线性扩增介导的PCR - 未知侧翼DNA的遗传物质和表征本地化

Summary

线性扩增介导的（LAM）-PCR方法是开发，以确定基因组中的整合型病毒载体的精确位置的方法。该技术已经发展成为学习中的基因治疗的患者中，新颖的矢量技术，T-细胞的多样性，癌症干细胞模型等生物安全克隆动力学的优越方法

Abstract

线性扩增介导的 PCR （LAM-PCR） 已被开发用于研究接受基因治疗与整合载体系统治疗的患者的基因校正细胞中的造血功能。由于逆转录病毒载体的稳定整合，整合位点可用于研究单个细胞及其后代的克隆命运。LAM-PCR 首次提供了证据，证明基因治疗患者中的白血病起源于前病毒诱导的邻近原癌基因的过表达。与反向 PCR 和连接介导 （LM）-PCR 等现有方法相比，LAM-PCR 的高灵敏度和特异性是通过初始预扩增步骤（100 个循环的线性 PCR）实现的，使用生物素化载体特异性引物，允许在固相（磁珠）上进行后续反应步骤。LAM-PCR 是目前可用于识别位于已知 DNA 附近的未知 DNA 的最灵敏方法。最近，已经开发了一种 LAM-PCR 变体，它绕过了限制性消化，从而消除了整合位点的检索偏倚，并能够对宿主基因组中的前病毒位置进行全面分析。以下实验步骤逐步解释了与整合的慢病毒载体相邻的 3'- 和 5'- 序列的扩增。

Introduction

线性扩增介导的PCR（LAM-PCR）技术可识别和表征邻近任何来源的已知的DNA未知侧翼的DNA。更具体地，LAM-PCR方法已经开发出来，定位病毒载体整合位点（IS）宿主基因组^1,2内。像逆转录病毒或转座子的遗传元件整合自己的基因组入在一个（半）随机方式^3-6宿主基因组中。在许多情况下，它是决定性的确切地知道这些矢量一体化的立场。 LAM-PCR方法已被证明是优于像连接介导的PCR ⁷和它的变体或反向PCR ⁸的替代技术。该方法的灵敏度和鲁棒性源自载体基因组结和磁性选择的扩增的PCR产物的初始预扩增。像提到的替代方法，LAM-PCR依赖于使用限制性内切酶，引入偏差为^9-11的检索能力。因此，可以在一个反应中检测出的IS剧目（在integrome）的一个子集。这种偏差是通过使用限制性内切酶⁹的合适组合的给定样品的平行分析最小化。最近，该技术的一个变种称为非限制性的LAM-PCR（nrLAM-PCR）已经开发出来，绕过使用限制性内切酶，并允许在单个反应^9,12的样品的无偏的全基因组分析。

在过去，LAM-PCR方法已被用于鉴定致病逆转录病毒IS白血病引起在少数患者中的临床基因治疗试验^13-15。从那时起，LAM-PCR已被改编以确定从其它整合载体（慢病毒载体，转座子）和还识别的被动结合像腺相关载体（AAV）或整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLV）载体的集成模式IS ^{16 -21。} LAM-PCR方法的应用是广泛的传播：传统LY，该技术被广泛地用于研究基因修饰的细胞的克隆性组合物中已经历基因疗法的患者或解开他们的整合行为^15,16,22-24评估新型载体系统的生物安全。近日，LAM-PCR启用确定特异性和脱靶设计师核酸酶的活性由IDLV诱捕法^25。

此外，LAM-PCR方法可以非常方便地跟随转导的细胞的命运随着时间的推移在一个有机体。这允许识别原癌基因以及肿瘤抑制基因和还研究造血或癌症干细胞生物^26-28。最后但并非最不重要的，LAM-PCR法适于研究T细胞受体多样性的人类^29（和未公布的数据）。

该技术的固有功率是由所述方法连接到深度测序技术，使表征百万未知侧翼DNA的单核苷酸Ř增强esolution在整个基因组。在下面的协议中，我们描述了一步一步的扩增和鉴定未知侧翼DNA的模范，以确定慢病毒载体IS的。在协议中使用的寡核苷酸列于表1。提取的DNA的任何来源的或cDNA可以用作用于LAM-PCR和nrLAM-PCR的DNA模板。

