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方法文章

Aip1p 的动态特性因肌动蛋白中的 R256H 突变而改变

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DOI：

10.3791/51551

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2014年7月30日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Department of Biochemistry, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, University of Iowa

本文内容

摘要

肌动蛋白中的致病突变可改变细胞骨架功能。通过全内反射荧光显微镜对荧光标记的蛋白质进行成像，可定量分析细胞骨架动态。例如，在表达突变型肌动蛋白亚型 R256H 的细胞中，细胞骨架蛋白 Aip1p 的定位和运动发生改变。

摘要

肌动蛋白的突变通过特定的分子改变引起一系列人类疾病，这些改变通常影响细胞骨架的功能。本研究采用全内反射荧光（TIRF）显微镜对荧光标记的蛋白质进行成像，以可视化并量化细胞骨架动态的变化。TIRF显微镜结合荧光标记技术还可用于量化肌动蛋白突变所导致的细胞骨架动态变化。利用该技术对活细胞中细胞骨架功能进行量化，能够有力地补充 体外 蛋白质功能研究。例如，在三种人类肌动蛋白同工型中均发现了影响肌动蛋白残基R256的错义突变，提示该氨基酸在调控相互作用中具有重要作用。利用酵母模型研究了肌动蛋白R256H突变对细胞骨架运动的影响。将已知协助cofilin促进肌动蛋白解聚的蛋白Aip1在其N端与绿色荧光蛋白（GFP）融合，并进行示踪观察 体内 使用全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）对野生型和突变型菌株中Aip1p的运动速率进行定量分析。在表达R256H突变型肌动蛋白的细胞中，Aip1p的运动受到限制，其移动速率约为野生型细胞中测得速率的一半（R256H细胞中为0.88 ± 0.30 μm/sec，野生型细胞中为1.60 ± 0.42 μm/sec，p < 0.01）。 < 0.005).

引言

肌动蛋白是细胞骨架的主要组成蛋白，参与多种关键的细胞过程，包括细胞分裂、细胞器运动、细胞迁移、收缩以及信号传导。在过去十年中，已在六种人类肌动蛋白同工型中发现致病性突变，导致从肌病到冠状动脉疾病等一系列疾病1-7。目前仍在持续阐明肌动蛋白突变引发疾病的机制。由于酵母模型具有仅含一种必需肌动蛋白同工型、遗传操作简便以及肌动蛋白序列和功能高度保守等优势，仍是研究突变对肌动蛋白功能生化影响的金标准。研究表明，单个肌动蛋白突变可导致具有显性负效应的特异性分子功能障碍8。例如，引起耳聋的γ-非肌肉肌动蛋白突变若影响Lys-118残基，会改变Arp2/3肌动蛋白结合蛋白对其的调控9。目前研究常采用体外（in vitro）蛋白-蛋白相互作用分析方法，但针对肌动蛋白突变对细胞生物学的影响，尤其是对细胞内肌动蛋白结合蛋白定位影响的研究仍较为有限。

酵母细胞骨架的研究 体内 传统上依赖倒置荧光显微镜拍摄的固定细胞图像10这些实验提供了关于肌动蛋白细胞骨架形态的基础数据。此后，研究中引入了三维共聚焦成像技术，以可视化复杂的细胞骨架网络。11,12该成像技术可对肌动蛋白斑块和纤维的数量及相对位置进行定量分析。薄层电子断层扫描已被用于成像致密纤维网络的形态，以相对于保存完好的亚细胞结构进行观察。13细胞内拥挤且横截面较小的空间可通过该技术进行精细观察。利用延时荧光显微镜，成像研究已拓展至活细胞。在光漂白和背景荧光得到有效控制的情况下，延时成像可用于研究细胞骨架蛋白的动力学行为及其对环境条件的响应。11,14. 分别观察肌动蛋白丝的动力学变化 体外 由于全内反射荧光（TIRF）显微镜的引入而得到进一步发展。与宽场显微镜相比，TIRF具有背景荧光降低、对比度提高的优势，可用于观测单个细丝15,16凭借这些特性，全内反射荧光显微镜已被细胞生物学家用于监测细胞质膜上的细胞结构17,18细胞事件（包括细胞骨架的变化）可通过低光毒性、高对比度和最低背景荧光的方式进行实时观察19.

