用于表征鱼藤酮诱导的帕金森病模型中自发性及惊吓诱导运动行为的方法 果蝇

摘要

帕金森病是一种神经退行性疾病，由中枢神经系统中多巴胺能神经元的退化引起，导致运动功能障碍。鱼藤酮可在Drosophila（果蝇）中建立帕金森病模型。本文介绍了两种检测方法，用于表征由鱼藤酮引起的自发性运动障碍以及惊吓诱发的运动障碍。

摘要

帕金森病是一种神经退行性疾病，由中枢神经系统中多巴胺能神经元的退化引起，主要发生在黑质部位。该疾病导致运动功能障碍，在人类中表现为僵硬、震颤和痴呆。鱼藤酮是一种杀虫剂，通过抑制线粒体电子传递链的功能引起氧化损伤，也可用于建立帕金森病的动物模型。 果蝇果蝇具有固有的负向趋地性反应，当受到惊扰时会向上攀爬。已有研究证实，鱼藤酮会导致果蝇早期死亡及运动功能障碍，使其在被轻敲向下后丧失向上攀爬能力。然而，鱼藤酮对果蝇自发运动的影响尚缺乏充分记录。本研究提出了两种灵敏、可重复且高通量的检测方法，用于表征鱼藤酮引起果蝇短期惊吓诱导运动能力缺陷和长期自发运动能力下降的情况 果蝇这些检测方法可方便地加以调整，用于表征其他 果蝇 运动缺陷模型及治疗药物疗效评估

引言

运动功能障碍是帕金森病的主要症状，主要由黑质多巴胺能神经元的退化引起¹。鱼藤酮是一种酮类杀虫剂，已被广泛用于在Drosophila中建立帕金森病运动功能障碍的模型^2-6。鱼藤酮通过阻断氧化磷酸化通路引发氧化损伤，最终导致细胞死亡⁷。多巴胺能神经元对鱼藤酮的毒性更为敏感，使得该化学物质的作用主要表现为运动功能障碍^2,7。通过在果蝇中诱导帕金森病症状，我们可以更深入地理解该疾病并改善其症状^6,8-11。Drosophila是研究这一效应的理想模型，因其基因操作简便、易于饲养且生命周期短。

多项研究表明，鱼藤酮会导致果蝇（Drosophila）出现短期惊跳诱导的运动缺陷——当果蝇在添加鱼藤酮的食物中饲养时，其受到惊跳刺激后的负向趋地性反应会变慢^2-6。与对照组相比，果蝇在试管装置中向上攀爬的速度减慢，表明其存在惊跳诱导的运动缺陷。

鱼藤酮对长期自发运动的影响尚不明确。 果蝇 活动监测器（DAMs）已成功用于监测运动行为 果蝇 昼夜节律研究^12,13将果蝇分别放入单独的管中，并装入DAM系统。该装置配备有红外传感器，可记录果蝇穿过红外光束的次数。这些计数可用于评估果蝇不受干扰状态下的运动和活动水平^12,13通过将果蝇置于DAM中，可表征鱼藤酮对其长期运动能力的影响。本研究描述了测量短期惊吓诱导运动和长期自发运动的方法，以更深入地理解鱼藤酮介导的运动功能缺陷。对模拟帕金森病的运动缺陷进行表征具有重要意义，因其有助于研究其他可能逆转此类运动障碍的化合物。

方案

1. 果蝇 惊跳诱导的运动行为检测

1. 药物处理
   1. 使用 CO₂ 麻醉以固定所需数量（约 8-12 只）的 1-3 日龄雄性果蝇₂ 并将它们转移到含有药物补充食物的离心管中。注意：另一种麻醉剂 例如， 可以使用乙醚或冰对果蝇进行麻醉，以便于计数和操作。
   2. 让果蝇在水平放置的试管中恢复麻醉状态20分钟（或直至完全恢复），以防止果蝇粘附在食物上；随后将试管直立，置于25 °C、12小时黑暗/12小时光照的培养箱中继续实验。
2. 实验设置
   1. 用永久性记号笔在双瓶装置的瓶壁上画圆标记，将其分为三个相等的部分，每段长度为6.33 cm。
   2. 药物暴露3天后，将果蝇在不麻醉的情况下转移至底部小瓶中，并迅速将上部小瓶盖在开口上。用透明胶带将两个小瓶固定在一起。
   3. 让果蝇在新环境中适应15分钟。
   4. 将小瓶置于白色背景上，并将数码相机放置在双小瓶装置前方适当距离处，确保计时器可见。调整相机位置，使整个装置完整出现在单张图像画面中，且所有果蝇均处于清晰对焦范围内。为保持各次试验图像范围的一致性，需标记相机和小瓶的固定位置。
3. 迁移实验
   1. 在摄像视野中清晰显示试验编号、药物处理和计时器。
   2. 用力将双瓶装置在实验台面上轻敲3次，确保所有果蝇均落入瓶底。同时启动计时器。
   3. 每1分钟内每隔5秒拍摄一次装置的照片。注意：也可录制视频，并在适当的时间间隔暂停视频进行测量。
   4. 让果蝇恢复静置 1 分钟，期间不要打扰。
   5. 重复上述步骤2次，每次试验之间间隔1分钟恢复时间。注意：每套装置的数据采集需耗时5分钟。各次试验之间的敲击力度应保持一致。可同时操作多个（至少3个）装置。
4. 数据分析
   1. 观察并记录随时间推移各区域内的果蝇数量。计算随时间推移各区域内果蝇的百分比。 注意事项：使用同一批果蝇，在2至3个感兴趣的时间点重复整个实验过程，例如第3、5和7天。若实验过程中果蝇死亡过多，可增加初始实验果蝇数量以补偿死亡率。采用适当的统计学方法对数据进行比较。

