感觉运动皮层损伤后小鼠缺血性卒中模型中的代偿性肢体使用及运动技能学习的行为评估

摘要

小鼠模型在行为神经科学研究中日益受到关注。随着模型的发展，开发针对小鼠的敏感行为检测方法变得尤为重要。本实验方案描述了“意大利面矩阵取物任务”（Pasta Matrix Reaching Task），这是一种用于脑卒中小鼠模型的精细运动技能任务。

摘要

小鼠模型在行为神经科学领域，特别是在实验性脑卒中研究中，日益受到关注。随着模型的不断进步，开发针对小鼠的敏感行为测量方法变得尤为重要。本实验方案描述了一种适用于小鼠脑卒中模型的精细运动任务。意大利面矩阵取物任务（Pasta Matrix Reaching Task）是一种多功能且敏感的行为检测方法，使研究者能够准确收集行为结果数据，并调控肢体使用，以模拟人类临床现象，如代偿策略（即，习得性废用）和集中的康复训练。当与神经解剖学工具结合使用时，该任务还允许研究人员探索脑卒中后功能行为恢复（或恢复失败）的潜在机制。该任务设置和实施简单且成本低廉，为研究损伤后功能结局的多种科学问题提供了丰富的训练和测试选择。尽管该任务已应用于小鼠脑卒中模型，但在其他上肢损伤模型的功能结局研究中也可能具有重要价值。

引言

小鼠模型由于其操作便捷、成本较低，以及存在适用于in vivo成像等多种应用的转基因品系，近年来在实验性卒中研究中日益受到青睐。随着实验模型的广泛应用，人们对开发敏感的行为学评估方法以检测损伤后功能结局的兴趣也不断增长^1-7。建立模拟人类卒中幸存者康复和代偿策略的动物训练方案，有助于将实验动物研究的结果更有效地转化为临床应用⁸。 Pasta Matrix 捉取任务（PMRT）中的运动技能训练已被证实是一种对感觉运动皮层缺血性损伤后运动功能结局具有高敏感性的行为学评估方法³。

脑卒中研究的主要关注点之一是康复，以及促进损伤后功能恢复的行为策略的开发与理解。目前，人类采用的康复策略只能实现不完全恢复⁸。此外，康复治疗师必须应对脑卒中幸存者在恢复过程中形成的代偿性行为策略，这些策略可能妨碍其充分恢复受累肢体的功能。例如，在影响上肢功能的单侧脑卒中后，人类倾向于依赖受累程度较轻的肢体^{9, 10}。尽管这种对患肢的习得性废用在短期内可提高个体的功能能力，但动物模型研究表明，这可能会限制患肢最终的功能恢复潜力^11-13。动物研究的这些发现有助于推动人类约束诱导运动疗法的发展与应用¹⁴。动物模型有助于改进康复策略，使研究人员能够探索支持和促进功能恢复的神经生物学机制。除了作为评估脑卒中后功能的有效行为检测手段外，前肢运动再训练测试（PMRT）已被确立为一种有效的康复策略，可促进感觉运动性脑卒中后的功能改善¹⁵。PMRT还可有效模拟患肢的习得性废用，从而为研究可能改善功能恢复的行为干预措施提供依据，即使在早期过度依赖非受累肢体的情况下亦然¹³。

PMRT的构建方法此前已有描述 ³。简而言之，抓取室由四块聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）壁组成（高20 cm，长15 cm，宽8.5 cm），顶部和底部敞开。在抓取室前壁底部中央设有一条狭缝（高13 cm，宽5 mm），作为抓取孔（图1A）。意大利面基质是一个高强度塑料块（长8.5 cm，宽5 cm，高1.5 cm），其上沿整个厚度方向钻有直径1 mm的孔洞。孔洞总数为260个，从靠近抓取窗口2 mm处开始排列，每两个孔之间相距2 mm（图1B）。该意大利面基质的设计使得干燥的、垂直放置的意大利面条能够贯穿基质平台的整个厚度，约有一半长度的面条暴露在外。应裁剪一块适当大小的可拆卸透明塑料片或卡纸，并牢固地粘贴在基质下方。这可以防止在搬运过程中意大利面条从基质中掉落，同时便于清除断裂的面条碎片。

