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方法文章

体外 使用过度磷酸化 Tau 蛋白的聚集实验

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DOI：

10.3791/51537

⸱

2015年1月2日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

未修饰和过度磷酸化的tau蛋白被用于两个实验 体外 通过聚集实验揭示依赖于过度磷酸化的快速聚集动力学。这些实验为未来筛选能够调节过度磷酸化tau蛋白形成纤维倾向的化合物奠定了基础，而此类纤维正是阿尔茨海默病进展的关键因素。

摘要

阿尔茨海默病是一组被称为tau蛋白病（tauopathies）的神经退行性疾病中的一种，其特征是神经元内出现以神经原纤维缠结（NFTs）形式存在的过度磷酸化tau蛋白沉积。NFT的密度与认知功能障碍及其他神经退行性症状密切相关，因此推动了以tau蛋白聚集为靶点的治疗策略的研发。然而迄今为止，tau蛋白聚集检测通常使用不含病理相关磷酸化修饰的重组或合成tau蛋白。本文描述了两种以重组的过度磷酸化tau蛋白为研究对象的检测方法。这些方法可扩展用于高通量筛选能够调节过度磷酸化tau蛋白聚集体动力学或稳定性的化合物。利用过度磷酸化tau蛋白亚型，有望发现治疗阿尔茨海默病及其他tau蛋白病的新型治疗药物。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一类被称为tau蛋白病（tauopathies）的神经退行性疾病中的一种。tau蛋白病的核心病理特征是神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中出现的神经原纤维缠结（NFTs）1-4。NFT的密度与认知功能障碍3,5以及神经元丢失6密切相关。NFT主要由高度磷酸化的tau蛋白（以下简称“p-tau”）组成，这些蛋白形成直形或成对螺旋纤维（PHF）7,8。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，被认为有助于轴突运输，这对神经元信号传导和物质运输至关重要9,10。在正常大脑中，每个tau分子含有2至3个磷酸基团，但在tau蛋白病患者中，其磷酸化水平可增加数倍11。多种激酶可能参与tau蛋白的过度磷酸化过程，包括GSK3β（糖原合成酶激酶3β）和CDK5（周期蛋白依赖性激酶5）12,13，但引发病理性磷酸化的直接诱因仍不明确14。发生在微管结合基序内或附近的异常磷酸化会导致tau蛋白从微管上解离15，并引起tau蛋白错误定位至胞体-树突区，在该区域p-tau聚集成直形或成对螺旋纤维，最终可聚合形成NFT包涵体。tau蛋白过度磷酸化、NFT形成与神经退行性变之间的紧密关联，促使人们普遍认为p-tau缠结会引发凋亡及其他细胞毒性反应，因而被认为是tau蛋白病导致神经退行性变的根本原因16,17。基于这一假说，已开展药物筛选和早期临床试验18。然而，该假说也面临挑战19,20。例如，SantaCruz 等研究表明，即使已有tau分子继续形成NFT，通过抑制突变人源tau的表达仍可改善转基因小鼠的认知功能21。在果蝇（Drosophila）模型中，NFT被发现能够隔离有毒的胞质tau，从而保护 underlying 神经元细胞22,23。显然，无论NFT是否具有致病作用，都将极大影响tau蛋白病治疗策略的发展方向。

在高浓度下，重组或正常脑源性tau蛋白会自发地但缓慢地聚合形成类似PHF的结构 体外，这通过多种β折叠结构偏好性荧光染料的结合、电子显微镜观察以及光散射光谱得以证实 24-27加入肝素或花生四烯酸（人脑中含量丰富的脂肪酸）可显著加速成对螺旋丝（PHF）的形成，且该过程具有tau蛋白亚型依赖性和诱导剂浓度依赖性。 28-32有趣的是，从阿尔茨海默病（AD）脑组织中纯化的过度磷酸化tau蛋白，或通过完全磷酸化制备的过度磷酸化tau蛋白 体外 磷酸化反应聚集更快且更高效 26,33-35这些结果与 p-tau 的病理作用高度一致。 体外 基于p-tau聚集的系统因此可作为阿尔茨海默病药物筛选的有力工具。

