成像技术，在受精后3天（dpf）的活体斑马鱼中检测组织特异性的雌激素受体（ER）激动剂。转基因品系 Tg(5xERE:GFP)^c262/c262 在绿色荧光蛋白（GFP）³ 的上游含有5个串联的雌激素反应元件DNA序列（ERE）。在无配体的情况下，雌激素受体通常处于非活性状态。配体结合可诱导受体发生构象变化，使其能够结合ERE DNA并调控转录⁹。5xERE:GFP斑马鱼可用于筛选化学文库中的ER调节剂，也可用于检测环境水样中的雌激素类污染物。

方案

注意：本方案已获得阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物护理和使用委员会批准。

1. 斑马鱼繁殖与卵收集

1. 在开始化学暴露前3天，组装带有隔板的繁殖缸，用于分隔雄鱼和雌鱼。每个缸中加入半缸循环养殖系统水。使用网具将Tg(5xERE:GFP)^c262/c262 鱼转移至繁殖缸中，每缸放入2条雄鱼和3条雌鱼，并用隔板分隔。为每个缸盖上盖子，并标注日期及待交配品系。
2. 次日早晨，移除所有隔板和挡板，使繁殖缸一端形成浅水区。让斑马鱼自然交配，并以10分钟 为间隔收集胚胎，以确保精确的发育阶段判定。用E3B培养基通过茶筛冲洗，清洗卵子，并轻柔地将胚胎冲洗至培养皿中。将成鱼放回永久性养殖缸中。
3. 在体视显微镜下对胚胎进行分选、计数，并剔除未受精、形态异常或受损的胚胎。将正常胚胎置于含E3B培养基的培养皿中，在28.5 °C条件下培养，光照周期为14小时光照:10小时黑暗。胚胎密度可能影响发育，每只100 × 35 mm培养皿中不超过100个胚胎，每只60 × 15 mm培养皿中不超过50个胚胎。
4. 在受精后24小时（hpf），将培养基更换为含有200 μM 1-苯基-2-硫脲（PTU）的E3B培养基。PTU可抑制色素形成，使斑马鱼胚胎和幼鱼保持透明，从而提高成像清晰度。注意：高浓度PTU母液具有危害性；配制E3B+PTU溶液时需佩戴手套。
5. 在受精后1天（dpf），使用精细镊子人工去除每个胚胎的卵膜。尽管卵膜似乎不影响雌激素的渗透，但去除后可提高成像清晰度。无需从培养基中清除脱落的卵膜。备注：除人工去膜外，也可采用化学法去膜，即使用1 mg/ml 蛋白酶处理，方法如先前文献所述¹¹。

2. 胚胎的化学处理

1. 处理前一天，将每种化学物质的储备液以DMSO（或适当的溶剂）配制成1,000倍浓度的溶液。例如，若需使胚胎暴露于10 μM双酚A（BPA），则应将BPA储备液配制成10 mM的100% DMSO溶液。这可确保各处理组中DMSO浓度一致，并使1:1,000稀释的DMSO达到无毒水平，作为溶剂对照。将储备液储存于-20 °C。本实验方案中，胚胎将暴露于1 μM和10 μM BPA、18.5 nM和1.85 μM染料木黄酮、367 nM雌二醇（阳性对照）以及溶剂对照（0.1% DMSO，阴性对照）。
   警告：双酚A（BPA）和雌二醇等化学品具有危害性，可能对人类胎儿产生不良影响。操作内分泌干扰物时应谨慎，并始终佩戴适当的个人防护装备。
2. 处理当天，将预先配制的化学储备液解冻。通过移液将1 ml E3B + PTU加入1.5 ml 微量离心管中，再加入1 μl 储备液，实现1:1,000稀释。充分涡旋混匀。将DMSO以1:1,000比例稀释至E3B + PTU中作为溶剂对照。另取1 mL E3B + PTU置于1.5 ml 微量离心管中作为空白对照。
3. 使用大孔径塑料移液管，将胚胎从培养皿转移至96孔板中，每孔3个胚胎，每种条件设3孔。为防止长时间处理过程中液体蒸发，避免在板的外周行和列（A行和E行，1列和12列）放置胚胎。外周孔可加入300 μl E3B + PTU。适当标记板盖。
4. 使用细尖塑料移液管从各孔中移除培养基。操作应迅速，以避免胚胎干燥。
5. 向对应孔中加入200 μl 处理溶液。将板盖倒置于板下作为参照，确保处理液准确加入相应孔中。加样前对每根离心管进行涡旋，使化学物质充分混匀。肉眼确认每个胚胎均处于处理液中。若胚胎附着于孔壁，可用洁净的移液管蘸取处理液将其冲洗入孔底。
6. 将96孔板置于28.5 °C培养箱中孵育。胚胎将在72 hpf时进行荧光分析。