为了更好地理解肌动蛋白突变对细胞内细胞骨架蛋白运动、定位和周转的影响，采用了全内反射荧光显微镜（TIRF）和蛋白质标记技术。本文介绍了研究临床相关肌动蛋白突变对细胞骨架动态影响的方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 被描述. 具体而言，在表达肌动蛋白R256H突变的细胞中，对肌动蛋白结合蛋白Aip1p的定位与运动进行了可视化观察与定量分析。这些技术相互补充 体外 生化研究，并有助于更深入地理解蛋白质相互作用与功能。

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方案

1. 克隆至PB1996质粒

  1. 从寡核苷酸合成公司设计并订购特异性DNA引物，引物应位于目标序列两端，并在所选的母体质粒中包含独特的限制性酶切位点。注：本实验中，引物设计用于扩增Aip1序列5’端的400个碱基对。在距离Aip1序列约20 bp的上游引物中引入XhoI限制性酶切位点，下游引物中在目标Aip1序列下游约20 bp处引入XmaI位点。克隆所用质粒为PB1996，该质粒含有3XGFP荧光标签、用于酵母菌株筛选的URA基因以及用于细菌筛选的氨苄青霉素抗性基因。
  2. 从Ura-酵母单倍体菌株中提取基因组DNA。注：克隆过程示意图参见图1。
  3. 使用上述两种引物和酵母基因组DNA进行标准PCR反应，以扩增两端带有限制性酶切位点的Aip1p基因。根据制造商推荐的实验条件，分别对PCR产物和PB1996质粒进行限制性内切酶消化反应。本实验中使用XmaI和XhoI酶，在配套缓冲液中37 °C反应1小时。
  4. 制备0.8%琼脂糖凝胶电泳以分离酶切后的DNA片段。在其中一个加样孔中加入低分子量DNA Marker，其余各孔分别加入完整的酶切反应产物。以100伏电压电泳约1小时，直至染料前沿接近凝胶末端。在紫外灯下观察凝胶条带，切取对应目标蛋白片段及线性化质粒的凝胶区域，并进行DNA纯化。
  5. 将酶切后的Aip1片段与PB1996质粒进行连接反应。按照制造商提供的转化方案，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中（10 μl DNA与100 μl细胞在冰上孵育30分钟，42 °C热激2分钟，随后在SOC培养基中37 °C振荡培养2小时），涂布于含有筛选抗生素的培养平板上（本实验为LB+Amp平板）。挑取单克隆菌落进行液体培养，提取并纯化新构建的质粒。

2. 突变酵母菌株的构建

  1. 使用一种单倍体酵母菌株，其中肌动蛋白等位基因已被删除，以构建突变酵母菌株。注意：本实验中所用亲本菌株由爱荷华大学Peter Rubenstein博士慷慨惠赠，其构建方法由Cook 等20描述。该菌株缺失染色体上的肌动蛋白基因，并携带一个编码野生型酵母肌动蛋白和尿嘧啶的质粒。
  2. 使用编码野生型酵母肌动蛋白并带有Trp+筛选标记的pRS质粒作为定点突变的起始质粒21。
  3. 对pRS质粒进行定点突变，将错义突变引入肌动蛋白基因。
    1. 针对肌动蛋白中的R256H突变，设计引物序列为5’ ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3’，以将Arg256替换为His256。以第2.2步中的质粒为模板，进行标准的突变PCR反应。
    2. 将PCR产物中的突变肌动蛋白质粒转化至DH5α细胞中。提取质粒DNA并测序肌动蛋白基因，以确认突变成功引入。
  4. 将编码突变酵母肌动蛋白的质粒转化至第2.1步中的单倍体酵母菌株中。
  5. 将转化后的细胞培养在Trp-平板上，筛选含有Trp+标记的突变酵母肌动蛋白质粒的酵母菌株。
  6. 通过将Trp-平板上的菌落转接到含有5-氟乳清酸（5-FOA）的平板上进行继代培养，筛选丢失原始编码野生型肌动蛋白和尿嘧啶质粒的细胞（如步骤2.1所述）。在表达功能性URA3基因的酵母菌株中，5-FOA会被转化为有毒形式5-氟尿嘧啶。经过逐步筛选后能够生长的细胞仅含有突变型肌动蛋白质粒。
  7. 从新构建的酵母菌株中提取质粒DNA，测序验证突变肌动蛋白基因的存在。将该菌株用于后续研究。此过程示意图见图2。

