需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

衰老小鼠前庭系统的行为学评估

16.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/51605

⸱

2014年7月11日

 ,  ,  ,  , 
1Discipline of Biomedical Science, University of Sydney, 2The Bosch Institute Animal Behavioural Facility, University of Sydney

本文内容

摘要

已知运动控制和平衡能力会随着年龄增长而下降。本文介绍了一系列标准的无创行为学测试，并加入一种简单的旋转刺激以挑战前庭系统，从而在衰老小鼠模型中展示平衡能力的变化。

摘要

与年龄相关的平衡能力下降与肌肉力量减弱、运动协调性减退以及前庭功能退化密切相关。尽管已有许多研究报道了啮齿类动物在衰老过程中平衡表型的变化，但极少有研究专门分离出在正常条件或衰老状态下前庭系统对平衡的贡献。我们采用两种标准的行为学测试方法，在小鼠生命周期的特定年龄点对其平衡能力进行表征：转棒实验和倾斜平衡木实验。尤为重要的是，我们还使用一种自行设计的旋转装置来刺激小鼠的前庭系统（且不引发明显的运动病症状）。这两种测试方法已被用于证明，在小鼠整个生命周期中，前庭介导的平衡能力存在显著变化。初步结果显示，转棒实验和改良的平衡木实验均可作为识别衰老过程中平衡功能变化的有效手段，从而替代诸如前庭-眼反射（VOR）测量等更具难度和侵入性的技术方法。

引言

平衡感或许是即使在行走和转身等最基本运动活动中也最易被忽视却至关重要的组成部分。平衡受到多种因素影响，包括肌肉力量、运动协调性以及前庭功能；只有在出现前庭神经病变或正常衰老过程中，一个功能健全的平衡系统的重要性才被人们所认识。前庭系统功能障碍常伴随眩晕、头晕及失衡感，导致跌倒风险增加以及继发性损伤1。这种情况在老年人群中尤为严重，跌倒已成为导致伤害的主要原因之一2。

前庭功能测试通常基于前庭反射，特别是前庭-眼反射（VOR）或前庭-颈反射（VCR）。VOR 和 VCR 分别在头部和身体运动过程中对视网膜上图像的稳定和头部位置的维持至关重要。通常，VOR 的测量需要通过植入搜索线圈来记录眼动，或采用视频追踪眼动3。由于小鼠眼睛体积小，且瞳孔在视频分析中难以识别，这种方法在小鼠中实施具有挑战性3。作为替代方法，VCR 已被用于测量小鼠在身体运动时头部的稳定性，且无需进行侵入性手术4。尽管如此，目前仍鲜有研究专门关注前庭系统整体功能的表现，以及更为重要的是其在衰老过程中的变化。

为了简单且无创地评估整体平衡能力，我们改进了两种常用的行为学测试方法。转棒实验和倾斜平衡木实验可评估啮齿类动物运动功能的不同方面，在以往的研究中，这些实验常组合成测试套餐，以全面获取运动能力的完整特征。这种能力可能受到疾病或基因修饰的影响，同时也对正常发育和衰老相关过程敏感5-7。早期利用转棒实验的研究表明，小鼠的运动协调能力在出生3个月后开始下降8。此外，大鼠在平衡木实验中表现出随年龄增长而明显的平衡功能缺陷9。

本文描述了使用转棒仪和平衡梁测试，结合前庭刺激，以挑战前庭系统并表征年轻和老年小鼠平衡功能的后续影响。尽管所述方法简单且无创，不能作为外周前庭功能的独立评估指标，但它们提供了一种有用且简便的行为学测量手段，可用于比较小鼠正常衰老过程中前庭信息处理多个阶段的细胞及亚细胞水平变化。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 动物

  1. 从动物资源中心（澳大利亚珀斯）获取 1 个月、9 个月和 13 个月大的小鼠（C57/BL6）。这些小鼠饲养于悉尼大学博世啮齿动物设施的标准鼠笼中，采用 12/12 小时明暗循环光照周期，并可自由获取食物和饮水。ad libitum。以下所述实验程序已获得悉尼大学动物伦理委员会批准。
  2. 每次测试前 10 分钟，将小鼠笼移入测试房间，使小鼠适应测试环境。

