体外聚集测定使用tau蛋白的蛋白质

摘要

未修饰的和磷酸化的tau蛋白以两种体外聚集测定中使用以显示磷酸化依赖快速聚合动力学。这些测定铺路用于可调节tau蛋白的倾向，以形成背后阿尔茨海默氏病的进展纤丝化合物未来画面。

摘要

阿尔茨海默病是一大类神经退行性疾病之一，称为 tau 蛋白病，表现为过度磷酸化的 tau 蛋白以神经原纤维缠结 （NFT） 的形式在神经元沉积。 NFT 的密度与认知障碍和其他神经退行性症状密切相关，从而促使人们努力开发基于 tau 聚集的疗法。 然而，到目前为止，tau 聚集测定使用没有病理相关磷酸化标记的重组或合成 tau。 在这里，我们描述了两种使用重组、高磷酸化 tau 作为主题的测定。 这些检测可以扩大规模，用于高通量筛选可以调节过度磷酸化 tau 聚集体动力学或稳定性的化合物。 阿尔茨海默病和其他 tau 病的新疗法可能使用过度磷酸化的 tau 亚型来发现。

引言

阿尔茨海默氏病（AD）是一个大的集合称为tau蛋白病的神经变性疾病中的一种。典型的病理Tau蛋白病的基本是神经原纤维缠结，在神经元，星形胶质细胞和小胶质细胞^1-4。在NFT密度与认知功能障碍^3,5和神经元丢失^6。 NFT主要含有高度磷酸化tau蛋白（简称为"P-tau蛋白"此后），其形成直链或成对螺旋纤丝^{（PHF）7,8。}头被认为是有利于轴突运输的是神经信号和贩运^9,10必不可少的微管相关蛋白。每个tau蛋白分子含有2〜3磷酸盐在正常脑，而是由几个折叠的磷含量的增加在τ病变的患者^11。多激酶可能有助于tau蛋白包括GSK3β（糖原合酶激酶3β）和CDK5（细胞周期素德依赖激酶^5）12,13，但直接触发的病理磷酸化仍然遥遥无期^14。异常磷酸化中或附近的微管结合基序上解离的tau从微管^15，并且使头误定位到somatodendritic隔室，其中p-tau蛋白寡聚成直链或成对螺旋丝，可以最终聚合成NFT的内含物。 tau蛋白磷酸化，NFT形成与神经变性之间的紧密联系导致普遍的假设是p-tau蛋白缠结引起的凋亡和其他细胞毒性反应，因此是对神经变性τ病变^16,17的根本原因。基于这个前提药物屏幕和早期临床试验已经启动^18。然而，这种假设面临的挑战^19,20。例如，圣克鲁斯等人表明，转基因小鼠的认知功能可以通过抑制突变体的表达来改进人类tau蛋白，即使NFTS继续形成从现有的tau蛋白分子^21。在果蝇模型，NFT显示出螯合的有毒胞质tau蛋白以保护下面的神经元细胞^22,23。显然，NFT的发病中的作用，如果有的话，将极大地影响τ病变治疗剂的发展方向。

在高浓度的，重组的或正常脑τ蛋白自发但慢慢地聚合成PHF状结构体外 ，通过几个β折叠优选荧光染料，电子显微镜和光散射光谱^24-27的结合所指示的。添加肝素或花生四烯酸，丰富的脂肪酸在人类的大脑，大大加速了PHF形成头isoform-和诱导浓度依赖性^28-32。有趣的是，tau蛋白纯化从AD大脑或体外磷酸化反应制得面面俱到一ggregates更快，更高效地^26,33-35。这些结果与对 - tau蛋白的病理性作用良好的协议。 体外基于对tau的聚集系统可以因此用作一个强大的工具用于AD药物筛选。

定在发现的药物可控制的tau聚集在上升的兴趣的tau聚集和AD的渐进的神经变性之间的密切联系，以及在药物开发的最新故障靶向Aβ斑块，公元^36-38的另一个重要的组织学标志物。事实上，几个小组已经在不同的通量开始药物屏幕，使用体外的tau聚集反应作为主要测定法。被发现的一些化学品的展示在体外 ^39-42对tau聚集的抑制或逆转的活动。但是，目前所有的tau蛋白聚集调节屏幕使用未经修改的头说错过荧光粉的主要病理标记ylation，提高用于在公元治疗使用这些化合物的特异性和功效的关注。

