大鼠肺转移瘤微循环血流速度的自动化测量

摘要

本文介绍了一种利用闭胸肺部活体显微镜技术，以自动化方式测量大鼠胸膜表面肺转移性肿瘤微循环血流速度的方法。该模型有望成为在啮齿类动物中开展肺转移灶生理学研究的广泛应用工具。

摘要

由于肺是转移性疾病的最主要靶器官之一，用于研究肺转移病灶生理学的动物模型具有重要意义。然而，由于难以通过显微镜直接观察肺组织，目前能够在微循环水平上动态研究肺转移病灶的方法极为有限。本文介绍了一种活体显微成像技术，结合封闭胸腔的肺窗以及血流速度和方向的自动化分析，用于功能性成像并定量分析大鼠表浅肺转移病灶的微循环。该方法的应用展示了其在检测药物干预后血流速度增加方面的有效性，并可对实体瘤中典型的迂曲血管结构进行成像。这是首次在封闭胸腔模型中对肺转移病灶开展活体显微成像研究。由于该技术具有最小的侵入性，且操作相对简便、实用性强，有望在专注于肺肿瘤研究的实验室中得到广泛应用。

引言

肺是转移性疾病最重要的靶器官之一，由于化疗和放疗对此类病情的治疗效果有限，目前仍难以实现治愈^1,2。实体原发性肿瘤和转移性肿瘤具有特定的病理生理学和微循环特征，例如微区域缺氧、扩散受限以及低效的肿瘤血管系统，这些因素显著增强了肿瘤对抗癌治疗的耐受性^3,4。由于微血管血流等参数具有微观尺度和动态特性，活体动物体内肿瘤的活体显微镜观察已成为该领域极为重要的研究工具⁵。尽管活体显微镜模型已被应用于多个器官部位的肿瘤研究，包括在打开肋骨暴露条件下的转移性肺组织，但目前尚未建立可在生理功能保持完整、闭合胸腔环境下研究肺转移的实验方案^6,7。此类研究尤其受限于必须通过外科手段进入肋骨区域，同时又不能影响肺的整体功能^7-9。最近，已有研究提出一种方法，可在闭合胸腔条件下，利用荧光活体显微镜对活体大鼠肺部微循环血流进行成像¹⁰。该方案能够在维持动物生理稳定性和肺组织完整性的前提下，通过计算机分析系统定量测定注射的荧光标记红细胞的血流速度¹¹。本研究展示了如何改进该技术，以对免疫缺陷大鼠经尾静脉接种后形成的位于胸膜表面的肺转移灶进行微循环血流的成像与定量分析。该模型也是首个在闭合胸腔活体显微镜环境下研究转移性肺肿瘤的模型。

方案

注意：本方案中所述的所有涉及动物的操作均已获得杜克大学机构动物护理和使用委员会（DUIACUC）的预先批准。

1. 肿瘤细胞培养与接种

1. 培养荧光标记的转移性癌细胞（例如 人MDA-MB-231-GFP乳腺癌细胞（由美国国家癌症研究所Dr. Patricia Steeg惠赠）和YFP标记的小鼠肉瘤细胞（由杜克大学医学中心放射肿瘤学系Dr. David Kirsch惠赠），置于适当培养基中培养例如 在37 °C条件下，使用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养，直至细胞融合度达到约90%。
2. 用胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗涤两次，计数后使用27 G针头的注射器将细胞注入异氟烷麻醉的10周龄雌性裸鼠尾静脉，每只动物注射500万个细胞。通过脚趾夹捏无反应确认动物达到手术麻醉水平。

2. 使用微型CT监测转移灶

1. 每周使用微型CT/微型照射器检查大鼠一次，以检测直径约2 mm以上的转移灶。微型CT的调试如前所述¹²。
   1. 成像前，用3%异氟烷对大鼠实施麻醉。通过夹捏脚趾确认深度麻醉状态。
   2. 麻醉起效后，迅速将大鼠转移至成像室内的成像托架上，并通过鼻罩连接2.5–3%的异氟烷-空气混合气体。使用托架上的外部位置控制装置和激光定位器，调整大鼠在托架中的位置，使其胸腔位于微型CT扫描仪的光子束路径中。确保成像室门已关闭，以保护研究人员免受γ射线辐射。
   3. 再次使用彩色视频摄像头确认动物位置。进行一次低分辨率CT成像测试，根据所得图像调整视野至胸腔的xyz维度。
   4. 使用2 mm铝滤片，在40 kVp、2.5 mA、0.008体素、7 FPS条件下对大鼠胸腔进行成像，之后将动物放回笼中。单只动物的成像时间不应超过15至20分钟。接受过手术的动物，在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
   5. 通过观察是否存在无法由胸腔内血管解释的相对致密影（放射不透明物体）来确认转移灶（图1A）

