本方案旨在演示细胞培养物暴露于吸入性有毒化学物质的方法。将分化后的气液 界面（ALI）培养的气道上皮细胞暴露于有毒气体（如氯气）中，可为气道暴露提供一种独特的模型。本文描述了氯气暴露对上皮细胞气液 界面培养体系以及心肌细胞浸没培养体系的影响。体外暴露系统可实现重要的机制性研究，用于评估相关通路，进而推动新型治疗药物的开发。
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摘要
摘要
在用于动物模型之前，细胞培养对于开发和研究治疗剂的疗效至关重要。我们具备独特的能力，可构建高度分化的呼吸道上皮细胞和心肌细胞模型。这一技术可能成为研究有毒吸入性化学物质（例如氯气）有害效应的宝贵工具。这类化学物质通常会与细胞表面相互作用，并在与水反应后生成多种副产物，从而在浸没式培养体系中限制其效应的观察。我们采用的在气液界面培养的高度分化人源呼吸道上皮细胞模型，克服了这一局限，同时为评估潜在有毒吸入性化学物质毒性的关键机制提供了机会。我们描述了暴露于氯等有毒吸入性化学物质后，细胞膜完整性丧失加剧、caspase释放及细胞死亡的现象。本文中，我们提出在哺乳动物心肌细胞和呼吸道上皮细胞培养中模拟氯气暴露的方法，以及评估其对这些细胞类型影响的简单检测手段。
引言
接触氯气（Cl2）等有毒吸入性化学物质（TICs）/气体，在意外暴露以及其可能被用作化学威胁剂的情况下，仍然是持续存在的健康问题。尽管肺部是主要靶器官，但心脏和大脑等其他器官也会受到影响1-3。通常使用体内模型来测试TICs的毒性，但用于毒性评估的体外检测方法更简单、更快捷且成本更低。此外，体外模型还允许对毒剂与细胞之间的相互作用进行广泛研究，而这些作用在体内条件下可能难以评估。目前此类体外暴露系统较为罕见，且在一些传统模型中，将有毒物质直接加入细胞浸没其中的培养基时，这些物质的性质可能因与培养基成分发生相互作用或结合而发生改变。在这些情况下，本文所提出的可直接暴露于气态毒剂的细胞培养系统，例如原代人呼吸道上皮细胞的气液 界面（ALI）培养，可能具有良好的应用前景。
气道上皮细胞是抵御吸入性有毒化学物质的第一道防线。人类气道上皮在肺腔与下层细胞之间形成物理屏障，并参与肺部的免疫应答反应。它可产生多种细胞因子及其他促炎和抗炎介质，同时分泌覆盖上皮表面的黏液/气道表面液体（ASL）。传统浸没培养方法的一个局限性在于 体外 培养系统的问题还在于覆盖上皮表面的气液界面和黏液被移除或稀释，这并不能反映肺上皮细胞在空气中暴露的生理状态。因此，一种理想的 体外 用于TIC毒性测试的系统应模拟这种结构。目前人们非常关注开发能够预测的快速筛选方法 体内 毒性。在气液界面（ALI）培养的上皮细胞可发生分化，具有较完善的结构和功能，相较于浸没培养的细胞，更适合作为气道的体外模型。
本研究描述了利用人呼吸道（气管支气管）上皮细胞的气液界面培养方法来检测吸入性有毒气体的毒性，并将其与心肌细胞的浸没式细胞培养进行比较，从而研究毒性的另一重要靶器官。
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方案
1. 大鼠心肌细胞培养
- 所有实验均在机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案下进行。
- 采用先前所述方法，从雄性大鼠（240–260 g）心脏（心室）中分离获取心肌细胞4简而言之，通过腹腔注射戊巴比妥（100 mg/kg）麻醉动物（通过脚趾夹捏法确认麻醉状态），随后将心脏取出并置于10.0 ml、1 mM Ca2+ 含 Krebs Ringer 缓冲液，pH 7.4。
- 用溶液冲洗心脏5-6次 以去除血液，然后更换为含 Ca2+ 含0.02%蛋白酶和0.06%胶原酶A的无钙克雷斯-林格缓冲液（5.0 ml/心脏）。将心脏在此溶液中孵育10–15分钟 在37 °C下偶尔摇动。
- 10-15 分钟后，用含 Ca2+ 用游离的Krebs Ringer缓冲液再冲洗5分钟。使用25 ml移液管反复吹打悬浮液数次，从松软的组织中释放细胞。
- 通过70 μm尼龙滤网过滤，将细胞从组织中分离，并使其在含有0.1 mM Ca的Krebs Ringer缓冲液中沉降2+将细胞沉淀重悬于1.0 ml含有0.2 mM Ca的Krebs Ringer缓冲液中2+.
