通过适当的制备方法，可极大地方便对骨骼肌组织进行结构、功能和生化特性的分析。本方案描述了适用于多种表型研究的骨骼肌组织制备的适当方法。
本文内容
摘要
摘要
骨骼肌因其结构和功能的独特性，需要采用特定的组织采集方案，才能从功能、细胞、分子及病理学评估中获得最佳结果。由于先天性肌肉疾病中某些病理异常表现较为细微，且固定处理可能干扰这些特征的识别，因此在评估先天性肌肉疾病时，优先采用冷冻肌肉而非固定肌肉进行病理学检查。此外，肌肉组织在冷冻过程中容易产生严重的冷冻假象，因此在为组织学检查而冷冻骨骼肌时，必须采取特定预防措施，而这些措施在冷冻其他组织时通常并不常用。本文描述了一种使用液氮冷却的异戊烷（2-甲基丁烷）快速冷冻骨骼肌的方案，以最大限度地保存骨骼肌的形态结构。该方法同样适用于为遗传学或蛋白质表达研究而冷冻的组织。此外，我们已将本冷冻方案整合到一个更全面的流程中，其中还包括组织短期分检的推荐方法，用于（1）单肌纤维功能研究和（2）成肌细胞培养，并着重于以最小工作量完成组织采集并将其转运至专业研究或参考实验室以完成后续分析。总体而言，本文提供了一个如何有效分配新鲜组织以开展多种表型研究的框架，从而为与先天性肌肉疾病相关的病理学研究提供了标准操作流程（SOPs）。
引言
骨骼肌是一种具有独特结构和功能的组织，在评估其病理时可能带来诸多挑战。尽管对大多数组织而言，经甲醛固定和石蜡包埋后进行评估已足够，甚至常常是最优选择，但该过程会导致细胞收缩伪影，从而影响对先天性肌肉疾病关键表型（包括肌纤维大小和形态）的评估。此外，在进行多种组织化学染色（包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、细胞色素氧化酶（COX）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、三磷酸腺苷酶（ATPase）以及油红O染色）时必须使用冰冻肌肉组织，这些染色对于检测诊断多种先天性肌病、线粒体肌病及蓄积性疾病所必需的特定病理异常至关重要。因此，许多用于表征肌肉形态与功能的抗体和分子工具仅针对冰冻组织开发并优化，这进一步限制了固定组织在骨骼肌生物学研究中的应用价值。因此，尽管适当的冰冻处理可能存在技术上的挑战，目前在先天性肌肉疾病领域的大多数临床和科研应用中，已将骨骼肌标本进行冰冻保存作为标准操作流程。
由于骨骼肌在采用不恰当的冷冻方案时，肌纤维内极易形成冰晶，因此其冷冻处理在技术上具有较大挑战性1。大多数情况下，当组织含水量过高或冷冻过程过慢时，会出现冷冻伪影。组织含水量可能因浸泡在液体中而意外增加，例如将肌肉置于生理盐水中运输；或者当组织完全浸入OCT包埋剂中时，也可能破坏冷冻效果。这两种操作均可能导致骨骼肌组织出现严重的冷冻伪影。此外，冷冻过程中若干微小的操作失误，也可能导致冷冻速度过慢，或在正确冷冻后样本发生意外解冻，这些问题同样会干扰病理学评估。
随着骨骼肌疾病新模型和治疗方法的不断开发，采用标准操作程序（SOP）来评估骨骼肌表型及治疗效果将变得愈发重要。对于先天性肌肉疾病的病理学评估而言，这一点尤为关键，因为许多此类疾病中所呈现的细微表型可能因组织制备不当而难以识别。本报告由先天性肌肉疾病联盟发起，旨在建立用于研究先天性肌肉疾病模型的骨骼肌冷冻标准操作程序。
本文所述方案介绍了我们在临床和研究实验室中用于优化冰冻肌肉病理学评估的策略，同时也适用于多种基于蛋白质和遗传学的研究。文中还提供了用于透射电子显微镜检查的骨骼肌标本制备的具体方法。此外，由于对冰冻组织进行单根肌纤维功能检测是可行的2,3，掌握这些技术的专家也提供了有关组织处理最佳方案的详细信息。遗憾的是，无法在预先冰冻的组织上有效建立成肌细胞系，因此本文提出了一种用于肌肉组织短期保存和运输的策略，以便在外部实验室建立成肌细胞培养。总体而言，本文所述方法为肌肉组织的多种病理学、功能学、分子生物学和细胞生物学研究提供了适当的处理指南，无论特定实验室的现场条件如何，均可适用。