PMRT 是一种多功能且灵敏的行为检测方法，可让实验人员准确收集结果数据，并操控肢体使用以模拟临床现象。作为一种行为结果评估指标，PMRT 能够提供比传统的梗死体积测量更准确反映康复策略有效性的行为数据^{3, 16}。作为一种行为干预手段，PMRT 可使实验人员控制小鼠上肢的使用，以模拟临床康复过程（i.e. 受累肢体训练）或习得性废用（i.e. 较少受累肢体训练）。当与神经解剖学方法结合时，PMRT 为研究人员提供了探索卒中后代偿性肢体使用所引发的功能行为恢复或适应不良性可塑性相关机制的机会。PMRT 还可进一步应用于其他小鼠脑损伤和上肢功能障碍模型，例如创伤性脑损伤。PMRT 的另一优势在于其经济性。该任务所需设备可在实验室内以相对低廉的成本自行构建，数据采集不需要大量空间或资金投入，且操作简便，本科生即可可靠地完成数据收集。此外，PMRT 对即使轻微的行为缺陷也具有高度敏感性^{3, 13}。本方案提供了一种简单而有效的方法，用于在已建立的小鼠卒中模型中评估运动技能学习、促进损伤后的行为恢复，并模拟习得性废用现象。

方案

以下方法均符合德克萨斯大学奥斯汀分校和伊利诺伊卫斯理大学动物护理与使用委员会批准的方案。 建议研究人员在对任何实验动物进行行为训练时佩戴手套或采取适当的预防措施（操作前后洗手）。在为动物实施手术做准备以及手术过程中，必须佩戴手套。

1. 习惯化与食物限制

注意：由于 PMRT 是一种趋近性任务，建议在训练开始前限制动物的进食量和进食时间，以激发其抓取反应，并防止在训练过程中出现饱足现象。

1. 在开始任务训练前至少一周，将小鼠置于限制性喂食计划中。在开始食物限制之前称量每只小鼠的体重，以确定自由进食状态下的体重，该体重定义为每只动物在限制喂食第一天的体重。
   1. 每天喂食一次，每只小鼠每日给予约 2.5 g 标准啮齿类动物饲料（例如，若一个笼子中饲养 4 只小鼠，则该笼子每日共给予 10 g 饲料）。确保每天在同一时间进行喂食，最好安排在每日训练结束的时间点。
   2. 定期称量动物体重，确保任何小鼠的体重下降不超过其自由进食体重的 10%。注意：应根据体重变化相应调整每日食物供给量，以维持适当的体重。小鼠在成长过程中通常会增重，即使食物摄入量保持恒定。在整个 PMRT 训练与评估期间，小鼠均需持续保持食物限制。
2. 在正式训练前数次于小鼠的饲养笼中提供较短的意大利面片段（切成 1.6 cm），以克服其新奇恐惧反应。注意：通常暴露 5–10 天即可，每次每只小鼠提供约 4 段面条。
3. 使用剃刀片将意大利面切割至所需尺寸（3.2 cm）。注意：建议在开始当天训练前预先切割足量的面条，并将未使用的部分储存在密封容器中。实验中使用 Capellini 型意大利面填充矩阵。由于不同品牌的面条在质地和直径上存在差异，可能影响面条在矩阵中的稳定性或小鼠折断面条所需的力量，因此建议在整个训练和测试过程中统一使用 DeCecco 品牌的面条。
4. 将未煮过的 Capellini 意大利面片段放入面条矩阵中，填满矩阵中的所有孔位（图 1A）。
5. 让小鼠适应测试装置，将一个完整的面条矩阵放置在装置前方（图 1A），并在测试装置底部放置若干段可供食用的面条。适应过程共进行 3 次，每次 5–10 分钟。注意：在适应训练期间不应鼓励小鼠伸手获取面条。小鼠通常会通过装置上的开口嗅闻位于取食室外的面条，表现出初步兴趣。如有需要，可在同一装置中同时进行两只同笼小鼠的适应训练，但后续的塑形和正式训练必须单独进行。 每次放入或取出动物前后，所有表面均应使用 70% 乙醇或类似的无害消毒溶液彻底清洁。

