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方法文章

qPCR 是一种用于检测福尔马林固定、石蜡包埋活检组织中巨细胞病毒 DNA 的灵敏且快速的方法

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DOI：

10.3791/51570

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2014年7月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University Health

本文内容

摘要

本方案描述了在福尔马林固定、石蜡包埋的活检组织中进行巨细胞病毒qPCR检测的方法，该方法快速、灵敏、特异，有助于解读难以确定的苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色结果。

摘要

对于免疫抑制患者而言，识别其胃肠道（GI）中的巨细胞病毒（CMV）感染至关重要，因为这类患者发生严重感染的风险更高。目前已开发出多种用于检测CMV感染的实验室方法，包括血清学检测、病毒培养和分子检测方法。然而，这些方法通常反映的是CMV的全身性感染情况，无法特异性地识别局部组织感染。因此，胃肠道CMV感染的检测通常依赖于活检组织的传统组织病理学检查。苏木精和伊红（H&E）染色联合免疫组织化学（IHC）染色一直是此类活检样本检测的主要手段。但H&E和IHC有时会出现非典型（意义未明）的染色模式，导致结果判读困难。已有研究表明，针对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）活检组织进行CMV的定量聚合酶链式反应（qPCR）检测，可实现极高的敏感性和特异性。本实验方案旨在演示如何在临床实验室环境中，对FFPE活检组织进行qPCR检测以识别CMV感染。该方法在胃肠道活检中CMV染色结果不明确的情况下，有望为患者带来显著的临床获益。

引言

解读临床标本中的巨细胞病毒（CMV）感染具有重要意义。CMV 属于疱疹病毒科的β-疱疹病毒亚科。与其他疱疹病毒类似，CMV 能够建立持续性或潜伏性感染，其特征是无活跃的病毒复制1。在应激状态或其他免疫抑制情况下，病毒可能重新激活，导致活跃的病毒复制，表现为病毒颗粒释放，并可能伴随疾病症状的出现2-4。胃肠道（GI）CMV 疾病的常见症状包括腹痛和/或血便1。

通过组织学诊断巨细胞病毒（CMV）胃肠炎时，常使用苏木精和伊红（H&E）染色来识别CMV病毒包涵体。在临床高度怀疑但未观察到明显包涵体的情况下，免疫组织化学（IHC）常作为辅助检测方法。然而，IHC也可能因罕见的非典型细胞染色模式（结果不确定）而受限，导致判读困难（图2）5。因此，研究拟采用从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的胃肠道活检组织中提取的DNA，结合定量聚合酶链式反应（qPCR）来检测胃肠道活检标本中的CMV。该技术已被证明在检测胃肠道活检组织中的CMV方面具有重要价值，尤其有助于IHC染色结果不确定的病例5,6。此外，当有其他临床CMV检测数据可供参考时，qPCR结果也显示出良好的相关性6。在临床高度怀疑CMV感染但H&E染色和CMV IHC结果均为阴性的情况下，应用qPCR检测可能有助于实现更早的诊断与治疗。

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方案

在获得机构审查委员会批准后，通过检索电子实验室数据库，查找代表胃肠道（GI）活检中巨细胞病毒（CMV）感染病例的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织块，这些病例经组织病理学（苏木精和伊红（H&E）和/或免疫组织化学（IHC））诊断确认。