方案
使用适当的动物编号和所采集肌肉的标识来标记用于肌肉储存的容器。预先将袋子/容器和器械冷却，以防止组织加入时发生冻融。
1. 肌肉组织采集的研究设计考虑
- 对于肌肉疾病的实验动物（小鼠）模型，应使用整块肌肉进行研究，因为小动物模型通常需要评估整块肌肉，以获得足够的肌纤维样本用于病理学研究。对于肌肉疾病的大型动物（犬类）模型，应使用横截面（横断面）至少为 0.3 x 0.3 cm 或更大的肌肉组织部分。
注意：也可使用核心活检样本，但由于取样问题，可能不适用于初步表征研究。 - 对于涉及肌节的研究，肌节长度的超微结构测量可能构成关键终点指标，并可能需要特殊处理。这通常仅在肌节组分出现异常长度的疾病中具有相关性，例如某些类型的杆状体肌病。一些实验室倾向于在肌肉处于非收缩或拉伸状态下进行固定，而不是在无张力或未拉伸的肌肉上进行此类测量。
- 如果不测量肌节长度，可直接将肌肉组织放入所需的电镜固定液中进行固定（参见试剂），无需预先拉伸肌肉。
- 如果要测量肌节长度，可采用多种方法对肌肉进行预拉伸（参见讨论部分）：
- 使用夹具在动物体内将肌肉保持在其静息张力状态下，从夹具外侧切除肌肉，并立即放入所需的电镜固定液中（参见试剂）。
- 将肌肉从动物体内取出后，将其拉伸至与体内观察到的长度相近的状态，并固定在支撑表面（如软木片）上。
2. 将分离的骨骼肌分割成适合所需研究的片段（图1）
- 对于冰冻肌肉组织学：
- 尽可能包含给定肌肉的大部分组织，以最小化取样偏差（见步骤 1.1），但标本应 <1.5 cm，以避免冷冻伪影。
- 同一研究中所有肌肉应采用相同方式处理，以防止因操作差异导致肌纤维大小出现人为假象。
- 对于电子显微镜（EM）：
- 从样本中切取一块约 0.5 x 0.2 x 0.2 cm 的肌肉条，使样本的长轴与原始肌肉的长轴平行。
注意：固定液无法充分渗透较厚的组织，因此保持标本厚度在 2 mm 或以下对于获得合适的结果至关重要。此外，由于此类微小肌肉片段的方向常难以判断，建议使用能模拟肌肉实际方向的组织片段（即，固定后标本的最长方向对应于肌肉/肌纤维的纵向方向），以在电镜处理过程中尽量减少操作误差和方向混淆。
- 从样本中切取一块约 0.5 x 0.2 x 0.2 cm 的肌肉条，使样本的长轴与原始肌肉的长轴平行。
- 对于细胞培养：
- 所需细胞产量可能影响建立细胞培养所需的肌肉组织量。来自小型动物的单块肌肉（或肌肉部分）可能提供的细胞数量不足，因此如有必要，可合并多个肌肉的组织进行使用。
3. 透射电镜（EM）组织固定与处理
- 取一块最薄处不超过 2 mm 的肌肉组织，直接放入所需的电镜固定液中（参见试剂部分）。
- 固定 2–48 小时后，将肌肉组织转移至电镜固定液缓冲液中（参见试剂部分）。长时间固定（数周或数月）可能导致电镜研究中超微结构细节的丢失。
- 送至电镜核心实验室进行后续处理。
4. 用于组织学、生物化学和分子学研究的肌肉组织冷冻
- 用纸巾彻底按压样本以去除多余的水分，直至组织轻微粘附于纸巾上。样本中过多的水分会在肌肉中产生明显的冷冻伪影。
注意：可通过将组织在婴儿爽身粉中滚动进一步干燥。此步骤通常对肌肉并非必需，除非肌肉曾处于过度潮湿的环境中。 - 在浅型冷冻模具或软木塞底部放置OCT包埋剂（或类似黏合剂如阿拉伯胶），OCT用量仅需足以支撑定向放置的肌肉即可（图2C）。在冷冻前标记软木塞或模具可能有助于样本追踪。
- 小心地将肌肉以所需方向放入模具中，使大部分肌肉突出于OCT之外，以便切片时肌肉不与OCT接触（图2C）。
- 向金属杯中加入异戊烷，使其深度达到约3–4 cm。