一个发展中的聚集试验的生化特性和AD药物筛选的主要障碍是生产足够数量的病理生理学相关tau蛋白的蛋白质。使用拉链辅助催化系统，其中tau蛋白的同种型1N4R和GSK-3β激酶共表达在大肠杆菌中的大肠杆菌亮氨酸拉链融合蛋白，我们已经克服了这个挑战（穗等人 ，提交;请参阅tau蛋白和P-tau蛋白的最终产品图1;另见⁴³ P-tau蛋白的初步质谱鉴定）。从特异性针对tau的不同磷酸化位点9的抗体的面板，阳性信号出现在八个位置（数据未示出）。下面，我们描述的协议及仪器能够区分的聚集动力学ð未修改的tau蛋白和P-tau蛋白物种之间ifferences。这些检测是从公布的协议，可测得硫代黄素T（ThT的）或硫代黄素S（THS）的荧光的增加对淀粉样蛋白（tau聚集）结合²⁶修改。在第一个"终端"，无染料的方法，聚合反应被组装并孵育在不存在淀粉样蛋白染料。在不同时间点，每个反应的等分试样被去除，并与含的ThT缓冲器的等体积混合，以阻止聚集和允许的ThT结合tau聚集。荧光是由IAP FluoroMax-2荧光计测量。在第二"与染料"持续监控测定法，或ThT的THS被包括在聚合反应。荧光可以连续地在整个实验手动测量或使用多板读数器。此外，我们描述了在连续测量莫使用的tau和对tau的一个近生理浓度的聚集的测定德。磷酸化的效果仍然易被察觉。下面，我们将描述一步一步的操作的程序，并显示这些分析的代表性结果。讨论一些每种方法的利弊，以及潜在的药物筛选的应用将随之而来。

以高浓度，tau蛋白聚集成淀粉样蛋白样结构自发。然而，在实验室中，tau蛋白纤维化典型地通过例如诱导肝素（平均分子量6000克/摩尔）和花生四烯酸加速。本文所示的例子包括30μM肝素。 tau蛋白的淀粉样蛋白聚集体的形成是通过从淀粉通过硫磺素T（ThT的）或硫磺素S（THS）结合而产生的荧光进行监测。结合后tau聚集，ThT的表现出红移荧光（激发:450纳米;峰值发射:485纳米）。 THS，而另一方面，具有弱发射在之前结合淀粉样蛋白为510nm（激发在450nm处），但这种fluorescencë增加显著中淀粉样蛋白的存在，如聚集的^τ44。这两种染料的检测tau蛋白和P-tau蛋白聚集工作。因为的ThT（ 见图2）的强和相对宽的发光峰的，只有30在荧光单元减少在510nm％。为方便起见，我们使用的激发/发射波长（ 即 450纳米/ 510纳米）同样的组合来监控头聚集在使用任何染料。

头聚合所用的染料的存在或不存在下进行，这取决于测定的目的和τ蛋白的可用性。反应的两种模式如下所示。此外，我们证明了两种不同的仪器操作 - 单样本荧光计（ISA-SPEX FluoroMax-2）和多板酶标仪（Spectramax M2）。读者应该能够适应这些协议，以满足他们的特定需求和仪器的可用性。