3. 96孔板中胚胎的自动化成像

1. 通过向每个孔中加入 10 μl 的 4 mg/ml 三卡因溶液来麻醉胚胎。
   注意：成像前需对胚胎进行麻醉。在 24–96 hpf 期间，斑马鱼会表现出自发运动，并在图像采集过程中因光源变化而产生惊吓反应。麻醉胚胎可减少成像期间的运动。
2. 将 96 孔板放置于电动载物台上并校准载物台。使用 Zeiss Zen Blue 2011 软件进行显微镜自动化与控制，选择 sample carrier 选项，并选择 multiwell 96。点击 calibrate，然后按照逐步提示完成载物台校准。
   注意：此步骤后切勿取消选中“tiles”按钮。若取消选中该按钮，可能导致校准设置丢失，需重新校准 96 孔板。
3. 使用 10 倍物镜和明场（BF）模式，识别一个阳性对照胚胎，并为 BF 和 GFP 通道适当设置曝光参数，确保荧光信号未使相机饱和。对单个胚胎进行调焦，并设置显微镜采集共 3 层 Z 轴切片图像，即在当前焦平面之上 50 μm 和之下 50 μm 各采集一幅图像。
   注意：由于不同组织位于不同的焦平面，此设置可确保每条斑马鱼的心脏和肝脏均能在图像中清晰对焦。
4. 设置软件参数以使用 GFP 和 BF 通道采集拼接图像。在 acquisition 选项卡下，选择 advanced setup，然后选择 tile regions，再选择 tiles，并选择 circle well 选项。
   注意：图像拼接用于生成每个孔的合成图像。单个视野仅能覆盖每个孔的一小部分区域，而拼接功能可自动从每个孔中采集多个相邻视野，从而生成整个孔的合成图像。因此，可自动采集每块板上 96 个合成图像，每个合成图像包含来自单个孔的数十幅独立图像。
5. 选择 carrier 和 fill factor 90%。选择 90% 的填充因子将对选定孔采集多幅图像，使得每个孔 90% 的区域在合成图像中可见。
   注意：选择填充因子时，屏幕上将显示一个示意图，表示将要成像的区域。应根据实验需求选择合适的百分比，以覆盖孔中适当的成像区域。
6. 在 options 下选择所需的重叠比例。
   注意：在将多个图像拼接为单个代表性图像时，5–10% 的重叠可实现图像间平滑过渡。然而，若无需图像拼接，则使用 0% 重叠可缩短成像时间。当使用 90% 填充因子和 5% 重叠时，单个孔的合成图像由 59 幅独立图像组成。
7. 开始成像。显微镜将自动采集图像。
8. 手动检查每个孔的合成图像中的组织特异性荧光（图 1）。
9. 注意：建议首先检查阳性对照，以确认化学处理有效，然后再观察实验处理组孔。

4. 在96孔板中对胚胎进行手动图像采集

注意： 为确认结果，使用 20 倍长工作距离物镜手动获取更详细的图像（图 2）。

1. 使用 20 倍物镜和明场（BF）模式，识别阳性对照胚胎，并适当设置明场和 GFP 通道的曝光参数，确保荧光信号未使相机饱和。
2. 逐一识别胚胎并手动采集图像。
   注意：一旦为阳性对照胚胎确定了曝光设置，便不再更改设置。这可确保在相同条件下采集每幅图像，从而实现荧光强度的比较。