鉴于tau蛋白聚集与阿尔茨海默病（AD）的进行性神经退行性变密切相关，以及近期针对AD另一关键组织学标志物Aβ斑块的药物研发相继失败 36-38，针对调控tau蛋白聚集的药物研发兴趣日益增长。事实上，已有多个研究团队开始采用不同通量水平进行药物筛选，使用 体外 以tau蛋白聚集反应作为主要检测方法。多种化学物质被发现对tau蛋白的聚集具有抑制或逆转作用。 体外 39-42然而，目前所有tau蛋白聚集调节剂的筛选均使用未经修饰的tau蛋白，忽略了磷酸化这一关键病理标志，这引发了人们对这些化合物在阿尔茨海默病治疗中特异性和有效性的担忧。

开发用于生化表征和阿尔茨海默病（AD）药物筛选的聚集检测方法时，一个主要障碍是难以获得足量具有病理生理相关性的高磷酸化tau蛋白。我们利用“拉链辅助催化系统”（Zippers-Assisted Catalysis system），在大肠杆菌（E. coli）中将tau蛋白的1N4R亚型与GSK-3β激酶共同表达为亮氨酸拉链融合蛋白，成功克服了这一难题（Sui et al.，已投稿；最终产物中的tau和p-tau见图1；另见43中对p-tau的初步质谱表征结果）。在一组针对tau蛋白不同磷酸化位点的九种特异性抗体中，有八个位点检测到阳性信号（数据未显示）。下文将描述可区分未修饰tau蛋白与p-tau蛋白聚集动力学差异的实验方案及仪器操作方法。这些检测方法是在已发表的检测方案基础上改进而来，通过硫磺素T（ThT）或硫磺素S（ThS）与淀粉样蛋白（tau聚集体）结合后荧光信号的增强进行检测26。第一种为“终末法”、无染料检测模式：聚集反应在不含淀粉样染料的条件下组装并孵育；在不同时间点取出各反应体系的等分试样，与含ThT的缓冲液等体积混合，以终止聚集反应并使ThT结合tau聚集体，随后使用IAP FluoroMax-2荧光分光光度计测定荧光强度。第二种为“含染料”连续监测法：在聚集反应体系中直接加入ThT或ThS，整个实验过程中可手动或借助多孔板读数仪连续测定荧光信号。此外，我们还介绍了一种在连续检测模式下使用接近生理浓度的tau和p-tau进行聚集实验的方法，该条件下磷酸化的影响仍可被清晰检测到。下文将逐步说明各项操作流程，并展示这些检测方法的代表性结果。随后将讨论每种方法的优缺点及其在药物筛选中的潜在应用。

在高浓度下，tau蛋白会自发聚集形成类淀粉样结构。然而，在实验室中，通常使用肝素（平均分子量为6,000 g/mol）和花生四烯酸等诱导剂来加速tau蛋白的纤维化过程。本文所示示例包含30 µM肝素。tau蛋白淀粉样聚集的形成可通过硫黄素T（ThT）或硫黄素S（ThS）与淀粉样结构结合后产生的荧光进行监测。ThT在结合tau聚集物后，其荧光发生红移（激发波长：450 nm；发射峰值：485 nm）。而ThS在未结合淀粉样结构前，在450 nm激发下于510 nm处仅有微弱发射荧光，但在存在如聚集态tau蛋白等淀粉样蛋白时，其荧光强度显著增强44。这两种染料均可有效检测tau蛋白及磷酸化tau蛋白（p-tau）的聚集。由于ThT具有较强且相对较宽的发射峰（见图2），在510 nm处的荧光单位仅降低30%。为方便起见，无论使用哪种染料，我们均采用相同的激发/发射波长组合（即，450 nm/510 nm）来监测tau蛋白的聚集过程。

Tau 蛋白的聚集反应可在有或无染料的条件下进行，具体取决于实验目的和 Tau 蛋白的可获得性。以下展示了两种反应模式。此外，我们还演示了两种不同仪器的操作方法——单样品荧光光谱仪（ISA-SPEX FluoroMax-2）和多孔板读板仪（SpectraMax M2）。读者可根据自身具体需求和仪器条件对这些实验方案进行适当调整。