1. 来自福尔马林固定石蜡包埋胃肠道活检组织的组织处理

  1. 收集胃肠道（GI）活检的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块，用于巨细胞病毒（CMV）定量聚合酶链式反应（qPCR）检测。这些组织块在室温下保存。
  2. 用组织块的唯一编号预先标记1.7 ml 微量离心管。
  3. 锁定切片机手轮。
  4. 将组织块放入包埋盒夹具中固定。
  5. 使用一把全新的未使用刀片，将组织块对准切片机的刀片角度。
  6. 调节切片机以切出厚度为10 μm 的切片。
  7. 松开手轮，推进组织块靠近刀片。
  8. 以10 μm的厚度连续切取5张切片，使每张切片自然卷曲成组织卷。确保每个组织卷均充分代表所需活检组织。
  9. 锁定切片机手轮。
  10. 用镊子将全部5个组织卷放入已预先标记的离心管中，操作时仅接触石蜡部分，以减少交叉污染的风险。盖紧管盖，并将离心管放回架子上。
  11. 从切片机上取下组织块。
  12. 取下并丢弃刀片。
  13. 对可能接触过前一份组织的所有表面或器械进行去污染处理。
  14. 将一把全新的未使用刀片装入刀片架中。
  15. 对每个需要处理的额外组织块重复步骤1.4–1.14。含有组织卷的微量离心管可在室温下保存，直至进行DNA提取。

2. 从FFPE胃肠道活检组织卷中提取DNA

注意：本方案改编自 FFPE 组织 DNA 提取试剂盒的说明书（注意：请参阅材料安全数据表 (MSDS)）。

  1. 向每个样品微量离心管中加入 1 ml 二甲苯（注意：请参阅材料安全数据表）。盖紧管盖，剧烈涡旋振荡 10 秒。
  2. 按照制造商产品说明书中具体规定的DNA提取步骤进行操作，并作如下修改。
  3. 首先向每个微量离心管中加入 6 μl 内参（IC）。
    1. 在 ATL/蛋白酶 K 裂解液于 56 °C 孵育 1 小时后，改为在 99 °C 孵育 30 分钟，而不是在 90 °C 孵育 1 小时。
    2. 在最终 DNA 洗脱步骤中，小心打开 DNA 纯化柱管盖，将 50 μl 无 DNA酶/RNA酶的蒸馏水加至膜的中心位置，而非使用缓冲液 ATE。
      注意：请参阅试剂盒说明书，了解试剂的正确储存与配制方法。应对全部 5 个 FFPE 切片样本提取 DNA。所有离心步骤均在室温（15–25 °C）下进行。

