线性扩增介导PCR——遗传元件的定位与未知侧翼DNA的表征

摘要

线性扩增介导（LAM）-PCR 是一种用于确定整合性病毒载体在基因组中精确位置的方法。该技术已发展成为研究基因治疗患者克隆动态、新型载体技术的生物安全性、T细胞多样性、肿瘤干细胞模型等领域的优越方法。

摘要

线性扩增介导的PCR（LAM-PCR）已开发用于研究接受整合型载体系统基因治疗患者的基因校正细胞中的造血过程。由于逆转录病毒载体能够稳定整合，其整合位点可用于追踪单个细胞及其子代细胞的克隆命运。LAM-PCR首次提供了证据，表明接受基因治疗的患者所发生的白血病源于前病毒插入导致邻近原癌基因的过表达。与现有的逆向PCR和连接介导（LM）-PCR等方法相比，LAM-PCR具有更高的灵敏度和特异性，其关键在于初始的预扩增步骤（使用生物素标记的载体特异性引物进行100个循环的线性PCR），从而使后续反应步骤可在固相（磁珠）上进行。目前，LAM-PCR是鉴定整合位点最灵敏的方法 位于已知DNA附近的未知DNA。最近，一种改良的LAM-PCR技术被开发出来，该方法无需限制性酶切，从而避免了整合位点捕获过程中的偏好性偏差，能够对前病毒在宿主基因组中的位置进行全面分析。以下方案逐步说明了如何扩增整合型慢病毒载体两侧的3’和5’侧翼序列。

引言

线性扩增介导的PCR（LAM-PCR）可用于鉴定和表征任何来源的已知DNA旁侧的未知DNA序列。更具体而言，LAM-PCR最初被开发用于定位病毒载体在宿主基因组中的整合位点（IS）^1,2。诸如逆转录病毒或转座子之类的遗传元件会以（半）随机的方式将其基因组整合到宿主基因组中^3-6。在许多情况下，精确了解这些载体的整合位置至关重要。LAM-PCR已被证明优于其他替代技术，如连接介导的PCR⁷及其变体或反向PCR⁸。该方法的高灵敏度和稳健性源于对载体-基因组连接区域的初始预扩增以及对扩增PCR产物的磁珠筛选。与上述替代方法类似，LAM-PCR依赖于限制性内切酶的使用，这会引入对整合位点（IS）检测能力的偏倚^9-11。因此，在单次反应中仅能检测到整合位点库（integrome）的一个子集。通过使用最佳组合的限制性内切酶对同一样本进行平行分析，可将这种偏倚降至最低⁹。最近，已开发出一种称为非限制性LAM-PCR（nrLAM-PCR）的技术变体，该方法规避了限制性内切酶的使用，能够在单次反应中实现对样本的无偏倚全基因组分析^9,12。

过去，LAM-PCR 已被用于鉴定在少数接受基因治疗临床试验的患者中引发白血病的致病性逆转录病毒插入位点（IS）^13-15。此后，LAM-PCR 已被改进，可用于鉴定其他整合型载体（如慢病毒载体、转座子）的插入位点，也可用于分析被动整合型载体（如腺相关病毒载体（AAV）或整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLV））的整合模式^16-21。LAM-PCR 的应用范围广泛：传统上，该技术被广泛用于研究接受基因治疗患者的基因修饰细胞的克隆组成，或通过解析新型载体系统的整合行为来评估其生物安全性^15,16,22-24。最近，LAM-PCR 还通过 IDLV 捕获实验实现了对设计核酸酶的特异性及脱靶活性的测定²⁵。

此外，LAM-PCR 可用于在生物体内长期追踪转导细胞的命运。这使得研究人员能够鉴定原癌基因和肿瘤抑制基因，同时也有助于研究造血过程或癌症干细胞生物学^26-28。最后但同样重要的是，LAM-PCR 已被改进用于研究人类T细胞受体的多样性²⁹（以及未发表数据）。

通过将该方法与深度测序技术相结合，能够以单核苷酸分辨率对全基因组中数百万条未知侧翼DNA进行表征，从而增强了该技术的内在能力。在以下实验方案中，我们以鉴定慢病毒载体插入位点（IS）为例，逐步描述侧翼未知DNA的扩增与鉴定过程。本方案中所用的寡核苷酸列于表1中。任何来源的提取DNA或cDNA均可作为LAM-PCR和nrLAM-PCR的DNA模板。