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方案

1. 试剂的准备

  1. 配制聚集缓冲液（20 mM Tris，pH 7.4，100 mM NaCl，1 mM EDTA）。室温保存，可稳定数月。使用前补充 1 mM 二硫苏糖醇（DTT）。
    注意：基于 HEPES 的缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.5，0.1 mM EDTA，5 mM DTT）在 tau 蛋白聚集实验中也可获得类似结果。
  2. 配制硫黄素 T 或硫黄素 S 储存液（3 mM，溶于聚集缓冲液中），使用 0.22 μm 无菌滤器过滤。置于铝箔包裹的离心管中，–20 °C 保存，可稳定数月。
  3. 配制肝素储存液（300 μM，溶于聚集缓冲液中）。–20 °C 保存，可稳定数月。
  4. 配制二硫苏糖醇（DTT）储存液（1 M，溶于水中）。分装至 1.5 ml 离心管中，–20 °C 保存。在进行聚集实验前，将 1 M 溶液于室温解冻。从此 1,000 倍浓缩储存液中，用去离子水稀释配制 100 mM 工作液，并置于冰上待用。
  5. 从 –80 °C 冰箱中取出 tau 蛋白样品，在冰上解冻。用聚集缓冲液将 tau 蛋白调整至预定浓度。在 4 °C 条件下，以 20,800 × g 离心 10 分钟，去除预先形成的大型聚集体。此预离心步骤可提高后续每批蛋白样品荧光检测结果的一致性。将上清液转移至另一离心管中，置于冰上待用，准备进行聚集反应体系的组装。

2. 无染料末端检测法

注意：本实验的聚集反应在不含荧光染料的条件下进行。混合所有组分后，让反应进行至预设的时间点。然后从聚集反应体系中取出等分试样，与硫磺素T（ThT）或硫磺ine S（ThS）混合，以实现淀粉样蛋白结合，随后进行荧光检测。初始聚集反应体系的体积取决于所需时间点的数量。该方法可能需要较大量的tau蛋白，但操作快速、直接，可在荧光光度计或多功能酶标仪中完成（参见讨论部分）。以下是以ISA SPEX FluoroMax-2紧凑型荧光光谱仪进行荧光定量的逐步操作步骤。

  1. 在1.5 ml离心管中按照表1配制聚集反应混合液。每列代表一个100 μl反应体系所需的组分，足以进行一次时间点的检测。根据具体实验所需的时间点数量调整总体积。为避免移液误差，每种组分额外增加10%。此处所示含肝素的典型反应体系可用花生四烯酸或聚集缓冲液替代。向反应体系中加入DTT至终浓度为1 mM。若整个反应持续超过一天，需每天补充新鲜DTT（终浓度1 mM），以维持还原性环境。
  2. 轻轻颠倒混匀数次。将每个反应体系置于37 °C培养箱或水浴中。Tau蛋白聚集过程无需振荡。
  3. 在测量荧光前，先开启荧光分光光度计（先开光源，再开计算机）。
    注意：氙弧灯可立即使用，但为获得最佳结果，建议仪器预热约10分钟后再进行荧光读数。
  4. 启动计算机上的软件。
    1. 在仪器控制中心中选择实时显示模式，设置激发波长为450 nm（狭缝宽度2 nm），发射波长为510 nm（狭缝宽度5 nm）。关闭实时显示窗口，返回仪器控制中心。
    2. 选择恒定波长分析，在上方框架中点击Add>>按钮添加波长设置。将标准误差设为1，最大尝试次数设为3，然后点击添加。点击开始！以打开数据展示窗口。
    3. 在数据展示窗口中，点击开始采集以打开新建样品对话框。将样品类型设为“未知”。
  5. 向每100 μl聚集反应混合液中加入98 µl聚集缓冲液和2 µl 3 mM硫黄素T。反复吹打混匀。
  6. 将全部混合液转移至比色皿（FCA3，外径尺寸 w × l × h = 12.5 mm × 12.5 mm × 45 mm）。将比色皿放入样品室的样品架中，并盖上盖子。点击运行以采集荧光数据。记录数据。
  7. 取出比色皿，倾倒出溶液。用蒸馏水冲洗比色皿3次。通过向比色皿内外吹入空气将其干燥。

3. 在 SpectraMax M2 酶标仪上进行含染料的连续模式检测

注意：本实验与之前的方法不同之处在于，聚集反应中包含了荧光染料 ThT 或 ThS。这使得可以对同一组反应进行连续监测。由于反应体系需重复使用，因此该方法更适合使用自动化的多孔板读板仪（如下方所示的 SpectraMax M2 操作）。常规荧光计也可使用，但由于操作为手动，对快速聚集反应的检测频率在一定程度上受限。