3. 将质粒转化进酵母细胞

  1. 使用限制性内切酶消化 Aip1p-GFP 质粒，以实现其在酵母染色体中的整合。注意：限制性酶切位点必须位于包含荧光标签、目的基因和筛选标记的序列区段之外。本实验中，取 8 μl DNA，加入 1 μl HpaI 限制性内切酶和 1 μl 配套的 10x 缓冲液，在 37 °C 下反应 1 小时。
  2. 将不能合成尿嘧啶的 S. cerevisiae 细胞（来自步骤 2.5，Ura- 菌株）接种于 5 ml YPD 培养基（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖）中，在 30 °C 条件下于摇床上过夜培养。取 1 ml 培养物，以 1,000 × g 离心 5 分钟，收集细胞。
  3. 配制 PLATE 混合液。通过将 5 ml 1 M Tris（pH 7.5）和 2 ml 250 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）加入 43 ml ddH2O 中，配制 10XTE 溶液。向 20 ml 1XTE 溶液中加入 0.204 g 醋酸锂，再加入 8 g 聚乙二醇（PEG，分子量 ~3,300），过滤除菌。
  4. 弃去步骤 3.2 中离心后的上清液，将沉淀细胞重悬于残留液体中。向悬浮细胞中加入 2 μl 10 mg/ml 鲑鱼精 DNA 作为载体 DNA。加入 10 μl 来自步骤 3.1 的酶切质粒 DNA，涡旋混匀。加入 0.5 ml PLATE 溶液，涡旋混匀。再加入 20 μl 1 M DTT，再次涡旋混匀。
  5. 将混合物在 25 °C 下孵育 6–8 小时。随后在 42 °C 水浴中进行热激处理 10 分钟。从微量离心管底部吸取 100 μl 细胞悬液，涂布于 –Ura 平板上。在 30 °C 下孵育 2–3 天，直至菌落形成。
  6. 挑取单个菌落，并在 –Ura 平板上划线分离。注意： 这些细胞的染色体中已整合了携带 Aip1-GFP 和 Ura 基因的质粒，因而可在缺乏尿嘧啶的培养基上生长。这些细胞将用于后续显微镜观察。

4. 使用全内反射荧光显微镜观察Aip1p蛋白的运动

  1. 将含有 Aip1p-GFP 的酵母细胞在 YPD 培养基中于 30 °C 条件下在摇床上过夜培养。取 1 ml 过夜培养物接种至 9 ml 的 –Ura 培养基中，在 30 °C 摇床中继续培养 3–4 小时，以确保细胞处于对数生长期。
  2. 取 3 μl 细胞悬液滴加到玻璃显微镜载玻片上，加盖盖玻片。让细胞在载玻片上静置 5 分钟。将载玻片放入载物台支架中。
  3. 使用全内反射荧光显微镜（TIRF，488 nm）配合油浸 100X TIRF 物镜和数字 CCD 相机观察 Aip1p-GFP 蛋白。利用 SlideBook 5.0 软件，以每秒 5 帧的速率采集持续 20 秒的图像（所采集图像的单帧示例见图 2A）。
    1. 为对细胞进行聚焦，打开 SlideBook 5.0 软件，点击工具栏中的 Focus Window 按钮以进入聚焦控制界面。选择 Scope 选项卡，并选择 100X-TIRF 物镜。打开光源，将光源强度滑块调至 15%。将 Bin 设置更改为 2 × 2。将滤光片切换至明场模式。
    2. 在显微镜上使用微调焦旋钮，根据计算机屏幕上的图像将细胞调至清晰对焦状态。
    3. 在 Focus Window 控制界面中，关闭光源，将滤光片切换至 Live 模式，然后点击 TIRFM 按钮。
    4. 在连接于显微镜右侧端口的 TIRFM 照明器上，将激光发射设置为开启状态。
    5. 在 Focus Window 中选择 Stream 选项卡，勾选“Start Recording”旁边的复选框，然后点击明场按钮。
    6. 在 TIRFM 照明器上调节微米计，以调整激光的入射角度。此操作用于优化 Aip1-GFP 荧光焦点的发射信号，并最大限度降低细胞和载玻片背景产生的荧光。
    7. 当显示所需图像时，按下“Start”按钮。20 秒后按下“Stop”按钮。保存图像。在主菜单栏的“File”选项卡下，选择“Save Slide As”，输入文件保存路径和名称。
  4. 使用 ImageJ 软件分析图像。使用宏插件“Manual Tracker”追踪荧光 Aip1p 焦点的运动轨迹及其移动速率。将时间间隔参数设置为 0.2 秒。
    1. 通过“add track”功能选择并追踪单个荧光蛋白在连续四到八帧中的运动轨迹。使用“end track”命令后，各帧之间蛋白移动速度将在结果窗口中显示。
    2. 使用 Microsoft Excel 电子表格计算每帧之间的平均速率。利用这些数值计算每种目标细胞株中 Aip1p 移动的平均速度。注：Aip1p 移动速率与平均非线性速度的散点图见图 2B。

