本实验方案的目的是利用电子顺磁共振（EPR）监测的氧化还原滴定法，鉴定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Nar1蛋白中的不同辅因子。氧化还原滴定法是一种非常可靠的方法，可用于获得酶和蛋白质中不同氧化还原活性辅因子的中点电位。
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摘要
摘要
通过电子顺磁共振（EPR）监测的氧化还原滴定是一种强大的方法，可用于测定蛋白质中辅因子的中点电位，并鉴定和定量其在可检测氧化还原状态下的辅因子。
该技术与直接电化学（伏安法）方法互为补充，虽然无法提供电子传递速率的信息，但能够确定所研究蛋白质中辅因子的种类及其氧化还原状态。该技术广泛适用于任何含有可被电子顺磁共振（EPR）检测的辅因子的蛋白质。
典型的滴定需要2 ml蛋白溶液，辅因子浓度范围为1-100 µM。通过加入化学还原剂（连二亚硫酸钠）或氧化剂（铁氰化钾）对蛋白进行滴定，以使样品达到特定的电势。将一根铂丝和一根Ag/AgCl参比电极连接至伏特计，用于测量蛋白溶液的电势。使用一组13种不同的氧化还原媒介体，使蛋白中的氧化还原辅因子与电极之间达到平衡。在不同电势下取样，并测定电子顺磁共振谱，该谱图特征性地反映蛋白中不同氧化还原辅因子的状态。通过Nernst方程分析信号强度随样品电势变化的曲线，以确定辅因子的中点电势。
引言
令人瞩目的是，维持地球生命最基本的化学过程——光合作用、固氮作用和呼吸作用——均由含有多种有机和无机氧化还原辅因子的大型蛋白质复合物催化。据估计，所有蛋白质中约有30%含有一种或多种金属辅因子1,2。可通过直接电化学方法（例如，蛋白质膜伏安法）或氧化还原滴定法来鉴定和表征这些氧化还原辅因子。这两种技术在性质和适用性上互为补充。伏安法能够快速测定可与电极表面发生反应的辅因子的中点电位和电子传递动力学3,4。该方法通常适用于细胞色素c或铁氧还蛋白等电子传递蛋白，有时也适用于固定在电极表面的较复杂蛋白质。然而，必须事先充分了解蛋白质中辅因子的性质，因为伏安图谱本身无法提供辅因子身份的直接信息。氧化还原滴定法操作较为繁琐，且需要毫克量级的蛋白质。但该方法不仅能提供辅因子的中点电位信息，还能确定其身份5。此外，在一次滴定实验中可同时监测蛋白质中的多个辅因子。
氧化还原滴定的原理是使具有氧化还原活性的蛋白质或酶发生化学还原或氧化。为了确保辅因子能够与还原剂或氧化剂反应，需使用氧化还原介体。这些氧化还原介体还能与电极发生反应，从而可以测量溶液的电势。介体起到氧化还原缓冲剂的作用，在蛋白质中的辅因子与电极之间建立平衡。当将溶液的电势化学调节至目标值后，取出样品并迅速在液氮中冷冻，以待后续采用光谱技术进行分析。电子顺磁共振（EPR）光谱在此方面尤为有用，因为它可用于定量测定顺磁性金属中心或有机自由基。
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方案
1. 实验装置与溶液的准备
- 配制含有100 mM Tris、250 mM NaCl和10%甘油、pH为8.5的缓冲液。用氩气吹扫缓冲液以去除其中的溶解氧。将缓冲液引入厌氧室中。
- 将缓冲液分为两部分。向其中一部分（缓冲液 A）加入 1 mM DL-二硫苏糖醇（DTT, Mr 154.25 g/mol）和 1 mM L-半胱氨酸。另一部分（缓冲液 B）不含还原剂。
- 制备氧化剂和还原剂溶液。分别配制1 ml的2、20和200 mM铁氰化钾（FIC，Mr 329.26 g/mol）和连二亚硫酸钠（SD，Mr 174.11 g/mol) 溶于厌氧缓冲液B中。
- 按如下步骤制备介体混合液：
- 添加 160 µM 以下每种氧化还原介质和 50 mM NaCl 加入缓冲液 B： N,N,N’,N’四甲基对苯二胺（TMPD, Mr 237.17 g/mol，E’0 +0.276 V)，2,6-二氯酚靛酚（DCIP，Mr 290.08 g/mol，E’0 +0.217 V），吩嗪乙硫酸盐（PES，Mr 334.4 g/mol，E’0 +0.055 V），亚甲蓝（Methylene blue (Mr 319.85 g....