方案

1. 连接子盒（LC）的制备

1. 取40 µl LC1 寡核苷酸（表1）、40 µl LC2 寡核苷酸（表1，需带有合适的限制性内切酶突出末端）、110 µl Tris-HCl (100 mM, pH 7.5) 和 10 µl 250 mM MgCl₂，混合均匀。
2. 在95 °C孵育5分钟，随后让反应体系缓慢冷却至室温。加入300 µl H₂O，并使用离心过滤装置浓缩双链连接子DNA。向洗脱液中加入80 µl H₂O，将制备好的连接子片段分装至0.2 ml PCR管中，每管10 µl。

2. 载体基因组连接处的预扩增

1. 针对每个待分析样本，配制50 µl的PCR反应体系。
   1. 测定DNA样本的浓度。将x µl（LAM为1–1,000 ng，nrLAM为100–1,000 ng）的DNA加入0.2 ml PCR管中。每个样本的DNA体积应相等，且在0.5至25 µl范围内。
   2. 按照表2所述配制PCR预混液。将(50 - x) µl预混液与每个DNA样本在0.2 ml PCR管中混合。
2. 采用表2所示的PCR条件对载体基因组连接区域进行预扩增。PCR完成后，向每个PCR管中加入0.5 µl Taq聚合酶，并重新运行PCR程序。PCR产物可在4 °C保存最多4天，或在-20 °C长期保存。

3. PCR 产物的磁珠分离

1. 磁性 beads 的制备
   1. 将 20 µl（200 µg）链霉亲和素包被的磁性 beads 用移液器转移至 1.5 ml 离心管中，室温下置于磁性粒子分离器（MPS）上 1 分钟。弃去上清液。
   2. 将离心管从 MPS 上取下，用 40 µl PSB/0.1% BSA（pH 7.5）重悬磁性 beads。再次置于 MPS 上 1 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
   3. 用 20 µl 3 M LiCl 溶液（3 M LiCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA）洗涤 beads，置于 MPS 上 1 分钟，弃去上清液。将 beads 重悬于 50 µl 6 M LiCl 溶液（6 M LiCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA）中。
2. 将步骤 2.2 的全部 PCR 反应产物与 50 µl 制备好的磁性 beads 混合。在水平摇床（300 rpm）上室温孵育至少 2 小时。此步骤可使生物素标记的 PCR 产物与链霉亲和素包被的 beads 结合（DNA-beads 复合物）。DNA-beads 复合物可在摇床上继续孵育过夜，或在 4 °C 保存最多 4 天。
3. 将 DNA-beads 复合物置于 MPS 上 1 分钟（室温），移除上清液，用 100 µl H₂O 重悬 DNA-beads 复合物。立即进行 LAM 的第 4 步或 nrLAM 的第 5 步。

4. LAM-操作步骤

1. 双链DNA（dsDNA）合成（仅限LAM）
   1. 将第3.3步得到的DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，弃去上清液。加入8.25 µl H₂O、1 µl 10x六核苷酸缓冲液、0.25 µl dNTPs（10 mM）和0.5 µl（2 U）Klenow聚合酶。37 °C孵育1小时。
   2. 加入90 µl H₂O，暴露于MPS中1分钟。弃去上清液，将DNA-磁珠复合物重悬于100 µl H₂O中。
2. 限制性酶切
   1. 将DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，弃去上清液。加入8.5 µl H₂O、1 µl 10x限制性内切酶缓冲液和0.5 µl限制性内切酶，反应孵育1小时。重复步骤4.1.2。
      注：应根据所用限制性内切酶制造商推荐的温度进行孵育。确保在目标DNA中用于预扩增的引物结合位点内部或下游不存在该限制性内切酶的识别位点。有关合适限制性内切酶或限制性内切酶组合的选择，请参见⁹。
3. 双链连接子连接（LK）
   1. 将DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，弃去上清液。加入5 µl H₂O、1 µl 10x FastLink缓冲液、1 µl ATP（10 mM）、2 µl 第1.2步制备的连接子载体，以及1 µl Fast-Link DNA连接酶（2 U/µl）。室温孵育5分钟。重复步骤4.1.2。
4. 合成dsDNA的变性
   1. 将DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，弃去上清液。将DNA-磁珠复合物重悬于5 µl 0.1 N NaOH中。在水平摇床上室温孵育5分钟。
   2. 将DNA-磁珠复合物暴露于MPS中1分钟，收集含有预扩增载体-基因组连接区的上清液至新的1.5 ml离心管中。立即进行第6步操作，或在-20 °C保存上清液。

5. nrLAM 操作步骤

1. 单链连接子（ssLC）连接（仅限 nrLAM）
   1. 将步骤 3.3 中的 DNA-磁珠复合物暴露于 MPS 1 分钟，弃去上清液。加入 6.5 µl H₂O、1 µl CircLigase 10x 反应缓冲液、0.5 µl MnCl₂（50 mM）、0.5 µl ATP（1 mM）、1 µl ssLinker 寡核苷酸和 0.5 µl CircLigase（100 U/µl）。在 60 °C 下孵育 1 小时。
   2. 加入 90 µl H₂O，暴露于 MPS 1 分钟。弃去上清液，用 100 µl H₂O 洗涤 DNA-磁珠复合物。再次暴露于 MPS 1 分钟，弃去上清液，并将 DNA-磁珠复合物重悬于 10 µl H₂O 中。