2. 旋转杆实验

  1. 设置转棒仪装置（图1A）：
    1. 在转棒仪每个通道中安装圆柱杆。
      注意：此处使用大鼠用圆柱杆（直径70 mm），而非小鼠用圆柱杆（直径32 mm），以防止小鼠抓握圆柱杆并进行“被动旋转”10。
    2. 将磁性着陆平台放置在转棒仪每个通道底部的金属丝上，确保平台不倾斜触碰转棒仪底面，并尽可能靠近每个通道的磁性右侧壁，但不得接触。
      注意：在转棒仪测试过程中，小鼠需向前行走以保持在旋转并加速的圆柱杆上。当小鼠无法继续停留在圆柱杆上时，会掉落并撞击着陆平台，从而触发磁性传感器。每只小鼠从旋转圆柱杆上掉落所用的时间、掉落时的圆柱杆转速（rpm）以及行走距离将被自动计算，并记录在转棒仪前方的显示屏上。
    3. 将两块透明塑料板插入每个转棒仪通道的前方，较短的塑料板置于底部，较长的塑料板置于上方。
    4. 使用转棒仪前方的键盘输入测试参数。进行加速转棒测试时，请按照步骤2.1.4.1至2.1.4.6设置参数；进行固定速度转棒测试时，请按照步骤2.1.4.7至2.1.4.12设置参数。
      1. 将测试最长时间设为60秒。
      2. 设置要使用的通道数量（或待测小鼠数量）。
      3. 将测试起始速度设为5 rpm。
      4. 将测试最高速度设为44 rpm。
      5. 将测试加速度时间（ramp speed）设为60秒。
      6. 设置所选圆柱杆的尺寸及旋转方向为“大鼠用圆柱杆，正向旋转”。
      7. 将测试最长时间设为240秒。
      8. 将使用的通道数量设为1，因小鼠需单独测试。
      9. 将测试起始速度设为15 rpm。
      10. 将测试最高速度设为15 rpm。
      11. 将测试加速度时间（ramp speed）设为0秒。
      12. 设置所选圆柱杆的尺寸及旋转方向为“大鼠用圆柱杆，正向旋转”。
        注意：上述参数可根据不同实验需求进行调整。
    5. 在固定速度转棒测试中，于转棒仪前方放置一台摄像机，以便记录小鼠在试验过程中的行为，并利用视频进行后续分析，以确定小鼠在转棒上停留的时间。
  2. 进行加速转棒测试时，请执行步骤2.2.1至2.2.4：
    1. 将每只小鼠放置在静止的圆柱杆上5分钟，使其适应转棒仪环境。
    2. 轻轻推动小鼠使其面朝转棒仪后方，当所有小鼠均朝此方向时，启动转棒测试（见图1B）。
    3. 当小鼠从旋转的圆柱杆上掉落时，将其放回笼中，并静置休息10分钟，期间提供食物和饮水。
    4. 重复步骤2.2.1至2.2.3，共完成8次试验。每次试验之间需用清水清洁圆柱杆、通道和着陆平台上的尿液和粪便，并将着陆平台复位至初始位置。
      注意：前3至5次试验作为训练试验，使小鼠熟悉任务。从后续试验开始，记录每次试验中小鼠掉落时间、行走距离及掉落时圆柱杆的最终转速（rpm），用于后续分析（图2）。
  3. 进行固定速度转棒测试时，请执行步骤2.3.1至2.3.8：
    1. 将一只小鼠放置在圆柱杆上5分钟，使其适应转棒仪环境，随后将其放回笼中。
    2. 启动摄像机开始录像，同时按下转棒仪的“开始”按钮，然后将小鼠放置在旋转的圆柱杆上，确保其面朝转棒仪后方。
    3. 当小鼠从旋转圆柱杆上掉落时，停止摄像机录像，并将小鼠放回笼中休息10分钟，期间提供食物和饮水。
    4. 重复步骤2.3.2和2.3.3，直至完成总共8次试验。每次试验之间需清洁圆柱杆、通道和着陆平台上的粪便和尿液，并将着陆平台复位至初始位置。
    5. 开启自制旋转装置，设置频率为3 Hz，持续20秒，使小鼠熟悉声音。20秒后关闭电钻停止旋转，并用手扶住跑轮两侧，防止其继续转动超过初始20秒。
      注意：该旋转装置由一个固定在电钻上的啮齿类动物跑轮构成（图3A）。跑轮中心设有一个带网状盖的小型舱室，用于放置小鼠（图3B）。装置围绕垂直轴逆时针旋转。刺激强度与先前研究一致，已有研究表明，0.2至3 Hz范围内的旋转刺激足以诱发前庭眼反射（VOR）和前庭脊髓反射（VCR）反应4,11,12。
    6. 将小鼠放入旋转装置中心的舱室内，并盖好盖子。
    7. 将旋转装置以最低档3 Hz启动，持续20秒。在此期间启动转棒仪并开始摄像机录像，为即将进行的试验做准备。20秒结束后关闭电钻，并用手扶住跑轮两侧以停止其旋转。随后立即将小鼠迅速转移至旋转的圆柱杆上，进行转棒测试。
    8. 当小鼠从圆柱杆上掉落时，停止摄像机录像，并将小鼠放回笼中。
  4. 所有小鼠测试完成后，使用温和的洗涤剂/水混合液清洁透明塑料板，并使用70%乙醇清洁转棒仪的圆柱杆、通道和金属着陆平台。