- 戴上防冻手套，打开杜瓦瓶盖。
- 将金属杯与液氮接触，使杯外液氮的液面高于杯内异戊烷的液面。容器的摆放方式如图2所示。
- 切勿让液氮进入金属杯内，否则会产生气泡状泡沫，操作不便，且其温度不足以有效冷冻样本。
- 观察异戊烷以判断其是否达到合适温度。在适宜温度下（最佳范围为-140至-149 °C），数分钟后，异戊烷上方的雾气消失，杯底开始形成白色固体颗粒状的冷冻异戊烷，或溶液整体变得类似糖蜜的稠度。若在此前阶段进行冷冻，将导致冷冻伪影。
- 若异戊烷完全冻结成固体，需将其融化并重新冷却至冷冻温度后再使用。
- 使用预冷的镊子将样本连同软木塞/模具浸入异戊烷中约10–20秒。
- 将冷冻后的样本放入预冷的容器中。
- 在转移至-80 °C冰箱前，始终将样本及其容器置于干冰上保存。
5. 如果已冷冻的组织中存在冷冻伪影，可通过以下“解冻再冷冻”步骤改善冷冻伪影的程度
- 从冷冻箱中取出组织块，每次一块，并保持在干冰上。本方案的操作时间至关重要。每次仅 thaw（解冻）和 refreeze（再冷冻）一块组织。
- 将样本从干冰转移至室温环境。
- 若样本包埋于OCT中，需使用解剖刀尽可能彻底地去除周围的OCT包埋介质。
- 让样本在室温下完全解冻，但避免过度干燥。
- 使用镊子轻轻探触样本，确认其已完全解冻，再进行下一步操作。
- 按照步骤4.1–4.10中的规定冷冻肌肉组织。
6. 剥离单根肌纤维功能检测的肌肉制备
- 肌肉的保存方法取决于肌肉/肌纤维用于实验的时间。
- 若在几周内使用，将肌肉置于50%甘油/50%松弛液（见试剂）中，于-20 °C保存。
- 若在几周后使用，将肌肉置于75%甘油/25%松弛液（见试剂）中，于-80 °C保存。
- 或者，让肌肉自然干燥，固定于软木上，并在-80 °C条件下用硅胶颗粒保存。这些脱水肌肉可长期使用数年。
7. 向外部实验室运送细胞培养物时新鲜肌肉的制备
关于细胞培养建立的方案已在其他文献中有详细描述4-7。
- 用无菌完全培养基填充一个50 ml无菌锥形管。
- 使用无菌镊子将肌肉组织加入管中，确保组织完全浸没在培养基中。
- 用培养基填满管的剩余部分，以防止运输过程中干燥。
- 在泡沫箱中放入冰袋，并将锥形管放置在多个冰袋附近。
- 请注意，仅可使用冰袋（不可使用干冰），以避免液体和组织因冻结而受损。
- 样品需以过夜方式寄送，但在上述条件下组织可存活2天。
结果
为了展示不当冷冻所导致的组织假象，本研究采用不同冷冻技术处理了几例小鼠股四头肌（图3），以模拟实际操作中常见的错误。如图3A所示，正确冷冻的骨骼肌组织中，肌纤维与周围组织（通常为其他肌纤维，但在多种疾病或损伤过程中，肌纤维间的内膜间隙可能被纤维化组织或炎性细胞填充）紧密贴合，且胞质区域清晰可见。在病理学分析中，观察细胞内结构的能力通常比观察内膜间隙更为重要，因为明确识别该区域内是否存在变性改变、再生改变或其他特征性病理发现（如中央核、细胞内包涵体）往往是诊断的关键。因此，细胞内出现冰晶会严重影响肌肉组织的病理学评估。
肌肉组织的适当冷冻需要足够低的温度和足够的冷冻速度，以避免冰晶的形成。即使在考虑了这两个因素的情况下，由于肌肉组织内部水分过多，仍可能出现明显的冷冻伪影。这一问题最常出现在先前浸泡于生理盐水且未充分干燥的肌肉组织中，或在切片部位肌肉与OCT包埋介质直接接触的情况下。图 3B，3E）。尽管在包埋过程中通常难以完全避免与OCT接触，但应尽量避免组织学评估区域与用于包埋的OCT发生接触。相比之下，采用-80 °C 冷冻机（图3C）和液氮（图3D) 提供了因冷冻温度或冷冻速度不理想而产生的冰冻伪影示例。当将组织置于 -80 °C 冷冻机提供了一个冻存伪影的极端示例。使用液氮时，主要问题是液氮与组织接触会在组织-液体界面处形成一层气态氮鞘，而该气态界面温度不够低，无法实现肌肉组织的快速冷冻1这可能导致标本表面出现明显的冷冻伪影，但标本内部区域更有可能以适当的速率实现速冻，从而完全避免冷冻伪影。尽管将肌肉组织直接浸入液氮中的方法远不如异戊烷冷冻法有效，但在缺乏异戊烷的情况下（例如不具备临床肌肉病理学实验室的医疗机构中的临床尸检标本），该方法可用于大块肌肉标本的冷冻。使用该策略时，采用较大组织块通常可获得更理想的结果（>2 cm 的多个维度）。
