本文介绍了一种从新生小鼠肝外胆管中分离胆管上皮细胞的技术。通过精细解剖获取胆管组织，随后利用厚胶原凝胶中的细胞爬出法分离细胞。该方法为研究肝外胆管的发育过程及病理机制提供了一个有效的工具。
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本文内容
摘要
摘要
肝脏的肝内和肝外胆管在发育上是不同的，可能受到某些疾病的差异化影响。然而，肝内与肝外胆管上皮细胞之间以及新生儿与成年细胞之间的差异尚不明确。
从肝内胆管分离胆管上皮细胞的方法已较为成熟1-4。然而，肝外胆管细胞（尤其是来自新生个体的细胞）的分离方法至今尚未见报道，尽管此类技术对于理解不同胆管上皮细胞群体之间的差异，以及研究诸如胆道闭锁等主要累及肝外胆管的疾病具有重要意义。本文介绍了一种优化的分离新生期及成年小鼠肝外胆管细胞的技术。该方法可获得纯度较高的细胞群体，且成纤维细胞等间充质细胞的污染极少。
该方法基于切除肝外胆管和胆囊，随后仔细分离并刮除脂肪层和成纤维细胞层。将组织结构嵌入厚层胶原中，培养约3周，以促进胆管上皮细胞以单层形式向外生长，之后可用胰蛋白酶消化并重新接种，用于实验。
引言
肝内和肝外胆管细胞的起源与发育过程存在显著差异。肝脏起源于前肠腹侧内胚层的憩室5。该憩室的尾侧部分形成肝外胆管系统，而头侧部分则发育为肝内胆管系统5。肝内胆管的胆管细胞来源于门周区域胆管板周围的前体细胞6。这些细胞具有分化为肝细胞或胆管细胞的潜能6。这一点具有重要的临床意义，因为胆管疾病可能特异性地累及某一类胆管细胞。例如，胆道闭锁最初主要影响新生儿的肝外胆管，而阿拉杰里综合征（Alagille Syndrome）则主要累及肝内胆管。
已有多种关于从小鼠和大鼠中分离肝内胆管上皮细胞及胆管单元的描述。研究人员通过胆管分离后继发性外生长，或通过肝脏消化及针对表达特定细胞表面标志物的胆管上皮细胞进行抗体富集的方法来分离单个细胞1-4。功能性且具有极性的胆管单元可通过肝脏消化结合孔径过滤的方法获得7。这些分离得到的胆管单元能够对分泌性刺激产生反应，并表现出液体分泌能力7，而分离的胆管上皮细胞则已被证实可在体外形成胆管样结构in vitro1,2。这些方法的局限性包括需要具备专门的技术经验以及用于消化酶灌注肝脏的特殊设备。此外，还存在间充质细胞污染的风险3。
目前尚未有文献报道从新生儿肝外胆管分离胆管上皮细胞的方法。本....
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方案
除非另有说明，整个操作均在室温下进行 。所有动物实验均须在当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案下，于人道条件下开展。
1. 仪器与溶液的准备
- 将小鼠手术台设置在组织培养罩和培养箱附近（图1A）。注意：所需设备包括解剖显微镜、光源、12.5 cm长的直剪刀、6英寸无齿细尖弯镊以及4英寸有齿弯头镊子（图1B）。
- 将灭菌器械置于手术台上盛有70%酒精的玻璃烧杯中。
- 用无菌分离培养基（表1）填充三个无菌60 mm培养皿；将其中两个置于手术台上的冰上，另一个置于培养罩内的冰上。
- 将大鼠尾胶原、无菌10×磷酸盐缓冲液（PBS）、无菌水、无菌1 N NaOH以及胆管上皮细胞（BEC）培养基（表1）放入组织培养罩内。注意：胶原应置于冰上。
2. 胆管的分离与培养
- 根据IACUC指南，通过暴露于二氧化碳使其失去意识后进行颈椎脱位，处死出生后0-3天内的新生小鼠（图1C）。
注意：可根据具体实验需求使用年龄较大的小鼠。 - 将动物置于仰卧位，在骨盆区域沿中线做一小的横向切口。将切口向两侧横向延伸，并....