3. 带前庭挑战的平衡木实验

  1. 如图4A所示设置平衡梁装置。
    注意：平衡梁装置改编自Carter 等（2001）13描述的装置。在此测试中，小鼠从距地面52.5 cm的梁低端出发，走向位于距地面60 cm处的暗箱（目标箱，13 × 22 cm，带有一个5 × 6 cm的入口）（图4A）。小鼠天生倾向于进入暗箱以寻求黑暗和庇护，而非停留在暴露的梁上；此外，梁具有轻微上坡，可利用小鼠向上逃离的本能，进一步促使它们穿越梁14。梁本身长1 m，横截面为圆形，直径为14 mm。可根据需要使用一系列不同直径的梁，以便实验者调节测试的敏感度或适应体型更大的实验对象。在平衡梁的低端处标有一条白线作为起始线。在梁的高端距起始线60 cm处另画一条线作为终点线（图4A）。
    1. 在平衡梁低端的两侧各放置一台摄像机（图4B）。
      注意：摄像机应调整角度，以完整捕捉平衡梁的全长，并确保梁上标记的起始线和终点线清晰可见。这些摄像机将用于记录小鼠穿越平衡梁时的行为，所得视频将用于后续分析。
    2. 在目标箱底部铺上纸巾，以便在每只小鼠测试后易于清理尿液和粪便，并将小鼠所在饲养笼的盖罩放入目标箱内。
    3. 在抬高的梁下方放置足够的泡沫或其他缓冲材料，以保护可能从装置上跌落的小鼠。若小鼠跌落，实验者应立即将其拾起并放入目标箱中休息。
  2. 将一只小鼠放入目标箱中2分钟，使其熟悉该环境。若小鼠在此期间试图走上梁，可用戴手套的手遮盖目标箱入口5秒，以抑制该行为。
  3. 通过将小鼠放置在目标箱入口外的梁上，使其自行走入目标箱，以此训练小鼠。逐步将小鼠放置在离目标箱更远的位置进行训练，直至小鼠能够从起始线自主行走至目标箱，无需辅助且犹豫极少。每次运行后让小鼠在目标箱中休息1分钟。
  4. 训练完成后开始测试小鼠。 
    1. 启动摄像机开始录像。
    2. 将小鼠放置在梁的起始线上，等待其向目标箱方向穿越梁。
    3. 当小鼠到达目标箱时，停止摄像机录像。
    4. 让小鼠在目标箱中休息1分钟。等待期间清理试验过程中可能留下的尿液或粪便。
    5. 重复步骤3.4.1至3.4.4，直至完成总共5次试验。
  5. 将自制旋转器以3 Hz频率开启20秒（类似于固定速度转棒试验），使小鼠熟悉其声音。20秒后关闭钻机，并用手从转轮两侧将其固定，防止继续旋转。
  6. 将小鼠放入旋转器中心的腔室内，并盖上盖子。
  7. 将旋转器以最低转速3 Hz开启20秒。在此期间启动摄像机录像，为即将开始的试验做准备。20秒结束后关闭钻机，并用手从转轮两侧将其固定，防止其继续旋转。尽快将小鼠转移至平衡梁的起始位置，等待其穿越梁走向目标箱。
  8. 当小鼠到达目标箱时停止摄像机录像，并将小鼠送回其饲养笼。
  9. 每只小鼠测试结束后，用70%乙醇清洁平衡梁装置，并更换目标箱内的纸巾。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