尽管避免冰冻伪影可获得最佳的组织学结果，但目前已开发出一种（下文所述的）技术，可显著逆转冰冻伪影，从而允许对不当冰冻的组织进行评估。不当冰冻的组织（图3E）可在严格控制的条件下解冻并重新冰冻（图3F），以促进水分在肌纤维内的重新分布，所达到的形态学保存程度可以非常理想。根据我们的经验，该过程可在很大程度上保存组织的细胞内形态，但常导致肌内膜间隙内肌纤维出现人为分离。由于多数病理学观察终点位于细胞内，而位于肌内膜间隙的病变通常需借助特殊染色（用于突出显示纤维化或识别其他细胞类型）才能最佳观察，因此这些人为改变不太可能真正影响对肌肉组织的病理学评估。
图 1. 骨骼肌组织用于结构、功能和细胞研究的分类处理。 根据所需研究类型，采集的骨骼肌组织可通过多种方式进行处理，以获得最佳结果。本文所述方案介绍了将骨骼肌样本进行分类或处理以用于异地研究的方法，从而优化专家核心设施可获得的研究结果。
图 2. 用于肌肉组织冷冻的装置示例。 如实验方案所述，最佳的肌肉冷冻需要将肌肉组织浸入处于其冰点温度的异戊烷中。一种安全且高效地获得冰冻异戊烷的方法是使用金属容器盛装异戊烷，并将该容器置于装有液氮的杜瓦瓶内进行冷却。为便于双手操作，可使用支架（如铁架台（A））将异戊烷容器固定在液氮中，以防止两种液体混合。或者，也可手动将容器保持在液氮中（B）。无论采用哪种方式，都必须等到异戊烷在容器底部明显开始结冰（通常呈现为不透明的白色小颗粒）后，再将组织放入异戊烷中浸没 10–20 秒，以确保组织完全冻结。当异戊烷处于结冰温度时，产生的“雾气”极少（即，若出现大量雾气，则说明温度未达要求）。组织冻结后，应立即将其直接放入预冷的储存容器中（随后立即放入低温容器或冰箱），以防止冷冻后意外解冻。（C）正确包埋的冷冻肌肉组织，其大部分肌肉部分应从冻结的OCT包埋剂基底中突出。
图 3. 冷冻伪影及有效解冻/再冷冻的示例。 代表性图像显示：(A) 使用异戊烷适当冷冻的肌肉组织，(B) 使用异戊烷适当冷冻但与OCT包埋介质接触的肌肉组织，(C) 在-80 °C冰箱中冷冻的肌肉组织，以及(D) 在液氮中冷冻的肌肉组织，这些样本均表现出不同程度的冷冻伪影。如图(B)所示，OCT介质含水量较高，与之接触的肌肉组织会产生明显的冷冻伪影，因此仅应使用固定所需的最少OCT量，并且用于组织学评估的肌肉组织应“突出于”其表面。使用(C) -80 °C冰箱或(D) 液氮进行冷冻的过程较慢（相对于冰冷异戊烷的冷冻速度），可能导致显著的冷冻伪影。图中E和F显示来自同一标本的肌肉组织，其中(E) 初始冷冻不理想（由于与OCT过度接触），随后(F) 采用本文所述方法进行解冻和再冷冻。尽管在再冷冻样本中仍可观察到肌纤维之间存在一定程度的人工分离，但肌纤维内部形态的改善显而易见。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
骨骼肌是一种结构和功能独特的组织，需要采用专门的制备流程，才能对结构和功能参数进行最佳评估。尽管在临床和科研中，多种组织通常通过冷冻方式保存以用于病理学研究，但非肌肉组织的冷冻方案通常涉及在冷冻前将组织完全浸入OCT包埋剂中。如图3所示，此类方案并不适用于骨骼肌的病理学评估，但由于与本文所述方案相似，此类错误在实践中较为常见。本文旨在提供一种简明的标准化操作流程，以正确处理肌肉组织，避免此类问题的发生。此外，本文还汇总了针对异地开展生理学和细胞学研究时肌肉组织正确处理的建议，旨在协助外部核心实验室在无法或不宜进行现场研究的情况下，获取高质量的实验数据。