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结果
采用本方案可分离获得纯度极高的新生小鼠肝外胆管上皮细胞群体，K19免疫荧光染色结果证实了这一点（图 2A 和 2B）；我们同样成功地从成年小鼠中分离出细胞并获得了类似结果。我们观察到，从新鲜分离的胆管中获取的细胞需要3周时间才能在厚胶原凝胶上形成单层。胆管上皮细胞在厚胶原凝胶中呈线性生长，由分离的胆管形成细胞片层。在单层细胞过度生长之前，应在细胞铺满前将其消化并重新接种至薄胶原凝胶上，因为若培养超过3周仍未传代，细胞片层中将出现空洞。为获得最佳细胞生长状态并最大限度减少成纤维细胞污染，在解剖和清洗步骤（2.3、2.4）中必须仔细而谨慎地去除包裹脆弱肝外胆管的结缔组织。若出现成纤维细胞生长，可在传代前使用手术刀切除或轻柔吸除受污染的厚胶原区域，以减少成纤维细胞的转移。这些细胞在前三个传代阶段中增殖迅速，但在更高代次时，增殖速度减慢，细胞体积增大并出现空泡化。我们已成功冻存胆管上皮细胞样本，并在后续时间重新接种，细胞活力良好；然而，解冻后的胆管上皮细胞增殖速度不及新鲜分离并传代的细胞。
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讨论
本文介绍了一种从各年龄段（包括新生小鼠）小鼠的肝外胆管中分离纯化胆管上皮细胞的技术。该技术的优势在于可将肝外胆管上皮细胞与肝内胆管上皮细胞分开进行研究，有助于识别这两类细胞群体之间的关键差异。我们近期发表的一项研究显示，采用本方法分离并感染恒河猴轮状病毒的肝外胆管上皮细胞中纤毛数量减少8。该技术的缺点包括操作劳动强度大，且需要精细解剖以防止成纤维细胞污染；此外，获得足够数量用于大多数实验的细胞需要细胞迁出及至少三周的体外培养时间。因此，这些细胞可能反映了与二维培养相关的改变。目前尚不清楚所获得的细胞群体中是否包含大量干细胞或来自胆管周围腺体的细胞9,10。
我们尝试利用该方法从大鼠中分离肝外胆管上皮细胞；然而，细胞在培养中未能生长。目前正在进行研究，以确定是培养基中缺乏关键的生长因子，还是需要调整其他培养条件。
最终，这种分离肝外胆管上皮细胞的方法可能有助于理解胆管纤维化肝内与肝外形式之间的差异，以及新生儿细胞与成人细胞之间的差异。
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
作者感谢宾夕法尼亚大学NIDDK消化与肝脏疾病分子研究和肝脏疾病中心（P30 DK50306）的分子病理学与影像学核心设施在成像方面提供的帮助。 本研究得到了美国国立卫生研究院（R01 DK-092111）以及Fred和Suzanne Biesecker儿科肝脏中心（资助对象：R.G.W.）的资助，同时获得了儿童肝脏疾病研究与教育网络提供的博士后奖学金（资助对象：S.K.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 ml，用于BEC培养基 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 ml，用于BEC培养基 |
| 含非必需氨基酸的MEM | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 ml，用于BEC培养基 |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Gibco/ Life technologies | 51300-044 | 5 ml，用于BEC培养基 |
| 丙酮酸钠 | Cellgro | 25-000-CL | 5 ml，用于BEC培养基 |
| 化学成分明确的脂质浓缩液 | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 ml，用于BEC培养基 |
| 青霉素-链霉素 | Cellgro | 30-002-CI | 5 ml，用于BEC培养基，分离过程中使用500 μl |
| 庆大霉素 | Gibco/ Life technologies | 15750-060 | 0.2 ml，用于BEC培养基，分离过程中使用500 μl |
| 乙醇胺 | Sigma Aldrich | E9508-100ml | 0.13 ml，用于BEC培养基 |
| MEM维生素溶液 | Gibco/ Life technologies | 11120-052 | 5 ml，用于BEC培养基 |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Biowhittaker | 17-605E | 5 ml，用于BEC培养基。溶剂为PBS，配制成5 mg/ml的储备浓度 |
| L-谷氨酰胺 | Cellgro | 25-005-CL | 5 ml，用于BEC培养基 |
| 牛垂体提取物 | Gemini | 500-102 | 1.1 ml，用于BEC培养基 |
| 地塞米松 | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 ml，用于BEC培养基，储备浓度为393 μg/ml，用乙醇稀释 |
| 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸 | Sigma Aldrich | T6397 | 0.5 ml，用于BEC培养基，储备浓度为3.4 mg/ml，用乙醇稀释 |
| 表皮生长因子 | Millipore | 01-101 | 0.5 ml，用于BEC培养基，25 μg/ml，用DMEM F12+1%BSA稀释 |
| 佛司可林 | Sigma Aldrich | F6886 | 5 ml，用于BEC培养基，使用浓度为0.411 mg/ml，用DMSO稀释 |
| 两性霉素B（Fungizone） | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 ml，用于BEC培养基，分离过程中使用500 μl |
| 大鼠尾胶原蛋白 | BD Biosciences | 354236 | 用量根据胶原蛋白浓度而定 |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | 使用时为10倍浓度，无菌，用于配制胶原蛋白，用量取决于胶原蛋白浓度 |
| dH2O | N/A | N/A | 无菌，用于配制胶原蛋白，用量取决于胶原蛋白浓度 |
| 10 N NaOH | Fischer Scientific | ss255-1 | 稀释至1 N，无菌，用于配制胶原蛋白，用量取决于胶原蛋白浓度 |
| 来自溶组织梭菌的XI型胶原酶 | Sigma Aldrich | C7657 | 用DMEM稀释并在使用前经无菌滤膜过滤 |
| 胰蛋白酶-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 ml，孵育时间最长10分钟 |
| 胰蛋白酶-EDTA (10x) 0.5% | Gibco/ Life technologies | 15400-054 | 3 ml，孵育时间最长10分钟 |
| 解剖显微镜 | Nikon | SMZ645 | 其他型号亦可接受 |
| 光源（光纤照明器） | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | 其他型号亦可接受 |
| 12.5 cm直剪虹膜剪 | Kent Scientific | 其他型号亦可接受 | |
| 6" 带细尖端的无齿弯镊 | Electron Microscopy Sciences | 其他型号亦可接受 | |
| 4" 带细尖端的有齿不锈钢镊 | Electron Microscopy Sciences | 其他型号亦可接受 |
参考文献
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development....
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重印与许可
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