转棒实验

小鼠的运动表现通过每只小鼠在8次试验中记录的跌落时间（Time To Fall, TTF）来描述。利用这些TTF测量值，可以绘制每只小鼠的训练曲线。图2展示了1月龄和9月龄小鼠在8次试验过程中的运动表现示例。这些训练曲线显示，在前3至5次试验中TTF逐渐增加，随后进入平台期。在达到平台期之前的TTF测量值被视为训练阶段数据（图2），而构成平台期的TTF测量值则被记录下来用于数据分析（图5）。

图5显示，小鼠在转棒仪上的运动表现随年龄增长而下降。与9月龄小鼠（n = 8）相比，1月龄小鼠（n = 6）在转棒仪上停留的时间显著更长（18.38 ± 4.66 vs. 14.13 ± 2.53 秒；p < 0.05，Student’s t-test）。这表明所使用的转棒仪及测试参数对年龄相关的运动功能变化具有敏感性。

平衡木...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

方案中的关键步骤

先前的研究表明，小鼠在转棒和平衡木装置上的训练很容易过度，因此准确获取测量数据具有挑战性。15例如，在转棒实验中过度训练可能导致小鼠在适应期和试验期间故意从转棒上跳下，而在平衡木实验中过度训练则可能导致小鼠更频繁地停顿（探索行为）以及反向移动（即 向起点方向15最终，过度训练可能导致对实际运动能力的低估。因此，在分析之前评估训练曲线至关重要。

在转棒实验方案中另一个关键步骤是，确保每次试验开始前小鼠朝向正确的方向（与旋转方向相反）。当圆棒开始旋转时，若小鼠朝向错误的方向，将难以在圆棒上保持平衡，从而过早掉落，可能导致高估测试的影响。此外，在平衡木实验中，应尽快将小鼠从转棒装置转移至平衡木，因为前庭系统受到的刺激后恢复过程会立即开始。这可能导致由转棒引起的平衡障碍及其对后续表现的负面影响被低估。

修改与故障排除

可以通过修改转棒仪和平衡木实验来调整测试...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此致谢 Garnett Passe 和 Rodney Williams 纪念基金会以及博世研究所动物行为设施。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
转棒仪IITC Life Science Inc.#755"大鼠转棒" = 70 mm 直径。禁止乙醇接触有机玻璃。
iPhoneApple可使用任意类型的相机。背面用魔术贴固定，以便连接至三维可调臂。
三维可调臂Fisso/BaitellaClassic 3300-28任何类型的稳定垂直支架均可。在臂的顶端用魔术贴固定 iPhone。
木质行走横梁：长 1 m、横截面为圆形、直径 14 mm 的光滑木条可根据实验参数选用不同直径和横截面形状
木质目标箱（130 x 140 x 220 mm），由 11 mm 厚木板制成
支架由 41 x 41 mm 木梁构成：起始端和目标端的垂直梁分别距地面 525 mm 和 590 mm；一根 803 mm 的水平梁沿地面铺设，位于行走横梁正下方；两端各有两个 20 mm 长的梁作为"支脚"，连接水平梁与垂直梁；在"起始"垂直梁顶端设有一个 21 x 21 x 36 mm 的木块；该木块中心开有 13 x 13 mm 的孔洞，形成一个垂直于行走横梁的通道。所有连接处均需用小型钢制角码加固。
黑色涂料（水性）HandycanAcrylic Matt Black平衡横梁装置的所有木质表面需涂 2–3 层
透明涂层Wattle EstapolPolyurethane Matt所有横梁涂一层；平衡横梁装置其余表面涂两层
泡沫包装材料用于缓冲动物从平衡横梁跌落的冲击
70% 乙醇、纸巾每只动物测试后清洁横梁和目标箱
纱布垫/纸巾用于铺垫目标箱底部
小鼠笼盒（来自饲养笼）