2. Drosophila 自发运动检测

1. 食物制备
   1. 用 15 ml 去离子水和所需剂量的鱼藤酮（或其他感兴趣的药物）重悬 3 g 即用型 Drosophila 培养基。
   2. 待食物混合物凝固（约 5 分钟）后，小心地将食物装入制造商提供的透明管（5 mm × 65 mm）中，高度约为 1 cm。通过将管子垂直插入食物中并轻轻旋转，使食物进入管内。注意：可在管口轻按手指以形成负压，有助于填充。食物中不应含有气泡或表面不平整，否则果蝇可能被困住。
2. 实验设置
   1. 在靠近食物一端的管口盖上塑料帽。尽量轻柔地推入塑料帽，以免用力过猛在瓶内产生气泡。
   2. 使用 CO₂ 麻醉 1 日龄雄性果蝇，并用画笔小心地将 1 只雄蝇放入每根管中。根据所需实验重复次数重复此步骤。
   3. 用一小团棉球塞住远离食物一端的管口，棉球可由市售大团棉花手工搓成。
   4. 将管子水平放置，让果蝇恢复 15 分钟，确保所有果蝇存活且活动正常。将管子插入 DAM 系统，并确保所有管子相对于 DAM 的位置一致。注意：可将监测区域置于管子中部，也可将所有管子推至一侧，使管子末端处于监测范围内。注意：有关该方法的变体，请参见讨论部分。
3. 数据采集
   1. 将 DAM 系统置于设定为 25 °C、12 小时黑暗与 12 小时光照循环的培养箱中。将 DAM 连接到数据采集系统。打开 DAM 软件，在“偏好设置”中选择时间间隔（bin length）为 10 分钟。开始数据采集，并让程序连续采集 7 天的数据。注意：如有需要，可调整时间间隔。
   2. 数据分析
      注意：对数据进行处理，以每分钟活动计数作为长期自发运动的衡量指标。
      1. 打开 DAM 文件扫描程序，点击“选择输入数据”以访问监测数据。
      2. 选择适当的监测器范围，并将时间间隔设为 10 分钟。
      3. 在输出文件类型中选择“通道文件”。其余选项保持默认设置。
      4. 点击“扫描数据”并保存至指定文件夹。
      5. 将数据导入昼夜节律分析软件，获得每分钟计数。注意：Clocklab 软件常用于数据分析，但也有其他可用选项。

结果

果蝇 惊吓诱导运动行为检测

野生型 canton-S 果蝇表现出强烈的负向趋地性反应，在双管装置中经过30秒后，约88%和5%的果蝇分别位于上部和下部区域（图1）。经125 μM和250 μM鱼藤酮处理3天的果蝇，其上部区域的果蝇数量略有减少，下部区域的果蝇数量略有增加。经500 μM鱼藤酮处理的果蝇表现出显著的负向趋地性反应缺陷（p < 0.05，ANOVA，Bonferroni成对比较），表现为与对照组果蝇相比，上部区域的果蝇数量更少，而下部区域的果蝇数量更多（图1）。这种由于无法在装置中迅速攀爬而导致的负向趋地性反应缺陷，提示存在惊吓诱导的运动能力障碍。

Drosophila 自发运动检测

野生型 ...

讨论

在本研究中，我们描述了两种用于检测鱼藤酮诱导条件下长期自发运动和短期惊吓诱发运动的方法 黑腹果蝇 帕金森病模型。还可以测量暴露于其他已知可模拟帕金森病的药理学试剂的果蝇的这些运动特征 例如， 百草枯¹⁴帕金森病的遗传模型 例如， α-突触核蛋白突变体¹⁵以及其他影响运动能力的果蝇疾病模型。对于这两种方法，均可考虑替代方案和修改方案。可以使用冰对果蝇进行麻醉，这有助于缓解CO₂麻醉的一些局限性。₂ 麻醉，例如在数据收集中因二氧化碳滞留导致的延迟₂ 效果消退。

在惊跳诱导的运动实验中，由于果蝇的活动能力存在昼夜节律变化，因此在不同实验之间于每天相同时间点采集数据至关重要。此外，将果蝇引入测试装置时应避免使用麻醉。与大多数依赖在预定时间内跨越阈值瞬间状态的惊跳反应运动实验不同^10,11,15,16，我们的方法类似于快速迭代负向趋地性（RING）实验^17,18，能够对一段时间内多个连续时间点的运动情况进行监...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
标准窄瓶	Genesee Scientific	32-120
鱼藤酮	Sigma	R8875	储存于冷冻柜中，每次实验前新鲜配制
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D8418	鱼藤酮的溶剂
即用型果蝇培养基	Carolina Biological	配方 4-24
果蝇活动监测仪（DAM）	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM 管	Trikinetics	5 × 65 mm 管
含鱼藤酮食物配方（125 mM 剂量）			将 25 mg 鱼藤酮溶于 1 ml DMSO 中，配制成 62.5 mM 的鱼藤酮储备液；对于 125 mM 剂量，将 10 mM 鱼藤酮储备液（溶于 DMSO）加入 5 ml 水中。