如本方案所述，肌肉组织进行病理学研究时正确处理的关键要素包括：尽量减少组织中的水分含量、降低肌肉冷冻温度，以及提高冷冻速度。组织内水分过多或冷冻过程过慢（由温度不足或冷冻介质与组织之间缺乏直接接触引起，例如使用液氮时常见的情况）将导致冷冻伪影，从而影响病理分析。由于OCT包埋剂会额外引入组织水分，许多实验室采用其他黏合剂（如黄蓍胶）作为包埋基质。即使在正确执行冷冻的情况下，也应注意避免标本与室温容器或器械接触而导致意外解冻。因此，成功的冷冻过程需要事先规划，包括将所有拟使用的器械和容器预先冷却。当出现冷冻伪影时，本文描述了一种可恢复组织状态的方法，其质量足以满足大多数病理学评估需求。然而，这种冻融循环无法获得理想的组织学效果，并可能影响组织的其他分子或酶学研究（此外还需耗费重新冷冻的时间），因此，采用恰当的初始冷冻操作远为理想。但在遇到预先冷冻组织存在冷冻伪影的情况下，本文所述技术可极为实用。
用于电镜（EM）的组织固定与处理可能带来特定的技术挑战，需在组织采集前进行周密规划。采集电镜标本时最常见的错误是使用过厚的组织块，导致戊二醛无法充分渗透。由于戊二醛对肌肉组织的渗透深度约为从任一表面向内0.1 cm，因此应确保电镜样本在一个维度上的厚度不超过0.2 cm。此外，由于电镜是直接评估收缩装置的优良手段，一些研究者已开发出在固定前对肌肉进行预加张力或预拉伸的策略，以便在生理相关的张力条件下测量收缩元件。目前尚无统一的预加张力标准方案，但本方案中简要描述了两种策略。需要注意的是，除非以非常特定的方式操作，否则尝试对肌肉进行预加张力可能导致结果不可预测；为避免因非标准的预加张力操作引起肌节长度的人工假象，可能更宜将肌肉固定于松弛状态8,9。对于无需此类特定测量的肌肉（包括大多数用于临床目的的活检），通常不进行预加张力处理，其主要影响是导致肌肉中肌节间距不均匀。
本文是系列论文中的首篇，旨在为先天性肌肉疾病领域的检测提供标准操作程序（SOP）。该工作汇集了20多位在先天性肌肉疾病领域长期从事细胞、分子、功能、生理及病理学研究的专家的共同努力。在未来一年内，将陆续发布一系列已发表的标准操作程序，各项必要的实验方案及其适当的发表格式已在2013年4月于美国华盛顿特区举行的先天性肌肉疾病联盟研讨会上进行了讨论。本SOP工作的目标是为先天性肌肉疾病领域的样本检测与分析提供指导路线，以实现两个目的：1）尽可能地标准化本领域所采用的研究方法和终点指标；2）为新进入本领域的研究人员提供标准操作实践的指导。我们相信，这些资源将有助于吸引更多研究人员进入这一尚待深入研究的领域，从而拓展可开展的研究范围。此外，研究方法的标准化将极大地方便不同研究间的数据比较，并在设计和实施临床前及临床试验时有助于确定终点指标。
尽管本文的主要关注点是与多种研究相关的组织冷冻和制备的适当方法，我们的合作团队也讨论了肌肉标本病理分析中有用的终点指标。目前，在进行病理分析时应采取何种方法尚无官方共识，研究人员通常采用多种不同的研究手段，将新发现与各自疾病领域的既往文献进行关联。因此，我们认为提出一些关于肌肉病理学表征中病理终点规划的通用指南将是有益的。在对研究中的病理变化进行量化之前，应充分考虑以下四个方面：1）肌纤维大小的测量方法；2）是否存在肌纤维类型特异性的异常或治疗效应；3）异常或效应是否局限于特定肌肉；以及4）针对所研究疾病的特征性病理改变的量化策略。肌纤维大小是大多数研究中必需的终点指标，但遗憾的是，其量化方式存在广泛差异。许多研究使用专有成像软件提供的自动量化方法报告结果，但这些程序往往采用简化假设（例如将肌纤维视为圆形或椭圆形），可能导致自动测量结果不准确。