方案

1.试剂的配制

1. 制备聚合缓冲液（20mM的Tris，pH值7.4，100mM的氯化钠，1mM EDTA）中。存储在室温下，稳定了几个月。补充使用前1 mM的二硫苏糖醇（DTT）。
   注:一个HEPES基缓冲液（10mM HEPES，pH为7.5，0.1毫摩尔EDTA，5毫DTT）也产生在tau蛋白聚集了类似的结果。
2. 制备硫磺素T或硫磺素的股票溶液（3毫米，溶解在聚合缓冲液中），并过滤通过0.22μm的无菌过滤器单元。储存在-20℃下在覆盖的铝箔，稳定数月的管。
3. 制备肝素原液（300μM，溶解在聚合缓冲液）。储存在-20℃下，稳定数月。
4. 准备二硫苏糖醇（DTT）的股票（1M，溶于水）。分装成1.5毫升管。存储在-20℃。前聚合测定法，解冻在RT的1M溶液。从这个1000倍的股票，准备100毫米的工作股票用去离子水等分。离开冰直到准备。
5. -80去除头℃的冰柜。冰上解冻。调整头至规定浓度与聚合缓冲区。旋在微量在20800×g离心10分钟，在4℃以除去预先形成大的聚集体。该预纺丝步骤增加一致性每批的蛋白质制备的随后荧光测定。将上清液转移至另一管中;离开冰上，直到准备组装聚集反应。

2.无染，终端分析

注:该测定的聚合反应是在不存在的荧光染料进行。混合所有组分之后，使反应进行到预定的时间点。等分试样然后取出聚合反应，并用的ThT或THS为淀粉样蛋白的荧光读数之前结合混合。聚合反应的初始体积取决于所需要的时间点的数量。这种方法可能requIRE大量tau蛋白，但是快速，简单，并且可以在荧光计或一个多孔板读数器（见讨论）来实现。下面是一步一步的操作，使用ISA SPEX FluoroMax-2紧凑分光光度计进行荧光定量。

1. 设置在1.5ml的Eppendorf管中的聚合混合物，如表1，每列代表所需的100微升反应，这是足够的一次性点测量的成分。调节量的基础上所需要的特定的实验时间点的整个聚合混合物。添加额外的10％的各组分给房间取样误差。此处示出的典型的含反应肝素可以通过花生四烯酸或聚集缓冲器被替换。添加DTT至1mM到反应混合物中。如果整个反应持续超过一天，补充新鲜的DTT每天（1毫米），以确保一个还原环境。
2. 反转管几次混合。解放军CE在一个37℃的恒温箱或水浴每个反应。搅拌不需要用于tau蛋白聚集。
3. 前测量荧光，在分光光度计打开（灯先，然后计算机）。
   注:氙弧灯，可用于马上。然而，对于最佳的结果允许机器读取荧光之前预热约10分钟。
4. 启动计算机上的软件。
   1. 选择实时显示模式下仪表控制中心 ，设置激发波长为450纳米（狭缝到2纳米），发射波长为510纳米（狭缝5纳米）。关闭实时显示模式窗口，返回到仪器控制中心 。
   2. 选择恒波长分析 ，按添加>>键上部框架添加波长集。 标准误差设置采集参数为1， 最大试验到3，然后单击添加 。 单击GO！打开数据显示窗口。
   3. 在数据显示窗口中，单击开始ACQ打开新样品对话框 。选择"未知" 样品类型 。
5. 以每100微升聚集混合，加入98微升聚合缓冲区和2微升3毫米硫黄素T.吸取几次，以混合。
6. 将整个混合物转移到反应杯（FCA3，外部尺寸，wxlxh = 12.5Hz毫米×12.5毫米×45毫米）。放置在样品室中的样品保持器的反应杯，并盖上盖子。单击运行收集荧光数据。记录数据。
7. 取出试管，倒出溶液。冲洗的反应杯由蒸馏水3次。干燥通过在与反应杯外送风。

3.用染料，连续模式测定法上的SpectraMax M2酶标仪

注:此试验不同于前一个，所述荧光染料的ThT或THS被包括在aggrega化反应。这允许相同的一组反应的连续测量。由于重复使用的反应，这种方法是更好地与一个自动多板读数器进行（如所示的SpectraMax M2的操作下）。一个普通的荧光也适用，但快速聚合反应测量的频率是比较有限的，由于操作的手动性质。