  1. 按照表2在96孔板（96孔黑色实底板，每孔体积360 μl，平底）中配制聚集反应混合液。每列对应一个200 μl反应体系所需的试剂，足以完成一次时间点的检测。通过反复移液充分混匀。在实验期间每天补充新鲜的1 mM DTT。
  2. 将96孔板置于37 °C孵育。
  3. 每次荧光检测前，打开多功能酶标仪和计算机，预留约10分钟使仪器充分稳定。
  4. 启动计算机上的软件，设置温度为37 °C，选择荧光强度（FI-Top Read）模式，激发波长设为450 nm，发射波长设为510 nm。
  5. 将96孔板插入仪器抽屉中，按下READ键开始检测。
  6. 检测完成后取出孔板，放回37 °C培养箱继续孵育。将数据复制并粘贴至Excel表格中，用于数据分析和作图。

4. 使用染料在小型荧光分光光度计上进行连续模式检测

  1. 按照表3在1.5 ml离心管中配制聚集反应混合液。每一列代表一个200 μl反应所需的组分，足以进行一次时间点的测定。
  2. 轻轻颠倒离心管数次以混匀。
  3. 打开荧光分光光度计，并按照步骤2.3和2.4设置软件。
  4. 将全部混合液转移至比色皿中。将比色皿放入样品室的样品架上，并盖上盖子。点击运行以采集荧光数据。记录数据。
  5. 通过点击运行并记录数据，在适当的时间间隔持续读数。若需高频监测聚集过程（例如，每30或60秒一次），应将反应液保留在比色皿和仪器中，直至测量完成，或有足够时间更换反应液或比色皿。
  6. 取出比色皿并倾倒溶液。用蒸馏水冲洗比色皿3次。通过向比色皿内外吹入空气使其干燥。

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结果

利用重组的 tau 蛋白和磷酸化 tau 蛋白（p-tau）（图 1），我们建立了两种不同的实验方案，通过硫黄素 T（ThT）和硫黄素 S（ThS）在结合淀粉样蛋白聚集体（包括 tau 和 p-tau）时产生强烈荧光的特性，来比较 tau 与 p-tau 的聚集动力学（图 2）。无论在聚集反应中是否加入荧光染料，我们均观察到过度磷酸化显著促进 tau 蛋白的聚集（图 3–5）。这种促进作用与肝素无关（数据未显示）。在典型反应中，tau 和 p-tau 在反应开始后的前 30 分钟内迅速形成寡聚体，随后聚集速率显著减慢（图 3 和图 5），且在整个实验过程中，p-tau 始终表现出更高的荧光强度单位。在聚集反应中加入 ThT 会导致聚集速率明显减缓（图 4）。两种蛋白在反应启动约 160 小时后均接近平台期。而 ThS 则不会引起聚集过程的显著减慢（图 5）。

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讨论

本方案展示了可检测磷酸化依赖性tau蛋白快速聚集动力学的不同实验条件和仪器。在终点实验中，于每个时间点从主反应体系中取出部分反应液，加入荧光染料ThT，随后检测淀粉样蛋白结合诱导的荧光信号26。第二种方法为含染料模式，即在ThT或ThS存在的条件下进行tau蛋白聚集反应，使该类反应适用于对tau蛋白聚集体生长的实时自动监测。上述每种方法均有其优缺点。

终末模式反应仅使用诱导tau蛋白聚集所需的组分进行。将反应液与硫黄素T（ThT）稀释并混合会显著减缓荧光增强的速率，实质上在进行荧光定量时停止了反应。因此，该方法也适用于手动操作。然而，由于加入ThT后反应实际上已终止，绘制聚集曲线可能需要大量tau蛋白。该方法的另一个潜在局限是频繁接触反应混合物可能引入微生物或蛋白水解污染，或导致蛋白质氧化。相比之下，含染料模式允许在ThT或硫黄素S（ThS）存在下生成淀粉样蛋白，聚集进程可被连续监测而无需干扰反应体系。这一特性在建立自动化检测平台时尤为有利。然而，不同染料可能产生特异性响应。事实上，ThT显著延缓tau和磷酸化tau（p-tau）的聚集，而ThS则影响甚微（比...