Protocol

链接器的磁带1。准备（LC）

1. 混合40微升LC1寡核苷酸（ 表1），40微升LC2寡核苷酸（ 表1中 ，用适当的限制性内切酶悬），110微升Tris-盐酸（100毫米，pH值7.5），和10微升250毫摩尔MgCl ₂组成。
2. 孵育在95℃下5分钟，让反应冷却下来慢慢至室温。加入300微升H ₂ O和集中dsLinker-DNA在离心过滤器。加入80微升H _{2 O}至洗出液和分装10微升的准备盒式连接器在0.2 PCR管。

载体基因组结2。前置放大

1. 对于每个待分析样品制备50μl的PCR反应。
   1. 确定DNA样品的浓度。移液器x微升DNA插入0.2 ml的PCR管（1-1000纳克的LAM/100-1，000毫微克的nrLAM）。的DNA的量应该等于在每个样品，并在然GE的0.5至25微升。
   2. 如表2中所述制备PCR主混合物混合（50 - x）的微升主混合物用在0.2ml PCR管中各DNA样品。
2. 使用例示于表2中的PCR条件。PCR完成后Preamplify载体基因组结微升Taq酶添加0.5到每个PCR管中，然后重新运行PCR程序。 PCR产物可被储存在4℃下4天或长期于-20℃。

PCR产物的3。磁选

1. 磁珠的制备
   1. 移液管20微升（200微克）的链亲和素包被的磁珠到1.5ml试管并暴露，以磁性颗粒分离器（MPS），在室温下放置1分钟。弃上清液。
   2. 从MPS除去管，重悬磁珠在40微升PSB / 0.1％BSA（pH 7.5）中。暴露在MPS 1分钟，弃上清。一旦重复此步骤。
   3. 洗珠无线第20微升的3M氯化锂溶液（3M氯化锂，10毫米的Tris-HCl，1 mM EDTA）中暴露于MPS 1分钟，弃上清。重悬珠在50μl6M的氯化锂溶液（6M的LiCl，10mM的Tris-盐酸，1mM EDTA）中。
2. 混合来自步骤2.2与50微升制备的磁珠整个PCR反应。孵育在水平振荡器上（转速300rpm）至少2​​小时，在室温下进行。这个步骤可让生物素化的PCR产物链霉包被的磁珠（DNA-珠复合物）的结合。 DNA的磁珠复合物可以在摇床上过夜孵育，或储存在4℃下4天。
3. 暴露的DNA-珠复合体的MPS，在室温下放置1分钟，除去上清，重悬DNA-珠复合于100μlH ₂ O。立即着手与LAM或nrLAM第5步第4步。

4，LAM-手续

1. 双链DNA（dsDNA）的合成（林只）
   1. 暴露的DNA-珠复杂步骤3.3至总薪级第1分钟和DIS卡上清液。加入8.25微升H ₂ O，1微升10X六核苷酸缓冲液，0.25μL的dNTP（10毫米）和0.5微升（2学分）Klenow聚合酶。在37℃下1小时。
   2. 加入90微升H ₂ O和暴露在MPS 1分钟。弃上清，重悬DNA-珠复杂的100微升H ₂ O
2. 限制文摘
   1. 暴露的DNA-珠复杂，MPS 1分钟，弃上清。加入8.5微升H ₂ O，1微升10X限制性内切酶缓冲液和0.5μL限制性内切酶和孵化1小时反应。重复步骤4.1.2。
      注意：孵育反应物在所建议的限制酶的制造商的温度。确保有内没有限制性位点存在，或在感兴趣的DNA用于预扩增的引物结合位点的下游。对于所选择的合适的限制性内切酶/限制性内切酶的组合是指^9。
3. DS结扎链接器（LK）
   1. 暴露的DNA-珠复杂，MPS 1分钟，弃上清。加入5微升H ₂ O，1微升10X FastLink缓冲液，1微升ATP（10毫米），从步骤1.2 2微升连接器卡带，和1微升快速连接DNA连接酶（2 U /μL）。在室温下孵育5分钟。重复步骤4.1.2。
4. 合成的双链DNA变性
   1. 暴露的DNA-珠复杂，MPS 1分钟，弃上清。重悬DNA-珠复杂的5微升0.1N NaOH中。孵育5分钟，在室温下在水平摇动器。
   2. 暴露的DNA-珠复合体的MPS为1分钟，并收集上清液含于新的1.5毫升管预扩增载体基因组的交界处。立即在-20°C进行第6步或存储上清液