3. 巨细胞病毒的qPCR检测

  1. 聚合酶链式反应（PCR）操作流程
    1. 生成用于CMV检测的Excel PCR工作表。该Excel工作表可计算含Mg的主混合液中每种试剂所需的总量。它将每个样本所需每种试剂的量（如下所列）乘以样本数和对照数再加一（以补偿移液过程中的损耗）。
      1. 在每个PCR反应中加入如下试剂，并按照指定的量添加：
        试剂 每样本用量
        CMV LC预混液瓶               12.5 μl
        Mg 溶液，黄色小瓶                 2.5 μl
        总体积                                15.0 μl
    2. 每次检测中均需设置水对照或无模板对照（NTC）、阴性对照、低阳性对照、高阳性对照，以及 QS3 或 QS4，并同时检测所有患者样本。毛细管应按此顺序排列。
    3. 从4 °C冰箱中取出适用于实时荧光定量PCR仪的冷却块。将相应的毛细管放入冷却块中。切勿触碰毛细管表面。操作毛细管时务必佩戴手套。
    4. 在未被扩增产物污染的洁净罩内配制所有聚合酶链式反应。
      1. 从PCR试剂盒中取出足够数量的主试剂管，用于检测所有患者样本及5个对照样本。将主试剂管、Mg溶液和PCR级水置于冷却块中解冻。每管主试剂包含12次检测所需的试剂。
      2. 轻轻涡旋混匀主溶液管，然后在离心机中以最大速度瞬时离心。
      3. 将每个主瓶中的内容物合并至一个瓶中，并轻轻涡旋混匀。
      4. 按照PCR工作表上标明的量，将主混合液与Mg溶液加入一个无菌的微量离心管中混合。
      5. 轻柔混匀，并将含镁的主混合液各15 μl分装至每根毛细管中，位置5的毛细管除外，该管用于定量标准品（QS）。
    5. 将装有毛细管和含镁主混合液的冷却块从洁净罩转移到处理罩中。
    6. 向剩余的含镁主混合液30 μl中加入2 μl的内参对照（IC），轻轻混匀，并将15 μl分装至第5号毛细管中（QS位）。
    7. 将10 μl水、对照DNA或样品DNA移液至相应的毛细管中。使用封帽工具对毛细管进行封帽。
    8. 将冷却块/样本转移至实时荧光定量PCR仪。
  2. 程序化实时荧光定量 PCR 仪（参见 表1)
  3. 在实时 PCR 仪器上进行扩增与检测
    1. 登录计算机
    2. 双击仪器图标并登录软件。
    3. 打开实时荧光定量PCR仪
    4. 在主界面点击“CMV/EBV”。
    5. 按照宏向导的提示进行操作。
    6. 当软件提示时，选中该选项以运行自检。仪器每次使用当天必须执行一次自检。
    7. 命名运行。
    8. 将页面左上角的样本数量调整为本次运行中所包含的对照样本与患者样本的总数，并输入每个患者样本的编号。
    9. 点击“绝对定量”标签。
    10. 在“样本类型”下，为标准品指定相应的样本类型。
    11. 输入定量标准品（QS）的预期浓度。
    12. 从冷却块中取出毛细管，并将其放入转盘中对应的孔位（冷却块样品1应放入转盘的1号位置）。 等等。).
    13. 将转盘放入仪器的离心机中，然后按下启动按钮。
    14. 打开离心机并取出转子。
    15. 将样品架放入实时荧光定量PCR仪中，盖上盖子。
    16. 点击“开始运行”。
    17. 实时PCR仪器将检查每个样品位置。在完成此检查之前，请勿离开仪器，特别是当某根毛细管未放入转盘时。仪器会提示该情况，并询问是否继续运行。请确认“是”后再离开。
    18. 运行完成后，关闭生成的报告。
    19. 点击“绝对定量”。
    20. 点击颜色补偿旁边的箭头。
    21. 从下拉框中选择“选择颜色补偿”。
    22. 选择最新的颜色补偿文件以应用于运行。
    23. 当弹出对话框时，点击“确定”。
    24. 点击标准曲线旁边的箭头。
    25. 从下拉菜单中选择“使用外部”。
    26. 选择最新的外部标准曲线文件，然后点击“确定”。
    27. 在“绝对定量”菜单下查看每条曲线，以确保曲线存在且非直线（当已分配浓度时）。705/Back 530 的绝对定量将自动进行分析。
  4. 质量控制
    1. 每当收到新批次的试剂或每六个月（以较频繁者为准）时，均需重新生成标准曲线。
    2. 向含镁的主混合液中加入每种标准品各10 μl。将试剂盒中提供的标准品视为已提取的DNA。
    3. 向用于生成标准曲线的含镁主混合液中，为每个标准品加入1 μl内标对照，以确保准确定量。在无模板对照（NTC）的含镁主混合液中，不得添加内标对照。
    4. 准备一个NTC以及定量标准品QS4、QS3、QS2、QS1的三个重复，同时准备QS4的1:10稀释液，用于运行以生成标准曲线，共计16个样本 数据点。
    5. 在下拉菜单中选择“replicate of”以设置重复的标准品
    6. 选择通道 530/后向散射无，并在分析运行时开启颜色补偿，
    7. 在“标准曲线（运行中）”中，选择“另存为外部”，并为该曲线命名。保存时输入注释“用作标准曲线”。
    8. 绘制结果图。所得线性系数必须 ≥0.81。
    9. 每日运行时，在实验中加入一份 QS3 或 QS4 作为对照。在分析阶段，可将当前的外部标准曲线导入运行中。
    10. 对照设置：无DNA对照、阴性对照、低阳性对照和高阳性对照。根据各厂商及批号确定并调整预期病毒载量。
    11. 在DNA提取过程中，为每个样本和对照组添加内参（IC）。
    12. 如果任何对照结果超出范围，应记录不可接受的结果，并将该检测提交问题排查。
  5. 对照频率
    1. 每次运行均需包含：NTC对照、阴性对照、低阳性对照、高阳性对照和标准品对照。