因此，在信赖这些自动测量数据之前，必须了解这些程序的测量原理，我们鼓励研究人员在论文的方法部分详细说明所用方法。此外，用于表示肌纤维大小的具体测量参数差异极大，其中某些参数优于其他参数10,11。一种常用的肌纤维大小测量指标是肌纤维横截面积（CSA），特别是因为进行生理学研究的研究人员通常将其结果标准化为仪器测得的CSA值。然而，尽管CSA在理想的横切面上能准确反映肌纤维大小，但它高度依赖于肌纤维的取向（纵向或斜向切片的纤维会人为地表现出较高的CSA值），因此并非理想的肌纤维大小测量指标。相比之下，对横截面积依赖性较小的更优测量指标是最小费雷特直径（MinFeret直径），即肌细胞短轴方向的测量值12。该测量值对肌纤维取向的依赖性较小，通常是临床肌纤维测量的金标准，我们建议研究人员逐步采用这一技术。这些测量通常可使用生成CSA数据的相同软件完成13，也可手动直接测量。在根据肌纤维类型、特定肌肉以及与特定疾病相关的病理发现来评估病理数据时，这些问题争议较少，但在研究设计阶段仍应予以充分考虑。肌纤维类型可通过免疫组织化学或ATP酶染色进行评估，但需注意不同特定肌肉和动物物种具有不同的纤维类型组成（因此需要不同的预期和检测策略）。特定肌肉的病理受累或治疗效果可能存在差异，通过比较实验组与对照组的总肌肉重量，可在决定病理评估肌肉之前识别疾病异质性的程度。最后，众所周知，许多肌肉疾病与特定的病理异常相关（如肌原纤维性肌病中的杆状体）14,15，因此在分析过程中也应考虑这些异常是否呈现肌纤维类型特异性或肌肉特异性的分布模式16,17。总体而言，我们并不主张为肌肉评估制定一套僵化的标准，但我们确实认为，在开展任何骨骼肌疾病的病理学研究之前，应充分考虑上述各项因素。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本出版物由Cure CMD、法国肌肉疾病协会（AFM）资助（项目编号16297）以及美国国立卫生研究院资助（资助号K08 AR059750和L40 AR057721）。我们还要感谢Julie Tetzlaff博士在修订本稿件过程中提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于组织冷冻 | |||
| 带液体输出装置的液氮罐 | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | 可使用其他任何液氮罐替代。 |
| 导冷容器 | Fisher | 02-583A | |
| 可盛装液氮的宽口保温容器 | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 热电偶温度计 | Thomas Scientific | 1228Y01 | 可选，但可用于准确判断异戊烷的冻结点。 |
| 用于单根肌纤维功能检测 | |||
| 培养皿 | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| 硅胶涂层 | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| 解剖体视显微镜 | Harvard Apparatus | 693101 | 可使用其他任何解剖显微镜替代。 |
| 用于细胞培养 | |||
| 无菌层流罩 | Thermo Scientific | 51022485 | 可使用其他任何细胞培养罩替代。 |
| 用于组织冷冻 | |||
| 塑料袋/容器 | Nasco | B01009WA | |
| 耐热手套 | Denville | G4162 | |