2. 调控活动范围

1. 通过连续3至5天、每天一次的塑形训练，确定每只动物的偏好肢体。允许小鼠抓取10分钟，或总共抓取10次，以先达到者为准。
   1. 将小鼠单独放入测试箱内，箱前放置完整的意大利面矩阵，如同习惯化训练阶段（图1A）。
   2. 记录每只肢体的抓取次数，分别标注右侧和左侧肢体的抓取次数。定义一次抓取为肢体穿过抓取孔，且腕部突破测试箱平面的动作；抓取无需朝向或实际接触意大利面。
2. 对于不愿主动抓取的小鼠，可将数根意大利面从抓取孔稍伸入箱内以诱导其抓取行为。当小鼠表现出兴趣（例如嗅闻、啃咬）时，将意大利面缓慢抽出，从而诱导其追向后退的意大利面进行抓取。若小鼠最初对干意大利面无兴趣，可将意大利面末端浸入少量温水中湿润，以提高其适口性。
3. 当某只小鼠在单日内使用某一肢体完成至少70%的抓取动作时，即可确定其肢体偏好。避免过度塑形，因为这可能限制后续训练阶段中抓取任务的学习表现¹⁷。一旦完成塑形，即可开始PMRT训练。注意：训练最早可在次日开始，但在塑形与训练之间间隔数日亦可接受。

3. 抓取训练

1. 每天在损伤前对小鼠进行一次训练，以使其熟练掌握PMRT。注意：每次试验由观察者记录，最长持续15分钟或共计100次抓取，以先达到者为准。 （以先达到者为准）。训练小鼠仅使用其优势肢体进行抓取。若需要更密集的训练方案，小鼠每天可耐受两次训练试验。 ¹⁸.
   1. 将小鼠放入测试箱中，前方放置一个半满的矩阵图1B）。通过仅填充偏好 limb 对侧的矩阵区域来训练小鼠仅使用其偏好 limb 进行抓取，因为小鼠会跨越身体中线进行抓取。不填充与非偏好 limb 对应的矩阵区域，以阻止小鼠尝试使用该 limb 抓取（由于无法触及意大利面，此类尝试不会成功），并鼓励其仅使用偏好 limb 进行抓取。
2. 在训练初期，当意大利面位于基质中时，可对其施加轻微压力，以帮助小鼠成功折断面段。切勿为小鼠折断意大利面。实现方法是将一至两段意大利面轻轻置于预期抓取目标的后方，并与之垂直固定。这种轻微的支撑有助于稳定细长且柔韧的意大利面，因其在小鼠初始学习阶段较难抓握。
3. 记录总抓取次数、成功抓取次数以及成功抓取的位置。成功抓取的定义为：小鼠穿过孔洞，抓取一段意大利面，并将其折断以从基质中取出。注意：在试验结束前，不应将意大利面重新放入基质中。训练初期，小鼠折断的意大利面数量可能较少。
4. 让小鼠在PMRT上训练至熟练水平，熟练标准定义为至少连续3天（最多5天）表现稳定（每天折断至少9根意大利面，且每日折断数量相差不超过2根）。通常需要15至20天才能使年轻成年小鼠达到熟练水平。

4. 较少受影响肢体的训练

1. 训练受累较轻的肢体（即，从缺血性损伤对侧优势前肢运动皮层后的第四天开始（参见 图2 为明确受影响/偏好侧肢体与较轻受影响/非偏好侧肢体，每日进行一次15分钟或100次伸手训练。
   1. 移除第一列意大利面（即在受影响较轻一侧肢体训练的第一周内，将最内侧的垂直柱（从抓取开口延伸出的部分）设置到位，以确保患侧肢体的早期抓取动作无法成功。
   2. 将小鼠放入抓取室，前方放置半满的矩阵板。确保矩阵板中填充的一半与术前填充的一半位置相反，迫使小鼠现在使用受影响较轻（非优势）的肢体进行抓取。
2. 通过强化健侧肢体在抓取孔中的伸展动作，鼓励小鼠使用健侧肢体进行抓取。在训练的最初几天，当小鼠伸展健侧肢体时，无论抓取是否成功，均在抓取箱底部放置一小块（半片）意大利面。
3. 仅统计非受累肢体完成的抓取动作，计入总计100次抓取次数中。不得将受累肢体的隐蔽性尝试计入总抓取次数。
4. 在非受损肢体训练的前7天后，将最内侧的一列意大利面状物放回基质中。
5. 记录伸手次数、成功伸手次数以及成功伸手的位置。注意：这些数据可用于观察非优势肢体在伸手模式上的差异，但此前尚未见报道。