6. 指数扩增 I

1. 针对每个待分析样本，配制50 µl的PCR反应体系。
   1. 用移液器将2 µl模板DNA（来自步骤4.4.2（LAM）或5.1.2（nrLAM））加入0.2 ml的PCR管中。
   2. 按照表3所述配制PCR预混液。将48 µl预混液加入步骤6.1.1的每个样本中，并按照表3所示的PCR条件扩增载体基因组连接区域。PCR产物可于4 °C保存最多4天，或长期保存于-20 °C。

7. PCR 产物的磁性分离

1. 按照步骤 3.1.1 - 3.1.3 所示方法制备磁珠。将磁珠重悬于 20 µl（用于 LAM）或 50 µl（用于 nrLAM）的 6 M LiCl 溶液（6 M LiCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA）中。将步骤 6.1.2 中得到的 20 µl（LAM）或 50 µl（nrLAM）PCR 反应产物与已制备的磁珠（步骤 7.1）混合，在水平摇床上室温孵育 2 小时（300 rpm）。DNA-磁珠复合物可继续在摇床上过夜孵育，或在 4 °C 保存最多 4 天。
2. 将 DNA-磁珠复合物置于磁力架上 1 分钟，移除上清液，再将 DNA-磁珠复合物重悬于 100 µl H₂O 中。再次置于磁力架上 1 分钟，弃去上清液。
3. 将 DNA-磁珠复合物重悬于 20 µl（LAM）或 5 µl（nrLAM）的 0.1 N NaOH 溶液中。在水平摇床上室温孵育 10 分钟，置于磁力架上 1 分钟，收集含有扩增 DNA 的上清液至新的 1.5 ml 离心管中。立即进行步骤 8.1，或将上清液在 -20 °C 保存。

8. 指数扩增 II

1. 针对每个待分析的样本，准备一个50 µl的PCR反应体系。
   1. 将2 µl模板DNA（来自步骤7.3）移液至一个0.2 ml的PCR管中。
   2. 按照表4所述配制PCR预混液。将48 µl预混液加入步骤8.1.1中的每个样本，并按照表4所示的PCR条件扩增载体基因组连接区域。PCR产物可在4 °C保存最多4天，或在-20 °C长期保存。
2. 为观察（nr）LAM-PCR产物，取步骤8.1.2中得到的10 µl PCR产物上样至2%琼脂糖凝胶。若条带可见，则将10 µl LAM-PCR产物上样至高分辨率凝胶进行分析。注意：溴化乙锭具有诱变性。操作时务必格外小心，并始终佩戴合适的手套。

9. 高通量测序的准备工作

1. （nr）LAM-PCR 产物的纯化
   1. 取 8.1.2 步骤中的 40 µl PCR 产物，与 44 µl 室温的 AMPure XP 磁珠混合。室温孵育 5 分钟，再置于磁力架（MPS）上静置 2 分钟。
   2. 弃去上清液，在磁力架（MPS）上用 200 µl 70% 乙醇洗涤两次。
   3. 弃去上清液，将 DNA-磁珠复合物重悬于 30 µl H₂O 中。孵育 1 分钟后，将上清液转移至新的 0.2 ml 离心管中。测定纯化后 DNA 的浓度。
2. 融合引物 PCR 扩增以添加测序专用接头。
   1. 针对每个待分析的样本，准备一个 50 µl 的 PCR 反应体系。
   2. 用移液器将 x µl（40 ng）DNA 加入 0.2 ml PCR 管中。每个样本中加入的 DNA 体积应相等，且在 0.5 至 25 µl 范围内。
   3. 按照表 5 中所述配制 PCR 主混合液。将 (50 - x) µl 主混合液加入 9.2.2 步骤中的每个样本，并通过如表 5所示的 PCR 条件，在 (nr)LAM-PCR 产物中引入测序接头。PCR 产物可短期保存于 4 °C（最长 4 天），或长期保存于 -20 °C。
   4. 为观察融合引物 PCR 产物，取 9.2.3 步骤中的 10 µl PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳。剩余 PCR 产物按照 9.1.1–9.1.3 步骤进行纯化。取 9.4 步骤中纯化后的 1 µl PCR 产物，使用自动高分辨率电泳设备进行分析，以准确测定融合引物 PCR 产物的浓度和片段大小。