注意：对照品的可接受范围。无模板对照（NTC）和阴性对照不应出现任何扩增峰。低浓度和高浓度阳性对照的 530 通道应出现扩增峰，其预期病毒载量需根据各厂商和批号进行确定并相应调整。

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结果

总共对228个组织块进行了定量聚合酶链式反应（qPCR）检测，其中包括91例基于组织学和免疫组织化学（IHC）检测结果均为阳性的巨细胞病毒（CMV）阳性病例，18例CMV IHC结果不确定的病例，以及79例阴性对照。如图2所示，CMV阳性病例应表现出典型的CMV病毒包涵体（A）和/或IHC染色阳性（B）。结果不确定的病例表现为罕见的、非典型染色模式（C），而阴性对照则无任何可疑的组织学表现或IHC染色5。

在91例经组织病理学检测为巨细胞病毒（CMV）阳性的活检样本中，有88例通过qPCR检测呈阳性（表2）。以传统组织学为基础定义真阳性， 即 典型的巨细胞病毒包涵体和/或典型的巨细胞病毒免疫组化结果，这些数据得出的敏感性为96.7%。

79例阴性对照活检样本（35例正常结肠，25例结肠炎，19例十二指肠炎） 即<...

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讨论

目前有多种实验室方法可用于诊断巨细胞病毒（CMV）感染，包括血清学检测、病毒培养、分子病毒血症检测、活检组织的组织学检查，以及近期已证实的对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）活检组织进行的分子检测5,6。血清学检测曾是诊断的主要手段，但仅能可靠地识别既往暴露，与急性CMV感染的相关性较差7。传统的病毒培养以及早期抗原壳杯培养法均受限于较长的检测周期，其中后者最快也需要2至3天8。目前已开发出多种分子病毒血症检测方法，大多数具有可定量的优点，可用于监测治疗效果9-11。然而，当临床上怀疑胃肠道（GI）局部受累时，病毒血症检测反映的是全身性感染，无法特异性地识别局部感染。因此，组织学检查一直是诊断胃肠道CMV感染的金标准。

对于免疫功能低下患者（如艾滋病病毒/艾滋病患者、接受化疗者或器官/干细胞移植受者），识别胃肠道中巨细胞病毒（CMV）的活动性感染至关重要，因为这些人群发生严重感染的风险更高。已有研究报道，定量聚合酶链式反应（qPCR）是一种检测胃肠道活检组织中CMV的高灵敏度和高特异性方法

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披露

作者无任何利益冲突可披露。

致谢

感谢 Amy Thomasson 在准备本手稿过程中的帮助，以及 Fredrik Skarstedt 和 Ryan Christy 在制备图表方面所做的努力。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.7 ml 微量离心管Costar3620
锯齿状镊子Electron Microscopy Services62086-1SMicro Forceps MF-1
台式离心机（微量离心机）Eppendorf5424
二甲苯FisherFisher Scientific: X3P1 加仑
乙醇FisherFisher Scientific: ET10896-100%
切片机LeicaRM2255
QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒Qiagen56404
artus CMV LightCycler PCR ASRQiagen4500025
CMV LC PCR 补充试剂盒Qiagen1031873
LightCycler 离心机Roche75005087
LightCycler 冷却块Roche10800058001
LightCycler 封盖工具Roche3357317
颜色校正试剂盒Roche2158850
LightCycler 20 μl 毛细管Roche1 909 339
刀片SakuraFisher Scientific: 4689Accu-Edge 低剖面

参考文献

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