| 面罩 | Fisher Scientific | S47640 | |
| 长镊子 | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| 标记笔 | Staples | 125328 | |
| 用于细胞培养 | |||
| 无菌50 ml锥形离心管 | Denville | C1060-P | |
| PES滤器单元，500 ml，0.22 µm | Denville | F5227 | |
| 无菌镊子 | Fisher Scientific | 644320 | |
| 冰袋 | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| 保温泡沫箱 | Polar Tech | 207F | |
| 封箱胶带 | Staples | 795570 | |
| 组织冷冻 | |||
| 液氮 | Airgas | NI NF160LT350 | 将液氮储存在专为低温液体设计的容器中 |
| 异戊烷（2-甲基丁烷） | Sigma | M32631-4L | 将异戊烷 储存于易燃品柜中。 |
| 电镜固定液（任选一种） | 未含固定剂的缓冲液也应准备，因电镜固定的组织若不立即进行电镜处理，应在数小时或数天后从固定液转移至缓冲液中。 | ||
| 0.1 M 醋酸镉缓冲液中的 2.5% 戊二醛 | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky固定液（0.1 M 磷酸盐缓冲液中的3%戊二醛 + 2%多聚甲醛） | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| 用于功能研究（如需要） | |||
| 松弛溶液，含（单位：mmol/L） | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-丙酸盐 | 通过将丙酸（Sigma P1386）与KOH（Fisher P250）按1:1混合配制溶液 | ||
| 15 磷酸肌酸，pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 抑肽酶 | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| 透化溶液，含 | |||
| 松弛溶液（见上文） | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 指示型硅胶颗粒 | |||
| 软木片（1 x 1 英寸） | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| 甘油 | Sigma | G2025 | |
| 用于细胞培养（如需要） | |||
| 完全培养基，含（500 ml） | 通过500 ml 0.22 µm PES滤器单元过滤溶液进行灭菌。 4°C保存，一个月内使用。 | ||
| 395 ml 高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM） | Sigma | D5671 | |
| 100 ml 胎牛血清（FBS） | Sigma | F6178 | |
| 5 ml 100X 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG） | Sigma | G1146 | |
| 请查阅所有其他试剂的材料安全数据表（MSDS）以了解储存要求 |
参考文献
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