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方法文章

新生期肝外胆管上皮细胞的分离

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DOI：

10.3791/51621

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2014年6月5日

 , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Medicine, The Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

本文内容

摘要

本文介绍了一种从新生小鼠肝外胆管中分离胆管上皮细胞的技术。通过精细解剖获取胆管组织，随后利用厚胶原凝胶中的细胞爬出法分离细胞。该方法为研究肝外胆管的发育过程及病理机制提供了一个有效的工具。

摘要

肝脏的肝内和肝外胆管在发育上是不同的，可能受到某些疾病的差异化影响。然而，肝内与肝外胆管上皮细胞之间以及新生儿与成年细胞之间的差异尚不明确。

从肝内胆管分离胆管上皮细胞的方法已较为成熟1-4。然而，肝外胆管细胞（尤其是来自新生个体的细胞）的分离方法至今尚未见报道，尽管此类技术对于理解不同胆管上皮细胞群体之间的差异，以及研究诸如胆道闭锁等主要累及肝外胆管的疾病具有重要意义。本文介绍了一种优化的分离新生期及成年小鼠肝外胆管细胞的技术。该方法可获得纯度较高的细胞群体，且成纤维细胞等间充质细胞的污染极少。

该方法基于切除肝外胆管和胆囊，随后仔细分离并刮除脂肪层和成纤维细胞层。将组织结构嵌入厚层胶原中，培养约3周，以促进胆管上皮细胞以单层形式向外生长，之后可用胰蛋白酶消化并重新接种，用于实验。

引言

肝内和肝外胆管细胞的起源与发育过程存在显著差异。肝脏起源于前肠腹侧内胚层的憩室5。该憩室的尾侧部分形成肝外胆管系统，而头侧部分则发育为肝内胆管系统5。肝内胆管的胆管细胞来源于门周区域胆管板周围的前体细胞6。这些细胞具有分化为肝细胞或胆管细胞的潜能6。这一点具有重要的临床意义，因为胆管疾病可能特异性地累及某一类胆管细胞。例如，胆道闭锁最初主要影响新生儿的肝外胆管，而阿拉杰里综合征（Alagille Syndrome）则主要累及肝内胆管。

已有多种关于从小鼠和大鼠中分离肝内胆管上皮细胞及胆管单元的描述。研究人员通过胆管分离后继发性外生长，或通过肝脏消化及针对表达特定细胞表面标志物的胆管上皮细胞进行抗体富集的方法来分离单个细胞1-4。功能性且具有极性的胆管单元可通过肝脏消化结合孔径过滤的方法获得7。这些分离得到的胆管单元能够对分泌性刺激产生反应，并表现出液体分泌能力7，而分离的胆管上皮细胞则已被证实可在体外形成胆管样结构in vitro1,2。这些方法的局限性包括需要具备专门的技术经验以及用于消化酶灌注肝脏的特殊设备。此外，还存在间充质细胞污染的风险3。

目前尚未有文献报道从新生儿肝外胆管分离胆管上皮细胞的方法。本文介绍了一种简化的技术，可用于高纯度分离新生儿及成年个体的肝外胆管细胞。该技术将有助于研究肝内与肝外胆管上皮细胞之间的差异，以及诸如胆道闭锁等累及肝外胆管的疾病机制。

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方案

除非另有说明，整个操作均在室温下进行 。所有动物实验均须在当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案下，于人道条件下开展。

1. 仪器与溶液的准备

  1. 将小鼠手术台设置在组织培养罩和培养箱附近（图1A）。注意：所需设备包括解剖显微镜、光源、12.5 cm长的直剪刀、6英寸无齿细尖弯镊以及4英寸有齿弯头镊子（图1B）。
  2. 将灭菌器械置于手术台上盛有70%酒精的玻璃烧杯中。
  3. 用无菌分离培养基（表1）填充三个无菌60 mm培养皿；将其中两个置于手术台上的冰上，另一个置于培养罩内的冰上。
  4. 将大鼠尾胶原、无菌10×磷酸盐缓冲液（PBS）、无菌水、无菌1 N NaOH以及胆管上皮细胞（BEC）培养基（表1）放入组织培养罩内。注意：胶原应置于冰上。