参考文献

  1. Agrawal, Y., et al. Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004. Arch. Intern. Med. 169, 938-944 (2009).
  2. Schwab, C. W., Kauder, D. R. Trauma in the geriatric patient. Arch. Surg. 127, 701-706 (1992).
  3. Stahl, J. S., et al. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. J. Neurosci. Methods. 99, 101-110 (2000).
  4. Takemura, K., King, W. M. Vestibulo-collic reflex (VCR) in mice. Exp. Brain Res. 167, 103-107 (2005).
  5. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J. Neurosci. 19, 3248-3257 (1999).
  6. Wallace, J. E., et al. Motor and reflexive behavior in the aging rat. J. Gerontol. 35, 364-370 (1980).
  7. Ingram, D. K., et al. Differential effects of age on motor performance in two mouse strains. Neurobiol. Aging. 2, 221-227 (1981).
  8. Serradj, N., Jamon, M. Age-related changes in the motricity of the inbred mice strains 129/sv and C57BL/6j. Behav. Brain Res. 177, 80-89 (2007).
  9. Gage, F. H., et al. Spatial learning and motor deficits in aged rats. Neurobiol. Aging. 5, 43-48 (1984).
  10. Rustay, N. R., et al. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behav. Brain Res. 141, 237-249 (2003).
  11. Xiaocheng, W., et al. Expression of calcitonin gene-related peptide in efferent vestibular system and vestibular nucleus in rats with motion sickness. PloS One. 7, (2012).
  12. Beraneck, M., et al. Ontogeny of mouse vestibulo-ocular reflex following genetic or environmental alteration of gravity sensing. PloS One. 7, (2012).
  13. Carter, R. J., et al. Motor coordination and balance in rodents. Curr. Protoc. Neurosci. , (2001).
  14. Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat. Rev. Neurosci. 10, 519-529 (2009).
  15. Luong, T. N., et al. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  16. McFadyen, M. P., et al. Differences among eight inbred strains of mice in motor ability and motor learning on a rotorod. Genes Brain Behav. 2, 214-219 (2003).
  17. Shiga, A., et al. Aging effects on vestibulo-ocular responses in C57BL/6 mice: comparison with alteration in auditory function. Audiol. Neurootol. 10, 97-104 (2005).
  18. Stahl, J. S. Eye movements of the murine P/Q calcium channel mutant rocker, and the impact of aging. J. Neurophysiol. 91, 2066-2078 (2004).
  19. Fahlstrom, A., et al. Behavioral changes in aging female C57BL/6 mice. Neurobiol. Aging. 32, 1868-1880 (2011).
  20. Bâ, A., Seri, B. V. Psychomotor functions in developing rats: ontogenetic approach to structure-function relationships. Neurosci. Biobehav. Rev. 19, 413-425 (1995).
  21. Yu, X., et al. A novel animal model for motion sickness and its first application in rodents. Physiol. Behav. 92, 702-707 (2007).
  22. Tung, V. W., et al. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

转棒实验平衡木实验前庭刺激运动协调性评估平衡功能分析无创平衡测试年龄相关性平衡功能下降前庭挑战方案小鼠平衡评估
衰老小鼠前庭系统的行为学评估
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。