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披露

我们无任何披露事项。

致谢

本工作由美国国家衰老研究所（AG039768）资助 MHK。我们感谢 Thomas Sharkey 博士和 Honggao Yan 博士慷慨提供仪器，同时感谢 Sean Weise 和 Yan Wu 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Trizma baseSigmaT1503
NaClMacron Fine ChemicalsMAL-7581-06
乙二胺四乙酸（EDTA）Invitrogen15576-028
硫黄素 TSigmaT3516避光保存
硫黄素 SSigmaT1892避光保存
肝素SigmaH3393
DL-二硫苏糖醇（DTT）SigmaD97794 °C 保存
96 孔板Corning3917
ISA SPEX FluoroMax-2Horiba
SpectraMax M2 多功能微孔板读板仪Molecular Devices
小鼠抗 Tau 单克隆抗体R&D SystemsMAB3494–80 °C 保存

参考文献

  1. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci. 24, 1121-1159 (2001).
  2. Ballatore, C., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9), 663-672 (2007).
  3. Arriagada, P. V., Marzloff, K., Hyman, B. T. Distribution of Alzheimer-type pathologic changes in nondemented elderly individuals matches the pattern in Alzheimer's disease. Neurology. 42 (9), 1681-1688 (1992).
  4. Arriagada, P. V., Growdon, J. H., Hedley-Whyte, E. T., Hyman, B. T. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer's disease. Neurology. 42 (3 Pt 1), 631-639 (1992).
  5. Bancher, C., Braak, H., Fischer, P., Jellinger, K. A. Neuropathological staging of Alzheimer lesions and intellectual status in Alzheimer's and Parkinson's disease patients. Neurosci Lett. 162 (1-2), 179-182 (1993).
  6. Guillozet, A. L., Weintraub, S., Mash, D. C., Mesulam, M. M. Neurofibrillary tangles, amyloid, and memory in aging and mild cognitive impairment. Arch Neurol. 60 (5), 729-736 (2003).
  7. Hasegawa, M., et al. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J Biol Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  8. Matsuo, E. S., et al. Biopsy-derived adult human brain tau is phosphorylated at many of the same sites as Alzheimer's disease paired helical filament tau. Neuron. 13 (4), 989-1002 (1994).
  9. Bamburg, J. R., Bloom, G. S. Cytoskeletal pathologies of Alzheimer disease. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (8), 635-649 (2009).
  10. Denk, F., Wade-Martins, R. Knock-out and transgenic mouse models of tauopathies. Neurobiol Aging. 30 (1), 1-13 (2009).
  11. Gong, C. X., Iqbal, K. Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau: a promising therapeutic target for Alzheimer disease. Curr Med Chem. 15 (23), 2321-2328 (2008).
  12. Mazanetz, M. P., Fischer, P. M. Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 464-479 (2007).
  13. Brunden, K. R., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Advances in tau-focused drug discovery for Alzheimer's disease and related tauopathies. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 783-793 (2009).
  14. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  15. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33 (1), 95-130 (2000).
  16. Lee, V. M., Brunden, K. R., Hutton, M., Trojanowski, J. Q. Developing therapeutic approaches to tau, selected kinases, and related neuronal protein targets. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006437(2011).
  17. Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Biochemistry and cell biology of tau protein in neurofibrillary degeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006247(2012).
  18. Bulic, B., Pickhardt, M., Mandelkow, E. Progress and Developments in Tau Aggregation Inhibitors for Alzheimer Disease. J Med Chem. 56 (11), 4135-4155 (2013).
  19. Cowan, C. M., Quraishe, S., Mudher, A. What is the pathological significance of tau oligomers. Biochem Soc Trans. 40 (4), 693-697 (2012).
  20. Spires-Jones, T. L., Kopeikina, K. J., Koffie, R. M., de Calignon, A., Hyman, B. T. Are tangles as toxic as they look. J Mol Neurosci. 45 (3), 438-444 (2011).
  21. SantaCruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
  22. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293 (5530), 711-714 (2001).
  23. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  24. Wille, H., Drewes, G., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Alzheimer-like paired helical filaments and antiparallel dimers formed from microtubule-associated protein tau in vitro. J Cell Biol. 118 (3), 573-584 (1992).
  25. Alonso, A., Zaidi, T., Novak, M., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Hyperphosphorylation induces self-assembly of tau into tangles of paired helical filaments/straight filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6923-6928 (2001).