2. 胆管的分离与培养

  1. 根据IACUC指南，通过暴露于二氧化碳使其失去意识后进行颈椎脱位，处死出生后0-3天内的新生小鼠（图1C）。
    注意：可根据具体实验需求使用年龄较大的小鼠。
  2. 将动物置于仰卧位，在骨盆区域沿中线做一小的横向切口。将切口向两侧横向延伸，并沿腹部两侧向上延伸，形成U形皮瓣。翻起皮瓣以暴露腹腔器官。打开腹腔后，小心地将肠管移出腹腔并推向动物右侧，以便更好地观察肝脏和胆总管。注意：可能需要将侧向切口延伸至肋骨区域，以更清楚地识别肝脏。
  3. 在解剖显微镜下识别胆总管、肝脏和肠道。首先识别胆总管（图1D），操作时需格外小心，因为这些结构非常脆弱。使用有齿和无齿镊子仔细清除胆管周围包括脂肪在内的结缔组织。用一把镊子固定胆管，另一把进行清理。
  4. 采用类似技术清理胆囊。
  5. 将清理后的胆管和胆囊放入第一皿置于冰上的分离培养基中。在培养基中用无齿镊子轻轻按摩组织，进一步去除结缔组织，并排出胆囊内的胆汁。
  6. 将胆管和胆囊转移至第二皿分离培养基中。
  7. 从5只动物中分离出胆管和胆囊后，将组织转移至生物安全柜中的第三只培养皿中。注意：若需从超过5只动物中分离细胞，应分批进行，每5只动物使用新鲜的溶液。
  8. 在组织培养生物安全柜中制备高浓度胶原凝胶：
    注意：可使用任意规格的培养皿。每5只新生鼠使用3 ml终体积的胶原溶液，置于60 mm培养皿中效果良好。该溶液应在嵌入新鲜分离的胆管时现配现用。
    1. 将大鼠尾胶原、无菌10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）、无菌去离子水（dH2O）和无菌1 N NaOH置于冰上。
    2. 计算所需dH2O、10x PBS、NaOH和胶原的体积，配制终浓度为2 mg/ml胶原、1x PBS的凝胶溶液，其中1 N NaOH的体积为所加胶原体积的0.023倍。注意：若使用其他来源的胶原，请遵循制造商关于中和及凝胶形成的说明。
    3. 先将dH2O、10x PBS和1 N NaOH混合，然后加入胶原，充分吹打混匀，确保混合均匀。
  9. 待胶原溶液在室温下增稠至凝胶状时，立即嵌入胆管组织。
  10. 将培养皿置于37 °C、 5% CO2的培养箱中孵育30分钟，使胶原凝固。
  11. 待凝胶完全凝固（颜色由透明变为白色）后，加入3.5 ml BEC培养基（表1），并在37 °C、 5% CO2条件下继续培养。
  12. 每周更换3次BEC培养基，每次加入3.5 ml新鲜培养基。

3. 从厚胶原凝胶中分离原代胆管细胞

注意：3 周内，在致密的胶原中将可见胆管上皮细胞片层（细胞具有大细胞核，直接从包埋的导管延伸而出）。如果培养皿中存在大量成纤维细胞，应弃用该培养皿。若培养皿中仅有少数区域出现成纤维细胞生长，可在传代胆管上皮细胞前用手术刀切除并去除这些区域。

