Aip1p 的动态特性因肌动蛋白中的 R256H 突变而改变

摘要

肌动蛋白中的致病突变可改变细胞骨架功能。通过全内反射荧光显微镜对荧光标记的蛋白质进行成像，可定量分析细胞骨架动态。例如，在表达突变型肌动蛋白亚型 R256H 的细胞中，细胞骨架蛋白 Aip1p 的定位和运动发生改变。

摘要

肌动蛋白的突变通过特定的分子改变引起一系列人类疾病，这些改变通常影响细胞骨架的功能。本研究采用全内反射荧光（TIRF）显微镜对荧光标记的蛋白质进行成像，以可视化并量化细胞骨架动态的变化。TIRF显微镜结合荧光标记技术还可用于量化肌动蛋白突变所导致的细胞骨架动态变化。利用该技术对活细胞中细胞骨架功能进行量化，能够有力地补充 体外 蛋白质功能研究。例如，在三种人类肌动蛋白同工型中均发现了影响肌动蛋白残基R256的错义突变，提示该氨基酸在调控相互作用中具有重要作用。利用酵母模型研究了肌动蛋白R256H突变对细胞骨架运动的影响。将已知协助cofilin促进肌动蛋白解聚的蛋白Aip1在其N端与绿色荧光蛋白（GFP）融合，并进行示踪观察 体内 使用全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）对野生型和突变型菌株中Aip1p的运动速率进行定量分析。在表达R256H突变型肌动蛋白的细胞中，Aip1p的运动受到限制，其移动速率约为野生型细胞中测得速率的一半（R256H细胞中为0.88 ± 0.30 μm/sec，野生型细胞中为1.60 ± 0.42 μm/sec，p < 0.01）。 < 0.005).

引言

肌动蛋白是细胞骨架的主要组成蛋白，参与多种关键的细胞过程，包括细胞分裂、细胞器运动、细胞迁移、收缩以及信号传导。在过去十年中，已在六种人类肌动蛋白同工型中发现致病性突变，导致从肌病到冠状动脉疾病等一系列疾病^1-7。目前仍在持续阐明肌动蛋白突变引发疾病的机制。由于酵母模型具有仅含一种必需肌动蛋白同工型、遗传操作简便以及肌动蛋白序列和功能高度保守等优势，仍是研究突变对肌动蛋白功能生化影响的金标准。研究表明，单个肌动蛋白突变可导致具有显性负效应的特异性分子功能障碍⁸。例如，引起耳聋的γ-非肌肉肌动蛋白突变若影响Lys-118残基，会改变Arp2/3肌动蛋白结合蛋白对其的调控⁹。目前研究常采用体外（in vitro）蛋白-蛋白相互作用分析方法，但针对肌动蛋白突变对细胞生物学的影响，尤其是对细胞内肌动蛋白结合蛋白定位影响的研究仍较为有限。

酵母细胞骨架的研究 体内 传统上依赖倒置荧光显微镜拍摄的固定细胞图像¹⁰这些实验提供了关于肌动蛋白细胞骨架形态的基础数据。此后，研究中引入了三维共聚焦成像技术，以可视化复杂的细胞骨架网络。^11,12该成像技术可对肌动蛋白斑块和纤维的数量及相对位置进行定量分析。薄层电子断层扫描已被用于成像致密纤维网络的形态，以相对于保存完好的亚细胞结构进行观察。¹³

方案

1. 克隆至PB1996质粒

1. 从寡核苷酸合成公司设计并订购特异性DNA引物，引物应位于目标序列两端，并在所选的母体质粒中包含独特的限制性酶切位点。注：本实验中，引物设计用于扩增Aip1序列5’端的400个碱基对。在距离Aip1序列约20 bp的上游引物中引入XhoI限制性酶切位点，下游引物中在目标Aip1序列下游约20 bp处引入XmaI位点。克隆所用质粒为PB1996，该质粒含有3XGFP荧光标签、用于酵母菌株筛选的URA基因以及用于细菌筛选的氨苄青霉素抗性基因。
2. 从Ura-酵母单倍体菌株中提取基因组DNA。注：克隆过程示意图参见图1。
3. 使用上述两种引物和酵母基因组DNA进行标准PCR反应，以扩增两端带有限制性酶切位点的Aip1p基因。根据制造商推荐的实验条件，分别对PCR产物和PB1996质粒进行限制性内切酶消化反应。本实验中使用XmaI和XhoI酶，在配套缓冲液中37 °C反应1小时。
4. 制备0.8%琼脂糖凝胶电泳以分离酶切后的DNA片段。在其中一个加样孔中加入低分子量DNA Marker，其余各孔分别加入完整的酶切反应产物。以100伏电压电泳约1小时，直至染料前沿接近凝胶末端。在紫外灯下观察凝胶条带，切取对应目标蛋白片段及线性化质粒的凝胶区域，并进行DNA纯化。
5. 将酶切后的Aip1片段与PB1996质粒进行连接反应。按照制造商提供的转化方案，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中（10 μl....

