一种新型声带生物反应器被构建并表征，该反应器能够向培养细胞施加生理相关的振动刺激。该动态培养装置与纤维状聚（ε-己内酯）支架构建出一种模拟声带的微环境，可调控间充质干细胞的行为。
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摘要
摘要
体外 构建力学活性组织需要向培养细胞提供符合生理条件的力学环境。为模拟声带的动态环境，本研究设计并表征了一种新型声带生物反应器，该装置能够产生基频发声频率范围内的振动刺激。该设备由信号发生器、功率放大器、扬声器选择器以及多个并联的振动腔室组成。每个振动腔室通过将定制的硅胶膜夹在一对丙烯酸块之间而构成。该硅胶膜不仅作为腔室的底部，还提供了固定细胞接种支架的机制。安装在底部丙烯酸块下方的扬声器产生的振动信号，通过振荡气流以空气动力学方式传递至膜结构。八个相同的振动模块固定在两根静止的金属杆上，并置于防潮密闭箱内，以确保在细胞培养孵育箱中长期稳定运行。采用激光多普勒测振仪（LDV）对声带生物反应器的振动特性进行无损分析。通过在200 Hz正弦振动、膜中心位移为40 µm的条件下培养细胞构建物，验证了该动态培养装置的功能。间充质干细胞在生物反应器中对振动信号产生响应，改变与声带相关的细胞外基质成分的合成与降解。本文所介绍的新型生物反应器系统提供了一个优异的 体外 用于研究振动诱导的机械转导以及功能性声带组织工程的平台。
引言
人类声带由上皮层、固有层（LP）和声带肌组成，是一种特殊的软组织，可将来自肺部的气流转化为声波以产生声音。1 在正常发声过程中，声带会规律性地振动，其应变可达30%，基频范围为100–300 Hz。2 成人声带固有层为一种梯度结构，由浅层（SLP）、中层（ILP）和深层（DLP）组成。进一步的分类将上皮层和浅层固有层归为黏膜层，而将中层与深层固有层合并为声带韧带。3 浅层固有层主要包含无定形基质及稀疏分布的胶原纤维，而声带韧带则富含成熟的胶原纤维和弹性纤维，以提供足够的强度。4 新生儿声带的结构与力学特性与其成熟状态存在显著差异。尽管调控声带发育与成熟的具体机制尚未完全阐明，但实验证据已表明发声所引起的机械应力在其中起着决定性作用。
多种医学状况，包括发声滥用、感染、化学刺激物以及外科手术，均可能损伤声带。据估计，声带疾病影响了美国3%至9%的人口。目前对声带疾病的治疗方法有限5，而基于干细胞的组织工程技术已成为恢复声带功能的一种有前景的策略。间充质干细胞（MSCs）是声带组织工程中替代原代声带成纤维细胞的合适选择6-9。干细胞命运的决定及其后续的组织发育受到其所处特定微环境的调控，其中力学条件是一个关键因素10。机械力是组织形态发生和稳态的重要调节因子，尤其对于经常承受机械负荷的组织而言更是如此11。....
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方案
1. 生物反应器组装（视频 1）
- 使用预先确定内径和外径的铝制模具（圆形冲模 + 间隔销）（图 1）。
- 利用步骤1.1中的模具，使用市售硅胶弹性体试剂盒制备一片硅胶膜（直径：42 mm，厚度：1.5 mm，图 1），膜中央带有一个嵌入式套管（直径：12 mm，厚度约0.25 mm，由图1中的间隔销成型）。
- 制作一对丙烯酸块（图 2（4, 5）），中间设有圆形开口（直径：24 mm），并在顶部块体（厚1.8 cm）和底部块体（厚0.9 cm）上雕刻相互匹配的凸脊与凹槽。10
- 将硅胶膜夹在成对的丙烯酸块之间，使用设定为恒定扭矩（35 cN·m）的微型扭矩螺丝刀通过四个角上的螺丝固定组件。由此形成一个密封的振动腔，宽度为24 mm，深度为18 mm（图 2C）。
- 通过底部丙烯酸块上的另一组角螺丝，将一个3” 扩展范围迷你低音扬声器（图 2D，8 Ω/20 W）安装在振动腔下方。至此，单个振动模块组装完成。
- 再复制七个相同的振动模块。将其中四个模块固定在两条固定的铝条（40 cm × 10 cm × 2.5 cm）之一上，方....
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结果
通过静电纺丝制备的PCL支架含有微米级的间隙孔，纤维随机缠结，平均直径为4.7 µm（图4A）。在更高放大倍数下，可在单根纤维上观察到纳米级的沟槽和孔隙（图4B）。用纤连蛋白包被支架可提高其亲水性，并促进细胞在PCL支架上的初始黏附与铺展（未发表观察结果）。
具有所需频率的正弦波形（f, 100-300 Hz）和电压（Vpp：0-0.125 V）施加到每个振动腔下方的扬声器，驱动硅胶膜底部与微型低音扬声器纸盆之间的封闭空气产生振荡。该空气振荡传递至含或不含细胞的PCL支架。采用LDV分析支架在特定条件下的振动特性 f 并考虑水的折射率（1.33）对Vpp的影响。20 图 5 显示法向位移（w0) 作为 Vpp 的函数，在 PCL 支架中心处 和 f振动频率的选择旨在反映人类语音的基本频率。21 w 之间存在线性关系0 且.......