  1. 制备薄层胶原凝胶：
    1. 用无菌 PBS 将胶原稀释至浓度为 1 mg/ml。注意：100 mm 培养皿使用 1 ml；其他尺寸培养皿按比例调整用量。
    2. 使用细胞涂布器（大皿）或移液器吸头（小皿）将胶原溶液均匀涂布，然后在室温下静置 10 分钟。
    3. 加入 DMEM/F12 覆盖培养皿，并在 37 °C、 5% CO2 条件下孵育 10 分钟。
    4. 从孵育箱中取出培养皿，用 1× PBS 洗涤，立即吸除 1× PBS。
    5. 再覆盖一层薄层胶原，通过旋转培养皿或将其置于摇床上均匀涂布。在 37 °C、 5% CO2 条件下孵育 10 分钟。
    6. 待胶原凝固后，加入 DMEM/F12 覆盖培养皿，并在 37 °C、 5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
  2. 从厚层胶原凝胶中分离细胞：
    1. 使用细胞培养刮刀或细胞刮棒，轻轻将胶原凝胶从培养皿上刮下，使其悬浮于液体中。
    2. 将 XI 型胶原酶（见材料列表）用 DMEM/F12 稀释至 10 mg/ml，配制成胶原酶溶液。充分混匀并进行无菌过滤。
    3. 每 60 mm 培养皿的厚层胶原细胞加入 1 ml 上述胶原酶溶液。不要移除 BEC 培养基（应保留 3 ml）。在 37 °C、 5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
    4. 收集含细胞的溶液，转移至 15 ml 锥形离心管中。
    5. 在 2,200 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于等体积的 DMEM/F12 中。
    6. 再次在 2,200 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
    7. 将沉淀重悬于 3 ml 0.5% 胰蛋白酶中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟。孵育结束后，反复吹打溶液以分散胆管细胞片层。加入 5 ml BEC 培养基，并在 1,500 × g 条件下离心 5 分钟。
    8. 弃去上清液，将沉淀重悬于 DMEM/F12 中，再在 1,500 × g 条件下离心 5 分钟。
    9. 弃去上清液，将沉淀重悬于 BEC 培养基中（表 1）。将细胞接种至预先制备的薄层胶原凝胶上。

4. 细胞传代与保存

注意：可根据需要将薄胶原凝胶上的细胞进行分割。

  1. 在37 °C下用0.25%胰蛋白酶孵育前，先用无菌PBS洗涤培养板10-15分钟。
  2. 加入等体积的BEC培养基中和，于1,500 × g离心5分钟收集细胞沉淀。用DMEM/F12洗涤沉淀，再于1,500 × g离心5分钟。
  3. 将细胞重悬于BEC培养基中，分装至胶原蛋白包被的细胞培养皿。
    注意： alternatively，细胞可重悬于保存培养基中，置于-80 °C超低温冰箱或液氮中保存（表1）。

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结果

采用本方案可分离获得纯度极高的新生小鼠肝外胆管上皮细胞群体，K19免疫荧光染色结果证实了这一点（图 2A 和 2B）；我们同样成功地从成年小鼠中分离出细胞并获得了类似结果。我们观察到，从新鲜分离的胆管中获取的细胞需要3周时间才能在厚胶原凝胶上形成单层。胆管上皮细胞在厚胶原凝胶中呈线性生长，由分离的胆管形成细胞片层。在单层细胞过度生长之前，应在细胞铺满前将其消化并重新接种至薄胶原凝胶上，因为若培养超过3周仍未传代，细胞片层中将出现空洞。为获得最佳细胞生长状态并最大限度减少成纤维细胞污染，在解剖和清洗步骤（2.3、2.4）中必须仔细而谨慎地去除包裹脆弱肝外胆管的结缔组织。若出现成纤维细胞生长，可在传代前使用手术刀切除或轻柔吸除受污染的厚胶原区域，以减少成纤维细胞的转移。这些细胞在前三个传代阶段中增殖迅速，但在更高代次时，增殖速度减慢，细胞体积增大并出现空泡化。我们已成功冻存胆管上皮细胞样本，并在后续时间重新接种，细胞活力良好；然而，解冻后的胆管上皮细胞增殖速度不及新鲜分离并传代的细胞。

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讨论

本文介绍了一种从各年龄段（包括新生小鼠）小鼠的肝外胆管中分离纯化胆管上皮细胞的技术。该技术的优势在于可将肝外胆管上皮细胞与肝内胆管上皮细胞分开进行研究，有助于识别这两类细胞群体之间的关键差异。我们近期发表的一项研究显示，采用本方法分离并感染恒河猴轮状病毒的肝外胆管上皮细胞中纤毛数量减少8。该技术的缺点包括操作劳动强度大，且需要精细解剖以防止成纤维细胞污染；此外，获得足够数量用于大多数实验的细胞需要细胞迁出及至少三周的体外培养时间。因此，这些细胞可能反映了与二维培养相关的改变。目前尚不清楚所获得的细胞群体中是否包含大量干细胞或来自胆管周围腺体的细胞9,10。