- 在15 ml离心管中，小心地将5.0 ml浓度为60 μg/ml的牛血清白蛋白（BSA）溶液铺在细胞悬液上方，以分离心肌细胞与非心肌细胞，并静置30 min。心肌细胞密度较大，会沉降至管底。小心吸除上清液及漂浮细胞。重复此步骤一次，以进一步纯化细胞。
- 通过用0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM和1.0 mM Ca逐步洗涤进行渐进式转换2+ 含有缓冲液）将心室肌细胞/心肌细胞置于1.0 mM Ca2+ 含缓冲液并重悬于ACCT培养基中，该培养基由DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）组成，内含2 mg/ml BSA、2 mM L-肉碱、5 mM 肌酸、5 mM 牛磺酸、100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素 链霉素
- 以每平方毫米100至150个细胞的密度将心肌细胞接种于ACCT培养基中2 在100 mm或35 mm的层粘连蛋白包被的塑料培养皿，或预先包被层粘连蛋白（1 μg/cm²）的40 × 22 mm玻璃盖玻片上2）。1小时后，用2.0 ml ACCT洗涤培养皿，去除未贴壁的细胞。加入10.0 ml新鲜培养基，继续培养细胞。
2. 人气道上皮基底细胞的分化气液界面（ALI）培养
- 根据机构审查委员会批准的方案，从国家疾病研究互换组织获取人支气管组织。采用已发表的方法5,6进行细胞分离与培养。该方法使用细胞培养，因其为人吸入毒性化合物（TICs）暴露的精确模型；但如有需要，也可分离并培养小鼠和/或大鼠气道上皮细胞于气液界面（ALI）条件下7,8。
- 简言之，在去除所有结缔组织和淋巴结后，将组织切成小块（约¼英寸）。用乳酸林格液多次清洗组织。将组织加入50 ml圆锥形离心管中，并加入蛋白酶溶液（1% 蛋白酶/0.01% DNase溶于最低必需培养基MEM中，组织与液体比例为1:10）。
- 在4 °C下振荡组织过夜。加入10%胎牛血清以终止组织解离。用外科手术刀刮取上皮表面，通过离心（2,000 rpm，10分钟）收集细胞。
- 将第一代细胞接种于经胶原蛋白包被的Snapwell小室中，使用Fulcher et al9所详细描述的特殊ALI培养基进行培养。培养5天后，通过移除顶端培养基，转换为气液 界面（ALI）培养。
- 每隔一天使用ALI培养基对细胞进行换液，并继续培养2-3周以诱导细胞分化（可见大量摆动的纤毛及黏液分泌），随后进行暴露实验。在更换培养基的同时，用预温的PBS清洗顶端表面。
3. 氯气暴露
- 将氯暴露系统（CES）置于合格的化学通风柜内，通风柜的面风速应为100 fpm，以提供必要的二级密闭防护，防止在发生意外氯气泄漏时对人员造成暴露。
- 在轻微正压（0.5英寸水柱）下运行系统。以15 L/min的流速通入干燥空气，并输入适当浓度的氯气，以达到所需的最终氯浓度。暴露室配备带4个微型BCU锁的锁定盖和低硬度硅胶垫圈，以实现压力密封。
- 通过质量流量控制器输送Cl2混合气体。CES使用含有1.0% Cl2的干燥氮气压缩气瓶作为氯气源。
- 使用定制设计的控制面板调节稀释空气流量，并同样调节输送至暴露室的Cl2浓度。低流量采样泵将暴露室的尾气抽入氯气分析仪，以监测浓度，数据经由连接至分析仪的数据记录仪进行记录。
- 在暴露前使用流量计测量暴露室内的流速，以确保送风与排风速率相等。
- 暴露前准备细胞培养物：移除上清培养基，并加入新鲜培养基（在ALI培养中为基底侧培养基）。此时可进行任何试剂的预处理操作。