结果

本文介绍了一种用于成像细胞内细胞骨架蛋白动态行为的方法。将肌动蛋白结合蛋白Aip1p与GFP进行标记，编码该标记产物的质粒设计如图1所示。随后将该质粒转化至酵母细胞中。通过表达荧光标记的Aip1p，可在细胞内观察该蛋白的行为。Aip1p通常定位于内吞作用位点的肌动蛋白斑块²²。为定量分析Aip1p的运动，如图2A所示，在超过10个细胞中追踪了50多个荧光标记的Aip1p焦点。计算每个荧光Aip1p区域的平均速度（见图2B）。在野生型细胞中，Aip1p可在细胞内广泛移动，随后消失。野生型细胞中Aip1p运动的平均速度为1.60 ± 0.42 μm/sec。表达R256H突变型肌动蛋白的细胞（已知其肌动蛋白细胞骨架形态异常²³）表现出Aip1p表型的改变。在该突变株中，Aip1p的运动受到限制且速度更慢，其平均运动速度为0.88 ± 0.30 μm/sec（p <0.005）。Aip1p的迁移局限于局部区域，焦点彼此环绕运动，而非穿越整个细胞。此外，Aip1p的可见时间更长，提示Aip1蛋白.......

讨论

本文描述了一种可视化细胞骨架动态及其在致病性突变研究中应用的有效策略。先进的成像技术为理解细胞膜附近蛋白质的细胞内运动提供了新的机遇。全内反射荧光显微镜（TIRF）是一种用于活细胞功能研究的敏感技术。TIRF利用倾斜的激发激光，由于盖玻片与水性介质折射率的差异，产生倏逝波场。倏逝波场的能量可激发荧光分子，但其强度随盖玻片与液体界面距离的增加呈指数衰减。这使得TIRF在盖玻片/介质界面上方50–250 nm范围内具有高信噪比和强大的分辨率。这些特性使TIRF显微镜成为一种强有力的工具，可在活细胞中以单分子水平可视化细胞骨架蛋白，且相较于其他技术具有更低的光毒性与更高的对比度^24-26。

细胞骨架涉及多种蛋白质协同作用，以适应细胞的需求。我们课题组近期研究了肌动蛋白中导致血管疾病突变对cofilin调控功能的影响²⁷。基于我们的初步发现，进一步探讨了Aip1p（一种促进cofilin依赖性肌动蛋白切割的肌动蛋白结合蛋白）的作用。初步研究表明，在缺乏Aip1p的情况下，表达肌动蛋白R256H突变的细胞生长状况较差，尤其在应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	rpi	9012-36-6
溴酚蓝	Amresco	115-39-9
牛血清白蛋白（BSA）	NEB	B9001S
Change-IT 多位点定向突变试剂盒	USB Corporation	4166059
CutSmart 缓冲液	NEB	B7204S
鲑鱼精来源的单链DNA	Sigma	9007-49-2
EDTA pH 7.4	Sigma	93302
溴化乙锭	Invitrogen	15585-011	警告！有害刺激性
真菌/细菌DNA提取试剂盒	Symo Research	D6005
HpaI	NEB	R0105S
醋酸锂	AlfaAesar	6108-17-4
低分子量DNA Marker	Invitrogen	10068-013
NE Buffer #4	NEB	B7004S
Platinum 高保真PCR SuperMix	Invitrogen	12532-016
质粒小提试剂盒	Qiagen	27106	任何品牌均可使用
Quick Ligation 试剂盒	NEB	M2200S
叠氮化钠	Sigma	26628-22-8
PBS	Invitrogen	10010-023
聚乙二醇（PEG）	Amresco	25322-68-3
高纯度Tris碱	rpi	77-86-1
Wizard SV 凝胶与PCR产物纯化系统	Promega	1/6/2015
XhoI	NEB	R0146S
XmaI	NEB	R0180S
YPD培养基	LabExpress	3011
-URA 培养基	LabExpress	3010
PCR仪	Invitrogen	4359659	任何PCR仪均可使用
TIRF显微镜	Olympus IX81
Hamamatsu ORCA-R 相机	Hamamatsu