我们尝试利用该方法从大鼠中分离肝外胆管上皮细胞；然而，细胞在培养中未能生长。目前正在进行研究，以确定是培养基中缺乏关键的生长因子，还是需要调整其他培养条件。

最终，这种分离肝外胆管上皮细胞的方法可能有助于理解胆管纤维化肝内与肝外形式之间的差异，以及新生儿细胞与成人细胞之间的差异。

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

作者感谢宾夕法尼亚大学NIDDK消化与肝脏疾病分子研究和肝脏疾病中心（P30 DK50306）的分子病理学与影像学核心设施在成像方面提供的帮助。 本研究得到了美国国立卫生研究院（R01 DK-092111）以及Fred和Suzanne Biesecker儿科肝脏中心（资助对象：R.G.W.）的资助，同时获得了儿童肝脏疾病研究与教育网络提供的博士后奖学金（资助对象：S.K.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM/F12 (1:1)Gibco/ Life technologies11320-033500 ml，用于BEC培养基
FBSAtlanta BiologicalsS1115025 ml，用于BEC培养基
含非必需氨基酸的MEMGibco/ Life technologies11140-0195 ml，用于BEC培养基
胰岛素-转铁蛋白-硒Gibco/ Life technologies51300-0445 ml，用于BEC培养基
丙酮酸钠Cellgro25-000-CL5 ml，用于BEC培养基
化学成分明确的脂质浓缩液Gibco/ Life technologies11905-0315 ml，用于BEC培养基
青霉素-链霉素Cellgro30-002-CI5 ml，用于BEC培养基，分离过程中使用500 μl
庆大霉素Gibco/ Life technologies15750-0600.2 ml，用于BEC培养基，分离过程中使用500 μl
乙醇胺Sigma AldrichE9508-100ml0.13 ml，用于BEC培养基
MEM维生素溶液Gibco/ Life technologies11120-0525 ml，用于BEC培养基
大豆胰蛋白酶抑制剂Biowhittaker17-605E5 ml，用于BEC培养基。溶剂为PBS，配制成5 mg/ml的储备浓度
L-谷氨酰胺Cellgro25-005-CL5 ml，用于BEC培养基
牛垂体提取物Gemini500-1021.1 ml，用于BEC培养基
地塞米松Sigma AldrichD49020.5 ml，用于BEC培养基，储备浓度为393 μg/ml，用乙醇稀释
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸Sigma AldrichT63970.5 ml，用于BEC培养基，储备浓度为3.4 mg/ml，用乙醇稀释
表皮生长因子Millipore01-1010.5 ml，用于BEC培养基，25 μg/ml，用DMEM F12+1%BSA稀释
佛司可林Sigma AldrichF68865 ml，用于BEC培养基，使用浓度为0.411 mg/ml，用DMSO稀释
两性霉素B（Fungizone）Gibco/ Life technologies15290-0181 ml，用于BEC培养基，分离过程中使用500 μl
大鼠尾胶原蛋白BD Biosciences354236用量根据胶原蛋白浓度而定
PBS 10xUSB Corporation75889使用时为10倍浓度，无菌，用于配制胶原蛋白，用量取决于胶原蛋白浓度
dH2ON/AN/A无菌，用于配制胶原蛋白，用量取决于胶原蛋白浓度
10 N NaOHFischer Scientificss255-1稀释至1 N，无菌，用于配制胶原蛋白，用量取决于胶原蛋白浓度
来自溶组织梭菌的XI型胶原酶Sigma AldrichC7657用DMEM稀释并在使用前经无菌滤膜过滤
胰蛋白酶-EDTA (1x) 0.25%Gibco/ Life technologies25200-0563 ml，孵育时间最长10分钟
胰蛋白酶-EDTA (10x) 0.5%Gibco/ Life technologies15400-0543 ml，孵育时间最长10分钟
解剖显微镜NikonSMZ645其他型号亦可接受
光源（光纤照明器）Schott-FostecAce EKE LR 92240其他型号亦可接受
12.5 cm直剪虹膜剪Kent Scientific其他型号亦可接受
6" 带细尖端的无齿弯镊Electron Microscopy Sciences其他型号亦可接受
4" 带细尖端的有齿不锈钢镊Electron Microscopy Sciences其他型号亦可接受

参考文献

  1. Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
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