结果

LAM-PCR 可扩增出具有特定片段长度的载体基因组连接区域。每个PCR片段的长度取决于基因组中已知DNA位置与最近的限制性内切酶识别位点之间的距离。这使得可通过凝胶电泳直观地观察分析样本中扩增连接产物的多样性，例如，根据凝胶上是否存在单一（单克隆）、少数（寡克隆）或多条（多克隆）条带进行判断。LAM-PCR 的结果最好通过高分辨率电泳凝胶显示（图 2A），但也可在 2% 琼脂糖凝胶上观察（图 2B）。nrLAM-PCR 则对每个独立的连接位点产生不同长度的PCR片段，因此单克隆、寡克隆或多克隆样本在电泳图中均表现为弥散条带（涂布状），无法通过肉眼区分。在 2% 琼脂糖凝胶上观察 nrLAM-PCR 产物足以判断实验流程是否成功（图 2C）。对回收的基因组DNA进行测序后，可将其序列比对至相应的宿主基因组，以确定载体插入位点的精确位置（图 3A）。对基因组进行注释可进一步分析插入位点（IS）的特征，例如载体是否偏好插入基因编码区（图 3B）或靠近转录起...

讨论

LAM-PCR 技术可用于鉴定已知 DNA 区域侧翼的未知 DNA 序列。由于使用特异性引物与已知 DNA 序列杂交，对连接区域进行预扩增，因而具有高灵敏度，甚至能够扩增并检测到低至单细胞水平的稀有连接序列。相反，在多克隆情况下，LAM-PCR 能够在单次反应中扩增数千种不同的连接序列。

然而，由于仅使用限制性内切酶，每次使用特定的限制性内切酶进行LAM-PCR时，只能分析整合组中的一小部分是否存在连接片段。因此，建议使用不同的酶对同一样本进行重复分析⁹。如果凝胶上未出现LAM-PCR扩增产物，最可能的原因是已知DNA片段位置与所选限制性内切酶最近识别位点之间的距离过大，无法产生LAM-PCR产物⁹。此时应更换其他酶以扩增该连接片段。

nrLAM 不依赖限制性内切酶的使用，因此是一种用于全面表征已知 DNA 序列侧翼区域的非常有价值的方法。由于省略了限制性消化步骤，该方法无法获得表征每个扩增连接区的特异性限制性片段长度多态性。相反，每个扩增连接区均产生不同大小的 PCR 产物，电泳后...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Taq DNA 聚合酶	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	可使用其他替代的 Taq 聚合酶
PCR 缓冲液	Qiagen	201203	推荐使用该缓冲液
dNTP 混合物	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	或任何其他 dNTP
寡核苷酸（引物）	MWG Biotech		经 HPLC 纯化
Dynabeads M-280 链霉亲和素	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	含 0.1%（w/v）BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	含 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）/1 mM EDTA
Tris-HCl，pH 7.5	USB Corporation	22637	或任何其他供应商
EDTA	Applichem	A1103,0250	或任何其他供应商
Klenow 聚合酶	Roche Diagnostics	10104523001
六核苷酸混合物	Roche Diagnostics	11277081001
限制性内切酶	NEB		或任何其他供应商
Fast-Link DNA 连接试剂盒	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA 连接酶试剂盒	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	或任何其他供应商
低电渗琼脂糖（Agarose LE）	Roche Diagnostics	11685660001	或任何其他供应商
TBE 缓冲液	Amresco	0658	或任何其他供应商
溴化乙锭	Applichem	A2273,0005	溴化乙锭具有致突变性
100 bp DNA Marker	Invitrogen	15628-050	或任何其他 DNA Marker
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	或任何其他供应商
Magna-Sep 磁性粒子分离器	Life Technologies	K158501	适用于 1.5 ml 离心管
Magna-Sep 磁性粒子分离器	Life Technologies	K158696	适用于 96 孔板
Amicon Ultra-0.5，Ultracel-30 膜	Millipore	UFC503096
PerfectBlue 凝胶电泳系统 Midi S	PeqLab	40-1515	或其他电泳系统
TProfessional 96	Biometra	050-551	或其他适用于 96 孔板的 PCR 仪
轨道摇床 KS 260 basic	IKA	2980200	或其他水平摇床
0.2 ml PCR 软管	Biozym Scientific GmbH	711082	或其他 0.2 ml PCR 管
1.5 ml 离心管	Eppendorf	12682	或其他 1.5 ml 离心管
凝胶成像系统	PeqLab		或任何其他凝胶成像系统
Nanodrop ND-1000 分光光度计	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 预制胶	Elchrom Scientific	3497
SEA 2000 水平凝胶电泳装置	Elchrom Scientific	2001E
2100 电泳生物分析仪	Agilent Technologies	G2939AA