5，nrLAM-手续

1. 单链连接器的连接（SSLC）（nrLAM只）
   1. 暴露的DNA-珠复杂步骤3.3至公安部1分钟，弃上清。加入6.5微升H ₂ O，1微升CircLigase 10X反应缓冲液，0.5μL的MnCl _2（50毫米），0.5微升ATP（1毫米），1微升ssLinker寡核苷酸和0.5微升CircLigase（100 U /μL）。孵育在60℃下1小时。
   2. 加入90微升H ₂ O和暴露在MPS 1分钟。弃上清，洗DNA-珠复杂的100微升H ₂ O再次暴露在MPS 1分钟，弃上清，重悬DNA-珠复杂的10微升H ₂ O

6，指数扩增我

1. 对于每个待分析样品制备50μl的PCR反应。
   1. 吸取2μL模板DNA（从步骤4.4.2（LAM）或5.1.2（nrLAM））到0.2 ml的PCR管。
   2. 制备PCR主混合物如表3所述。加入48μl反应混合液到每个样品从步骤6.1.1和通过PCR扩增的天气下载体基因组结纳秒列举于表3。PCR产物可以被储存在4℃下4天或长期于-20℃。

PCR产物7。磁分离

1. 制备磁珠所例示的步骤3.1.1 - 3.1.3。重悬珠在20μl（对于LAM）或6米的LiCl溶液（6M的LiCl，10mM的Tris-盐酸，1mM EDTA）中加入50μl（对于nrLAM）。混合20微升（LAM）或从步骤6.1.2 PCR反应以制备的磁性小珠（步骤7.1）的50微升（nrLAM）孵育在水平振荡器上（转速300rpm）搅拌2小时，在室温下。 DNA的磁珠复合物可以在摇床上过夜孵育，或储存在4℃下4天。
2. 暴露的DNA-珠复合体的MPS为1分钟，除去上清，重悬DNA-珠复合于100μlH ₂ O。暴露的DNA-珠复杂，MPS 1分钟，弃上清。
3. 重悬DNA-珠复杂的20微升（LAM）或5微升（nrLAM）0.1N氢氧化钠。培育大怒，在室温下在水平摇床10分钟，暴露在MPS 1分钟，并收集在新的1.5 ml管扩增含DNA的上清液。立即在-20°C继续执行步骤8.1或存储上清液

8，指数扩增二

1. 对于每个待分析样品制备50μl的PCR反应。
   1. 移液管加入2μl模板DNA（来自步骤7.3）到0.2 ml的PCR管中。
   2. 制备PCR主混合物，如表4所述。加入48μl反应混合液到每个样品从步骤8.1.1并通过举例说明在表4中的PCR条件扩增载体基因组结点。PCR产物可以被储存在4℃下进行长达4在-20℃天或长期
2. 可视化（NR）LAM-PCR产物，负载10微升的PCR产物从2％琼脂糖凝胶步8.1.2。如果带不可见，分析10微升的LAM-PCR产物的高分辨率凝胶。注意：逸hidium溴化物是致突变物。工作很认真，总是穿戴适当的手套。

9。用于制备高通量测序

1. 的（NR）LAM-PCR产物纯化
   1. 从步骤8.1.2用44μL室温AMPure XP的磁珠混合40微升的PCR产物。孵育5分钟，在室温下暴露于MPS额外的2分钟。
   2. 弃上清，用200μl70％乙醇洗两次在MPS。
   3. 弃上清，重悬DNA-珠复杂的30微升H ₂ O孵育1分钟，上清液转移至新鲜0.2毫升管。确定纯化的DNA的浓度。
2. Fusionprimer PCR加测序专用适配器。
   1. 对于每个待分析样品制备50μl的PCR反应。
   2. 移液器x微升（40毫微克）的DNA为0.2 ml的PCR管。的DNA的量应该等于在每个样品和在0.5至25微升的范围内。
   3. 制备PCR主混合物，如表5中所述添加（50 - x）的μl反应混合液到每个样品从步骤9.2.2和通过列举在表5中的PCR产物的PCR条件引入测序适配器（NR）LAM-PCR产物。可以被保存在4℃下4天或长期在-20℃下
   4. 形象化Fusionprimer-PCR产物负载10微升的PCR产物从2％琼脂糖凝胶步骤9.2.3。 9.1.3 - 按照步骤9.1.1中所述净化剩余的PCR产物。从自动高分辨率电泳设备准确量化的Fusionprimer-PCR产物的浓度和片段大小的步骤9.4分析1微升纯化PCR产物。