结果

图1展示了96孔板中各个孔的复合图像。每个复合图像由59张独立图像组成，图像间重叠率为5%。请注意，活体斑马鱼在每个孔中的方向是随机的，但我们仍能区分心脏与肝脏中的荧光信号。明场图像可作为参考，用于评估斑马鱼的朝向并观察形态学异常（图1A和1C）。使用10倍物镜进行自动成像，可用于化学物质筛选，并确定哪些样品需要进一步在更高放大倍数下进行人工评估。图2展示了使用20倍长工作距离物镜拍摄的图像，以实现更详细的分析。这些图像在完成图1所示的自动扫描后，无需将培养板从显微镜载物台上取下，直接在同一位置获取。使用20倍物镜可将心脏中的荧光信号精确定位于心脏瓣膜（图2C-2F）。偶尔，胚胎的朝向可能不利于图像采集，从而导致结果不明确。每个孔中放置3条斑马鱼，并对每种处理设置三个重复（实验方案步骤2.3），可提供多次机会准确观察荧光信号。

讨论

本方案描述了一种自动成像斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的简便方法。该方案使用配备 Zen Blue 2011 软件的 Zeiss Axio Observer. Z1 显微镜开发完成，但该技术也可适配于任何配备电动载物台且显微镜控制软件支持拼接以生成复合图像的倒置显微镜。为倒置显微镜加装电动载物台，可作为高通量筛选专用设备的一种实用且成本较低的替代方案。电动载物台的价格根据显微镜的品牌型号及载物台质量的不同，从数千至数万美元不等。

该实验方案中包含若干关键步骤。某些化学物质对光敏感，因此在处理过程中将胚胎置于避光环境中孵育可能更为有利。斑马鱼胚胎对干燥敏感。因此，对于持续超过一天的化学暴露处理，必须在96孔板边缘的孔中加入培养基，以减少蒸发（方案步骤2.3）。

还必须确保载物台经过仔细校准（实验方案步骤 3.2）。一个常见的错误是将培养板放置在载物台上时未完全固定。在这种情况下，当载物台移动时，培养板的位置可能发生偏移，导致某些孔部分成像或完全无法成像。在连续成像多个培养板时，只要这些板来自同一制造商且在载物台上的放置方向完全相同，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
塑料移液管；宽口	Fisher	13-711-23
塑料移液管；细尖头	Fisher	13-711-26
96孔圆底平底板	Fisher	21-377-203
100 × 35 mm 培养皿	Fisher	08-757-100D
35 × 60 mm 培养皿	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 精细镊子	Fine Science Tools	11254-20	尖端尺寸为 0.05 × 0.01 mm，用于手动去除胚胎的绒毛膜
三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulfonate）	Sigma Aldrich	A5040-25G	参见《斑马鱼手册》配方（http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63）
1-苯基-2-硫脲（PTU）	Sigma Aldrich	P7629-10G	配制 20 mM 储存液（100倍浓度），使用时稀释至 E3B 中含 200 μM
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		本方案需要配备电动载物台的倒置荧光显微镜
20倍长工作距离物镜	Carl Zeiss		我们使用的物镜数值孔径为 0.4，工作距离为 8.4 mm
Axiocam HRm 数字相机	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 显微镜控制软件	Carl Zeiss		本方案需要显微成像自动化与控制软件，以支持通过电动载物台采集拼接图像
亚甲蓝（Methylene Blue）	Sigma Aldrich	MB-1; 25 克	用反渗透水配制成 2% 溶液，用于 E3B（见下文）
E3B			60倍 E3 溶液： NaCl                    - 17.2 克 KCl                       - 0.76 克 CaCl2·2H2O     - 2.9 克 MgSO4·7H2O  - 4.9 克 或 MgSO4 - 2.39 克 溶于 1 升 Milli-Q 水中；储存于无菌 1 升瓶中。 斑马鱼用 1倍 E3B 溶液： 60倍 E3      150 ml 2% 亚甲蓝     100 μl  用 Milli-Q 水定容至 9 升