- 将气道上皮细胞的ALI培养物暴露于两个密闭的聚砜生物密闭室中的Cl2气体（50、100或300 ppm，持续30分钟）。心肌细胞（浸没式或膜上融合培养）则暴露于50或100 ppm的Cl2中，持续15分钟。
- 暴露结束后，用空气冲洗暴露室，直至Cl2浓度降至1 ppm以下，方可安全打开腔室取出细胞（在5分钟内完成）。
4. 跨上皮电阻（TER）测量
- 使用带有氯化银“筷子式”电极的上皮细胞伏特计，测量气液界面（ALI）培养物的经上皮电阻（TER）。
- 使用前将筷子式电极在ALI培养基中平衡15分钟 。
- 向顶端（1.0 ml）和基底外侧（2.0 ml）加入温热的培养基，并使用伏特计的筷子式电极测量TER。
- 将电极的短臂浸入顶端培养基，长臂浸入基底外侧培养基。点击伏特计上的“测量”按钮以评估电阻力。
- 伏特计可选择以欧姆（ohms）或千欧姆（k ohms）为单位进行测量。从每个细胞层测得的电阻值中减去无细胞培养支持物的电阻值，得到经上皮电阻（TER）。
5. Caspase 活性检测
- 暴露后向基底外侧表面加入新鲜的ALI培养基（2.0 ml），在室温下孵育细胞。于4小时和24小时收集上清液。
- 使用商用的caspase 3/7检测试剂盒测定培养基上清液中caspase 3/7的活性。
6. 蛋白质印迹与免疫细胞化学
- 使用细胞裂解液进行 Western 印迹，方法如前所述10。将蛋白裂解液（20 μg）悬浮于 5 倍还原上样缓冲液中，煮沸 5 分钟。将蛋白裂解液进行 SDS-PAGE（4–15%）电泳，并通过电转移法将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。
- 用含 5% 脱脂奶粉的洗涤缓冲液（PBS + 0.1% 去垢剂）孵育膜以封闭非特异性结合位点，然后在 4 °C 下以 1:1,000 稀释度加入针对 SERCA2 或肌节肌动蛋白的一抗，孵育过夜。随后洗涤膜，并加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，使用商业化的过氧化物酶检测试剂盒按之前所述方法显影检测10。
- 对于免疫细胞化学实验，在 6 孔板中生长于插入膜或玻璃盖玻片上的活细胞经 PBS 漂洗后，用含 0.4% Triton-X-100 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液处理 20 分钟 。
- 用 5% 驴血清处理细胞 20 分钟以封闭非特异性结合，然后加入非特异性 IgG 或特异性针对肌节肌动蛋白或 Ki-67 的一抗孵育细胞。
- 用 PBS 洗涤细胞，然后加入荧光标记的二抗以检测一抗，并加入核染料（1 μg/ml DAPI）进行染色。
- 用 PBS 洗涤后，使用商业封片介质封固盖玻片。
- 使用荧光显微镜观察染色结果。
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结果
原代杆状心肌细胞附着在层粘连蛋白基质上，并铺展分化形成融合的细胞培养层（图1A 及其插图）。这些细胞进一步通过肌节肌动蛋白和SERCA2的表达进行表征（图1B 和 图1C）。大鼠心肌细胞对氯毒性高度敏感，暴露于100 ppm氯气15分钟后，浸没培养中的细胞出现广泛的变圆和死亡现象，而在涂有层粘连蛋白的膜上生长的细胞融合层也发生破坏（图1D）。此外，在插入式培养膜上生长的心肌细胞中，caspase 3/7的释放增加，表明凋亡性细胞死亡增强（图1E）。
暴露分化的原代人呼吸道上皮（图2，插图显示细胞培养小室的横截面，其中含有柱状细胞、纤毛细胞和杯状细胞）暴露于低浓度（100 ppm）和高浓度（300 ppm）氯后，均出现细胞膜脱落和剥离现象（图2 图A2和A3）。低浓度氯引起的损伤可迅速逆转（图2 图A5），然而，暴露...