Results

LAM-PCR结果在载体基因组路口放大与定义的片段大小为每个结。个体的PCR片段的大小取决于在基因组中的已知的DNA的位置与最近的限制性内切酶识别位点之间的距离。这允许通过凝胶电泳， 例如可视化扩增结的多样性分析的样品中。如果只有单一的（单克隆），几个（寡克隆）或多个（多克隆）频带上存在的凝胶。 LAM-PCR的结果，最好是由高分辨率凝胶电泳（ 图2A）被观看，但也可以在2％琼脂糖凝胶（ 图2B）可视化。 nrLAM-PCR结果以各种长度为每个单独的连接点的PCR片段。因而单克隆，寡克隆或多克隆的样品显示为涂片通过电泳，并且不能在视觉上区分开来。可视化nrLAM-PCR产物在2％琼脂糖凝胶足以确定SUC塞斯协议（ 图2C）的。测序后，将回收的基因组DNA可以被对准到各自的宿主基因组中，以确定载体（ 图3A）的位置的准确位置。的基因组注释允许分析IS剧目像偏爱融入基因的编码区（ 图3B）或靠近转录起始位点（ 图3C）不...

Discussion

在LAM-PCR技术允许识别侧翼已知的DNA区域未知的DNA序列。因为高灵敏度从具有特异性的引物杂交的已知DNA序列中的结的预扩增得到的，能够扩增并检测甚至罕见路口下至单个细胞水平。相反，在多克隆情况LAM-PCR能够扩增数千种不同的结在一个单一的反应。

然而，由于使用了限制性内切酶的integrome只有一个子部分可以由LAM-PCR检测结与每一个特定的限制性内切酶的存在下进行分析。因此，对于不同的酶对同一样品重复分析，建议^9。如果没有LAM-PCR扩增子存在于凝胶，最有可能是已知的DNA片段的位置和所选择的限制性内切酶的最接近的识别位点之间的距离过大而导致LAM-PCR产物^9，在这种情况下其它的酶应当用于扩增的交界处。

nrLAM是独立使用限制性内切酶，因此代表了非常有价值的方法来全面表征侧翼序列已知的DNA序列。省略从协议的结果中的特定的限制性片段长度多态性表征每个扩增的​​交界处的损失的限制性消化。不是每扩增结是由导致电泳，独立的放大路口的多样性后涂抹于凝胶不同大小的PCR...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA 聚合酶	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	可使用
PCR 缓冲液	Qiagen	201203	建议使用该缓冲液
dNTP 混合物	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	或任何其他 dNTP 寡
核苷酸（引物）	MWG Biotech		HPLC 纯化
的 DynabeadsM-280 链霉亲和素	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% 重量/体积 BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl （pH 7.5）/1 mM EDTA
Tris-HCl，pH 7.5	USB 公司	22637	或任何其他供应商
EDTA	Applichem	A1103,0250	或任何其他供应商
、Klenow 聚合酶	Roche Diagnostics	10104523001
六核苷酸混合物	Roche Diagnostics	11277081001
限制性核酸内切酶	、NEB		或任何其他供应商
Fast-Link DNA 连接试剂盒	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA 连接酶试剂盒	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	或任何其他供应商
琼脂糖 LE	Roche Diagnostics	11685660001	或任何其他供应商
TBE 缓冲液	Amresco	0658	或任何其他供应商
溴化乙锭	Applichem	A2273,0005	溴化乙锭是诱变
100 bp DNA 分子量标准	Invitrogen	15628-050	或任何其他 DNA 分子量标准
20 mM NaCl，Sigma-Aldrich		71393-1L	或任何其他供应商
Magna-Sep 磁珠分离器	Life Technologies	K158501	适用于 1.5 ml 试管
Magna-Sep 磁珠分离器	Life Technologies	K158696	适用于 96 孔板
Amicon Ultra-0.5、Ultracel-30 膜	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	或其他电泳系统
TProfessional 96	Biometra	050-551	或其他 用于 96 孔板的热循环仪
轨道摇床 KS 260 basic	IKA	2980200	或其他水平摇床
PCR 软管 0.2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	或其他 0.2 ml PCR 管
1.5 ml 管	Eppendorf	12682	或其他 1.5 ml 管
凝胶成像系统	PeqLab		或任何其他凝胶成像系统
Nanodrop ND-1000 分光光度计	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 预制胶	Elchrom Scientific	3497
浸没式凝胶电泳仪 SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 电泳生物分析仪	Agilent Technologies	G2939AA