  26. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  27. Wilson, D. M., Binder, L. I. Polymerization of microtubule-associated protein tau under near-physiological conditions. J Biol Chem. 270 (41), 24306-24314 (1995).
  28. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  29. Perez, M., Valpuesta, J. M., Medina, M., Montejo de Garcini, E., Avila, J. Polymerization of tau into filaments in the presence of heparin: the minimal sequence required for tau-tau interaction. J Neurochem. 67 (3), 1183-1190 (1996).
  30. Carlson, S. W., et al. A complex mechanism for inducer mediated tau polymerization. Biochemistry. 46 (30), 8838-8849 (2007).
  31. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  32. King, M. E., Gamblin, T. C., Kuret, J., Binder, L. I. Differential assembly of human tau isoforms in the presence of arachidonic acid. J Neurochem. 74 (4), 1749-1757 (2000).
  33. Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pseudo-phosphorylation of tau at Ser202 and Thr205 affects tau filament formation. Brain Res Mol Brain Res. 138 (1), 84-93 (2005).
  34. Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pre-assembled tau filaments phosphorylated by GSK-3b form large tangle-like structures. Neurobiol Dis. 31 (3), 368-377 (2008).
  35. Grundke-Iqbal, I., et al. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  36. Castellani, R. J., Perry, G. Pathogenesis and disease-modifying therapy in Alzheimer's disease: the flat line of progress. Arch Med Res. 43 (8), 694-698 (2012).
  37. Green, R. C., et al. Effect of tarenflurbil on cognitive decline and activities of daily living in patients with mild Alzheimer disease: a randomized controlled trial. JAMA. 302 (23), 2557-2564 (2009).
  38. Gauthier, S., et al. Effect of tramiprosate in patients with mild-to-moderate Alzheimer's disease: exploratory analyses of the MRI sub-group of the Alphase study. J Nutr Health Aging. 13 (6), 550-557 (2009).
  39. Pickhardt, M., et al. Anthraquinones inhibit tau aggregation and dissolve Alzheimer's paired helical filaments in vitro and in cells. J Biol Chem. 280 (5), 3628-3635 (2005).
  40. Crowe, A., Ballatore, C., Hyde, E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. High throughput screening for small molecule inhibitors of heparin-induced tau fibril formation. Biochem Biophys Res Commun. 358 (1), 1-6 (2007).
  41. Taniguchi, S., et al. Inhibition of heparin-induced tau filament formation by phenothiazines, polyphenols, and porphyrins. J Biol Chem. 280 (9), 7614-7623 (2005).
  42. Sigurdsson, E. M. Tau-focused immunotherapy for Alzheimer's disease and related tauopathies. Curr Alzheimer Res. 6 (5), 446-450 (2009).
  43. Tan, Y. J., et al. Phosphopeptide Enrichment with TiO-Modified Membranes and Investigation of Tau Protein Phosphorylation. Anal Chem. 85 (12), 5699-5706 (2013).
  44. Santa-Maria, I., Perez, M., Hernandez, F., Avila, J., Moreno, F. J. Characteristics of the binding of thioflavin S to tau paired helical filaments. J Alzheimers Dis. 9 (3), 279-285 (2006).
  45. Lira-De Leon, K. I., et al. Molecular mechanism of tau aggregation induced by anionic and cationic dyes. J Alzheimers Dis. 35 (2), 319-334 (2013).
  46. DiNitto, J. P., Wang, L., Wu, J. C. Continuous fluorescence-based method for assessing dicer cleavage efficiency reveals 3' overhang nucleotide preference. BioTechniques. 48, 303-311 (2010).
  47. Maeda, S., et al. Granular tau oligomers as intermediates of tau filaments. Biochemistry. 46 (12), 3856-3861 (2007).
  48. Pickhardt, M., et al. Phenylthiazolyl-hydrazide and its derivatives are potent inhibitors of tau aggregation and toxicity in vitro and in cells. Biochemistry. 46 (35), 10016-10023 (2007).
  49. Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Tau phosphorylation by GSK-3beta promotes tangle-like filament morphology. Mol Neurodegener. 2, 12(2007).
  50. McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
  51. Herrup, K. Reimagining Alzheimer's disease--an age-based hypothesis. J Neurosci. 30 (50), 16755-16762 (2010).
  52. Gavett, B. E., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: a potential late effect of sport-related concussive and subconcussive head trauma. Clin Sports Med. 30 (1), 179-188 (2011).
  53. Tsitsopoulos, P. P., Marklund, N. Amyloid-beta Peptides and Tau Protein as Biomarkers in Cerebrospinal and Interstitial Fluid Following Traumatic Brain Injury: A Review of Experimental and Clinical Studies. Front Neurol. 4, 79(2013).

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