5. 运动行为分析

通过在非受累肢体训练后，采用PMRT任务评估受累肢体的功能，以确定非受累肢体使用对受累肢体功能恢复的影响。该评估在完成预定天数的非受累肢体训练后进行（通常为14天）。

1. 将矩阵放置在室前，方向与训练程序保持一致（即，对侧矩阵中仅填充偏好肢体对侧的一半）。注意：这迫使小鼠使用其受影响的（且先前偏好的）肢体进行抓取。
2. 记录总抓取次数、成功抓取次数以及成功抓取的位置，以与卒中前的性能水平进行比较。在非优势侧肢体训练期间，不要测试受损肢体的性能，因为对受损肢体的测试可能起到训练作用，从而影响受损肢体的功能恢复。

结果

PMRT 分析的结果应包括被折断的意大利面数量以及成功抓取的模式。图3A展示了感觉运动皮层损伤小鼠的实验结果，表明缺血性损伤会影响成功抓取的次数以及实际抓取动作的模式^{3, 19}。图3B展示了典型的模式变化。PMRT 能够模拟小鼠中习得性不用现象，这一点通过在非受损肢体训练后受损肢体功能恢复受阻得以证实^{13, 20}。因此，仅对使用受损肢体的成功抓取行为进行分析。对感觉运动皮层缺血性损伤小鼠的研究结果表明，在缺血性卒中后对非受损肢体进行两周训练，会至少在七天内抑制受损肢体的使用¹³。如图4所示，在单侧缺血性损伤后接受15天非受损肢体训练的小鼠，在随后七天的受损肢体评估中，成功抓取尝试次数更少。而在卒中后15天内未接受任何训练（对照组）的小鼠，则能在七天的受损肢体评估期内恢复成功获取意大利面的能力。该效应在非受损肢体训练结束后，可持续至后续长达28天的受损肢体评估期²⁰。

PMRT 还可用于评估抓取动...

讨论

PMRT 代表了一种简单且定量的方法，用于评估小鼠的熟练抓取能力。尽管耗时，但即使是先前无经验的本科生，也只需经过几次培训即可学会收集可靠且可重复的数据。该任务足够敏感，能够检测到小鼠在缺血性损伤后运动技能发生的轻微变化^{3, 13, 15}，许多研究已引用其在多种训练方案下可检测到长期的功能缺陷^{15, 20, 22}。由于该任务为单侧性操作，因此可指定小鼠使用哪一侧肢体完成任务。PMRT 的这一特性使其在研究损伤后的适应性行为与神经可塑性，以及因依赖较少受损肢体而导致的非适应性与代偿性改变方面均具有有效性。此外，该任务也适用于双侧肢体协同使用的研究，此类研究已在大鼠模型中开展，但目前尚未在小鼠中进行²³。

当前方案最关键的方面包括：在训练前准确确定小鼠的偏好肢体、在损伤前训练小鼠熟练掌握精细运动任务，以及在术后训练的第一周内将小鼠从偏好/受损肢体取食转换为非偏好/较少受损肢体取食。为在训练前准确确定偏好肢体，重要的是在塑形阶段允许小鼠在完整矩阵中取食意大利面。应鼓励小鼠进行取食动作，但不应奖励其取食行为，以免无意中强化其...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
取食室			取食室由实验室自制，材料为有机玻璃（Plexiglas）
意大利面矩阵块			意大利面矩阵盒由实验室自制，使用一块较重的塑料块加工而成
细意大利面（Capellini）	DeCecco		DeCecco 品牌的细意大利面可在杂货店或通过亚马逊等在线零售商购买