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结果

本文介绍了一种用于成像细胞内细胞骨架蛋白动态行为的方法。将肌动蛋白结合蛋白Aip1p与GFP进行标记，编码该标记产物的质粒设计如图1所示。随后将该质粒转化至酵母细胞中。通过表达荧光标记的Aip1p，可在细胞内观察该蛋白的行为。Aip1p通常定位于内吞作用位点的肌动蛋白斑块22。为定量分析Aip1p的运动，如图2A所示，在超过10个细胞中追踪了50多个荧光标记的Aip1p焦点。计算每个荧光Aip1p区域的平均速度（见图2B）。在野生型细胞中，Aip1p可在细胞内广泛移动，随后消失。野生型细胞中Aip1p运动的平均速度为1.60 ± 0.42 μm/sec。表达R256H突变型肌动蛋白的细胞（已知其肌动蛋白细胞骨架形态异常23）表现出Aip1p表型的改变。在该突变株中，Aip1p的运动受到限制且速度更慢，其平均运动速度为0.88 ± 0.30 μm/sec（p <0.005）。Aip1p的迁移局限于局部区域，焦点彼此环绕运动，而非穿越整个细胞。此外，Aip1p的可见时间更长，提示Aip1蛋白...

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讨论

本文描述了一种可视化细胞骨架动态及其在致病性突变研究中应用的有效策略。先进的成像技术为理解细胞膜附近蛋白质的细胞内运动提供了新的机遇。全内反射荧光显微镜（TIRF）是一种用于活细胞功能研究的敏感技术。TIRF利用倾斜的激发激光，由于盖玻片与水性介质折射率的差异，产生倏逝波场。倏逝波场的能量可激发荧光分子，但其强度随盖玻片与液体界面距离的增加呈指数衰减。这使得TIRF在盖玻片/介质界面上方50–250 nm范围内具有高信噪比和强大的分辨率。这些特性使TIRF显微镜成为一种强有力的工具，可在活细胞中以单分子水平可视化细胞骨架蛋白，且相较于其他技术具有更低的光毒性与更高的对比度24-26。

细胞骨架涉及多种蛋白质协同作用，以适应细胞的需求。我们课题组近期研究了肌动蛋白中导致血管疾病突变对cofilin调控功能的影响27。基于我们的初步发现，进一步探讨了Aip1p（一种促进cofilin依赖性肌动蛋白切割的肌动蛋白结合蛋白）的作用。初步研究表明，在缺乏Aip1p的情况下，表达肌动蛋白R256H突变的细胞生长状况较差，尤其在应...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Peter Rubenstein 提供的有益讨论和技术建议，以及 David Pellman 提供的原始 PB1996 克隆。本研究得到了来自 March of Dimes 的资助和 Ride for the Kids 项目的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖rpi9012-36-6
溴酚蓝Amresco115-39-9
牛血清白蛋白（BSA）NEBB9001S
Change-IT 多位点定向突变试剂盒USB Corporation4166059
CutSmart 缓冲液NEBB7204S
鲑鱼精来源的单链DNASigma9007-49-2
EDTA pH 7.4Sigma93302
溴化乙锭Invitrogen15585-011警告！有害刺激性
真菌/细菌DNA提取试剂盒Symo ResearchD6005
HpaINEBR0105S
醋酸锂AlfaAesar6108-17-4
低分子量DNA MarkerInvitrogen10068-013
NE Buffer #4NEBB7004S
Platinum 高保真PCR SuperMixInvitrogen12532-016
质粒小提试剂盒Qiagen27106任何品牌均可使用
Quick Ligation 试剂盒NEBM2200S
叠氮化钠Sigma26628-22-8
PBSInvitrogen10010-023
聚乙二醇（PEG）Amresco25322-68-3
高纯度Tris碱rpi77-86-1
Wizard SV 凝胶与PCR产物纯化系统Promega1/6/2015
XhoINEBR0146S
XmaINEBR0180S
YPD培养基LabExpress3011
-URA 培养基LabExpress3010
PCR仪Invitrogen4359659任何PCR仪均可使用
TIRF显微镜Olympus IX81
Hamamatsu ORCA-R 相机Hamamatsu

参考文献

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