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结果
对来自Saccharomyces cerevisiae的含铁硫簇蛋白Nar1进行的氧化还原滴定实验鉴定出三种不同的辅因子：Nar1含有一个[3Fe-4S]簇、一个[4Fe-4S]簇和一个单核铁中心（图1）。这些EPR信号以其g值为特征：[3Fe-4S]+的gz为2.01，gcrossover为2.00（图1B）；[4Fe-4S]+的gz为2.02，gy为1.93，gx为1.82（图1C）；单核Fe3+的g值为4.3和9.7（图1A）。[4Fe-4S]+簇的EPR信号与先前报道的Nar1结果非常相似6,9。单核铁的EPR信号是典型的菱形高自旋三价铁物种特征（图1A）。
EPR信号的定.......
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讨论
一系列13种氧化还原介体可在溶液中实现相对于标准氢电极（SHE）从-0.45至+0.3 V范围内的氧化还原平衡（表1 和 图3。远高于或低于这些电位时，所有介体均被完全还原或完全氧化，因而无法再与蛋白质的氧化还原活性中心发生进一步的平衡反应。这一点非常重要，因为在文献中有时仅使用两到三种介体进行氧化还原滴定，导致只能测量较窄的电位范围。 11此类氧化还原滴定只有在氧化还原辅因子的中点电位处于某一范围内时才能得到可靠结果 约 介体中点电位的±50 mV范围内。已测定不同介体中点电位的温度依赖性，并证明氧化还原滴定可在高达80 °C的温度下进行。12 通过添加一层Nujol矿物油可防止滴定溶液蒸发，该矿物油与大多数含蛋白质溶液相容。
溶液和滴定容器的厌氧性非常重要。滴定最好在厌氧手套箱中进行。然而，也可以使用连接至氩气供应的密封滴定容器。EPR 管可通过小段橡胶管连接至氩气/真空多通管路。使用带有 13 cm 长针头的气密注射器，可通过橡胶管将滴定样品注入管.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了荷兰国家研究学校组合催化项目“化学设计控制的催化”（NRSC-Catalysis）研究基金的资助。感谢莱顿大学的 H.Y. Steensma 博士和 G.P.H. van Heusden 博士在S. cerevisiae Nar1 重组表达方面提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 参比电极（Ag/AgCl） | Radiometer | ||
| 化学品 | Sigma-Aldrich | ||
| EPR 波谱仪 | Bruker | ||
| N,N,N’,N’-四甲基对苯二胺（TMPD）·（HCl）2 | 637-01-4 | ||
| 2,6-二氯酚靛酚（DCIP）钠盐 | 620-45-1 | ||
| 吩嗪硫酸乙酯（PES） | 10510-77-7 | ||
| 亚甲蓝 | 122965-43-9 | ||
| 试卤灵钠盐 | 34994-50-8 | ||
| 靛红二磺酸钠（靛蓝胭脂红） | 860-22-0 | ||
| 2-羟基-1,4-萘醌 | 83-72-7 | ||
| 蒽醌-2-磺酸钠+ H2O | 153277-35-1 | ||
| 苯基藏红花素 | 81-93-6 | ||
| 藏红花素 O | 477-73-6 | ||
| 中性红 | 553-24-2 | ||
| 苄基紫精 | 1102-19-8 | ||
| 甲基紫精 | 1910-42-5 |
参考文献
- Lippard, S. J., Berg, J. M. Principles of Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. (1994).
- Bertini, I. Bioinorganic Chemistry. , University Science Books. 611(1994).
- Leger, C., et al. Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzym....
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重印与许可