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讨论
成功构建功能性声带组织 体外 需要重建类似声带的微环境，以调控多能细胞的行为。通常认为，组织或器官的结构反映了其所需执行的功能。22 对于声带组织，发声过程中产生的高频振动被认为对组织成熟具有重要作用。在本研究中，采用聚己内酯（PCL）支架以提供类似韧带的结构支撑，同时设计声带生物反应器，用于向培养的间充质干细胞（MSCs）施加生理相关的机械信号。本文所述的生物反应器（J2）通过独立的扬声器以电磁方式产生振动，并通过空气动力学方式将能量传递至培养的细胞。与我们之前的设计相比，18 当前系统将振动刺激源直接移至每个样品孔下方，从而实现了更高效的能量转换。因此，使用当前系统可获得显著更大的法向位移和更高的加速度。模块化设计还最大限度地减少了不同振动腔室之间的系统差异和机械干扰。
我们的设计依赖于硅胶膜来传递振动信号，因此保持膜的完整性和均匀性至关重要。将前驱体溶液倒入铝制模具后，可通过移动玻璃片刮过模具表面，以去除多余的液体。通过降低固化温度并延长固化时间，可制备出无夹杂气泡的一致性膜。此外，可使用70%乙.......
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披露
不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢 Jeffrey Caplan 博士在共聚焦成像方面的培训与指导。同时感谢 Keck 电子显微镜实验室及 Chaoying Ni 博士在扫描电镜方面的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIDCD，R01DC008965 和 R01DC011377）资助。ABZ 感谢美国国家科学基金会整合型研究生教育 & 研究培训计划（IGERT）项目提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硅胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | Sylgard 184 | 在 100 °C 下固化膜 2 小时 |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~80 kDa，过夜溶解 |
| 氯仿 | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 人骨髓来源间充质干细胞（MSCs） | Lonza | PT-2501 | 第 2 代传代后接收 |
| MSC 维持培养基 | Lonza | PT-3001 | 基础培养基中含 10% FBS，并补充 L-谷氨酰胺、庆大霉素和两性霉素 |
| 细胞解离试剂 Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| 乙醇 | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| 纤维连接蛋白 | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA 试剂盒 | R&D systems | DY901 | |
| 透明质酸（HA）ELISA 试剂盒 | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| 碘化丙啶 | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect 反转录试剂盒 | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR 主混合液 | Life Technologies | 4309155 | |
| 替换扬声器 | DAYTON audio （通过 Parts Express） | DS90-8 | 纸锥，全频段（80–13,000 Hz），85 dB |
| Ergo 微扭矩螺丝刀 | Mountz | # 020377 | 扭矩范围：20–120 cN·m |
| 立体声扬声器选择器 | RadioShack | 40-244 | 最大功率承载 50 W |
| 函数发生器 | Agilent | 33220A | 频率范围：1 µHz–20 MHz |
| 功率放大器 | PYLE audio | PylePro PT2400 | 频率响应：10 Hz–50 kHz，双扬声器 通道 |
| 细胞培养箱 | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| 注射泵 | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 高压电源 | Spellman | CZE 1000R | 输出电压：0–30 kV |
| 扫描电子显微镜 | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| 台式金溅射镀膜仪 | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| 多普勒激光测振仪 | Polytec | PDV-100 | 非接触式速度测量（0–22 kHz） |
| PCR 序列检测系统 | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| 多光子共聚焦显微镜 | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| 紫外-可见分光光度计 | NanoDrop Products 通过 Thermo Scientific | ND-2000 | |
| VibSoft 数据采集软件 | Polytec | 采集带宽最高达 40 MHz | |
| Origin 8.5 数据分析软件 | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR 数据分析软件 | Biogazelle | V2.3 | |
| 铝合金 | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| 丙烯酸块 | McMaster-Carr | ||
| 聚碳酸酯防潮培养室 | McMaster-Carr | 抗冲击 聚碳酸酯 | |
| 螺丝 | McMaster-Carr | ||
| 电子电缆/导线 | |||
| 医用级 PVC 管 | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | 透明，生物相容性 |
| 10 ml 注射器 | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G 钝头针 | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" 长度 |
| 鳄鱼夹适配器 | RadioShack | 270-354 | 完全绝缘 |
| 8 mm 活检打孔器 | Sklar 外科器械 | 96-1152 | 无菌，一次性使用 |
| 12 mm 活检打孔器 | Acuderm（通过 Fisher Scientific） | NC9998681 | |
| 组织培养瓶 | Corning | 细胞培养处理 |
参考文献
- Titze, I. R. Mechanical-Stress in Phonation. J. Voice. 8, 99-105 (1994).
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D.
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