1. 设置的聚集混合物在96孔板（96孔黑色实心板，以及体积360微升，平底），如表2，每列代表所需的200微升反应，这是足够的1的成分时间点测量。吹打几次拌匀。在整个实验过程中补充新鲜的1mM的DTT每一天。
2. 孵育96孔板在37℃。
3. 在荧光测定之前，每个时间点，打开多模式酶标仪和计算机。留出足够的时间马折角稳定，约10分钟。
4. 启动计算机上的软件。设定温度至37℃，并选择荧光强度（FI-顶读取）模式，设定激发波长450nm和发射波长在510纳米。
5. 插入的96孔板进抽屉，并按下READ键开始测量。
6. 看完后，取出板然后将其返回到37℃培养箱。数据复制并粘贴到Excel电子表格进行数据分析和绘图。

4.染料，连续模式测定法上的紧凑型荧光光谱仪

1. 设置在1.5ml的Eppendorf管中的聚合混合物，如表3，每列代表所需的200微升反应，这是足够的一次性点测量的成分。
2. 反转管几次混合。
3. 打开分光光度计和软件设定为在步骤2.3和2.4。
4. 传送整个混合物吨OA比色皿。放置在样品室中的样品保持器的反应杯，并盖上盖子。单击运行收集荧光数据。记录数据。
5. 继续在适当的间隔通过点击运行并记录数据读取。如果聚合是在一个较高的频率（ 例如 ，每30或60秒），以进行监测，留在反应杯，并在机器的反应，直到测量完成时，或当有足够的时间来交换反应或比色皿。
6. 取出试管，倒出溶液。冲洗的反应杯由蒸馏水3次。干燥通过在与反应杯外送风。

结果

使用重组tau蛋白和对tau蛋白（ 图1），我们建立了两个不同的协议进行比较的tau和对tau的聚集的动力学，在结合到amyloidal蛋白聚集体采取的ThT和THS的强荧光发射的优点，其中包括头和对tau蛋白（ 图2）。具有或不具有在聚合反应中的荧光染料，我们通过磷酸化（ 图3-5）观测到的tau聚集的一致增强。这种刺激是独立肝素的（数据未示出）。减缓显著（ 图3和5），与对tau蛋白在整个实验过程中表现出更高的荧光单位之前的典型反应中，tau蛋白和对tau蛋白低聚在快速速率在 ​​头30分钟内。包括的ThT在聚合反应导致在聚集速率（ 图4）显著相位差。这两种亚型走近高原反应后，淡160小时已经开始。 THS，另一方面，不引起凝集（ 图5）的明显放缓。

讨论

该协议证明了不同的检测条件和检测磷酸化依赖的快速tau蛋白的聚集动力学的仪器。在终端测定中，荧光染料的ThT加到从主混合物在每个时间点除去反应的一部分。结合淀粉样蛋白诱导的荧光，然后测量^26。在第二，与染料模式，tau蛋白聚集是在的ThT或THS的存在下，使这种类型的适合的tau聚集物的生长的实时自动评估反应。每种方法都有其优点和缺点。

终端模式反应仅与那些需要的tau聚集成份进行。稀释和混合用硫磺素T将反应急剧减慢的荧光增加的速率，基本上停止对荧光定量该反应。这种方法因此也与手动操作兼容。然而，因为reaction为后的ThT此外几乎终止时，可能需要大量的tau的用于绘图的聚集曲线。此方法的另一个潜在的条件是频繁访问到反应混合物中可能引入微生物或蛋白水解污染，或蛋白质氧化。与此相反，在用染料模式允许在的ThT或THS的存在淀粉样蛋白的产生。聚集的进步是可以持续而没有干扰的反应进行监测。建立一个自动化的检测平台时，此功能特别有吸引力。然而，不同的染料可能会引起特定的反应。实际上，延迟的ThT tau蛋白和对tau蛋白聚集显著，但THS具有小的影响（比较

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特里兹玛 碱	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
乙二胺四乙酸 （EDTA）	Invitrogen	15576-028
硫黄素 T	Sigma	T3516	避光储存
硫黄素 S	Sigma	T1892	储存在黑暗
素	Sigma	H3393
DL-二硫苏糖醇 （DTT）	Sigma	D9779	储存在 4 °C
96 孔板	康宁	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 多模式微孔板	检测仪 Molecular Devices
小鼠抗 Tau 单克隆抗体	R&D Systems	MAB3494	存储于 –80 °丙