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讨论
最常见的急性中毒暴露类型是将有毒化学物质吸入肺部。这些化学物质还可能迅速被血液吸收，进而影响脑、心脏等其他器官。尽管已有大量利用动物模型对多种物质的吸入毒性进行的研究和报道，但其作用机制仍不甚明确，这成为开发有效疗法的主要障碍。缺乏 体外 暴露系统是导致缺乏机制性认识的主要原因。本文介绍了用于研究吸入性有毒化学物质（如氯气暴露）对心肌和呼吸道影响的细胞培养模型。氯气会迅速与水性表面反应，生成盐酸和次氯酸3,11,12氯还可与活性氧（ROS）结合，生成高活性化合物，可能导致气道表面关键蛋白质和酶的氧化13使用浸没培养的研究可能仅能展示氯气等物质在水溶液中产生的副产物（如次氯酸，HOCl）的作用，而非氯气本身的效果。本文所述的人气道上皮细胞在气液界面（ALI）分化培养模型的暴露实验，可实现有毒工业化学品（如氯气）与细胞表面直接相互作用的研究，且无需水相介质，更接近真实暴露情况。 体内.
我们还利用原代大鼠心肌细胞描述了氯暴露会导致浸没培养条件下的细胞迅速死亡。这些细胞由于无法极化并形成紧密连接，因此不能在气...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）反伤害计划（CounterACT Program）、院长办公室以及国家环境卫生科学研究所（NIEHS）资助，项目编号为 U54 ES015678（CWW）。SA 还获得了科罗拉多儿童医院与科罗拉多矿业学院合作试点奖（#G0100394）以及科罗拉多儿童医院研究所试点奖（#G0100471）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠 | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| 氯气 | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 检测试剂盒 | Promega | G8091 | |
| 上皮细胞伏特欧姆计及夹式电极 | World Precision Instruments | EVOM 和 STX2 | |
| Snapwell 嵌插小室 | Corning | 07-200-708 | |
| 70 微米尼龙细胞筛 | Corning | #352360 | |
| 聚砜生物防护舱 | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| 肌节肌动蛋白抗体 | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 抗体 | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 抗体 | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488 标记的二抗 | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 肉碱 | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| 牛磺酸 | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| 肌酐 | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs-Ringer 缓冲液 | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| 蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 胶原酶 | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| 脱氧核糖核酸酶（DNAase） | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| 乳酸林格氏液 | Abott Laboratories | 7953 | |
| 驴血清 | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4–15% SDS-PAGE 凝胶 | Bio-Rad | 456-1083 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 162-0115 | |
| 去垢剂 Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 过氧化物酶检测试剂盒 | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 封片剂 Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| 柠檬酸钠 | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| 胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| 层粘连蛋白 | BD biosciences | 354259 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15070063 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 200-6140AJ |
参考文献
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