3. 窗口小室手术

1. 麻醉、生命体征监测与尾静脉插管
   1. 选择存在转移性疾病的动物，以50 mg/kg剂量经腹腔注射戊巴比妥钠。在继续操作前，通过夹捏脚趾确认动物已达到外科手术所需的麻醉深度。
      注意：麻醉方案应根据具体的实验设置进行调整。此处选用戊巴比妥钠作为长效麻醉剂，以在长时间操作中维持深度麻醉，并便于重复给药。然而，戊巴比妥钠麻醉易导致动物因过量而死亡。另一种可选方案是使用氯胺酮联合镇静剂（如赛拉嗪或美托咪啶），该组合对自主神经反射的抑制程度较戊巴比妥钠更轻，但仅允许一次重复给药。
   2. 使用电动剃毛器剃除患侧体表及颈部区域的毛发。清除皮肤表面所有残留的松散毛发。在去除松散毛发后，向眼部涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
      注意：无胸腺裸鼠可能存在残余毛发，必须在手术前彻底清除。彻底去除所有毛发极为重要，因为残留毛发可能干扰手术操作和成像过程。
   3. 将动物仰卧位固定于金属板上，金属板置于37 °C循环水加热垫上。使用胶带将动物的前肢和后肢固定在金属板上。
      注意：在整个手术和实验过程中，使用脉搏血氧仪监测并记录心率和动脉血氧饱和度等生命体征，有助于保障动物安全。
2. 气管插管
   1. 为建立通气导管，首先在颈部做横向皮肤切口，随后沿气管腹侧正中分离纵向肌层。
   2. 使用尖头镊子反复开合动作，在气管背侧建立缝线通道。
   3. 在气管腹侧做一小切口，切口不超过半圆形，位置通常介于第二与第三气管环之间。保留足够长度的气管背侧暴露，以便固定气管导管。
   4. 将直径为2.5至3.0 mm的“Y”型气管套管插入气管，并用4-0单股缝线结扎固定。确保套管连接至压力循环式呼吸机，呼气管路连接一个盛有6 cm水柱的瓶子，以维持肺部正压。通入气体应为100%氧气，除非实验设计另有要求。
   5. 使用25–27 G针头、内含肝素化生理盐水的导管插入大鼠尾静脉之一，并用胶带固定。
      注意：在整个操作过程中，应通过定期向尾静脉注入少量肝素化生理盐水，确保尾静脉导管通畅。此外，经口-气管插管（即通过麻醉动物口腔将气管导管经喉部插入气管）是本处所述气管切开术的一种替代方法。然而，该方法需要特殊培训和经验，以避免损伤气管或误入食管。
3. 肺窗装置的应用
   1. 在转移性疾病所在侧胸壁做切口，通过钝性分离剥离皮肤。
      注意：皮肤可在分离后完全切除并移除。
   2. 继续分离覆盖的两层肌肉组织（胸大肌、前锯肌和背阔肌），但保留肋间肌完整。通过切除通常为两根相邻肋骨的部分组织，在胸腔创建一个直径约1.5 cm的穿孔。理想情况下，穿孔位置应位于第六与第七肋骨区域。
   3. 截骨术：
      1. 为减少出血并避免肺表面损伤，在切割时需用带齿外科镊牢固夹持待切肋骨。使用外科剪首先以约45°角斜向剪断肋骨内侧，使残留肋骨断端尖端朝外。
      2. 随后以类似方式剪断肋骨外侧，同样使断端尖端朝外，以防止损伤肺表面。
      3. 对相邻肋骨重复上述操作，然后剪断肋间肌并移除切除的骨片。在此过程中，应通过调节呼吸机的吸气压力，适当控制肺内压力，以最小化肺表面与胸壁之间的机械相互作用。
   4. 窗片植入：
      1. 植入定制的肺窗装置，该装置由连接于聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）套座的盖玻片组成（图1B）。通过胶合或涂抹极少量真空脂将窗片固定于套座。植入时应使表面转移灶位于窗片中心附近。如有必要，可通过略微扩大穿孔相应侧边缘，调整植入位置，使微转移灶居中。
         注意：胸膜表面的转移病灶表现为肺表面健康组织（通常呈粉红至鲑鱼色）中清晰可辨的白色斑点或区域，多沿肺裂分布。尽管微转移灶可能出现在胸膜其他部位，但在影像学可检测到转移性疾病后，所研究的细胞系几乎总是在穿孔区域表现出表面微转移灶。
      2. 将套座插入穿孔并与肺脏层胸膜直接接触后，使用4.0单股缝线将窗框边缘缝合固定于周围肋间肌（图1C）。适当提高呼吸机吸气压力，帮助残余空气排出并形成密封。
         注意：大鼠呼吸频率受麻醉深度、兴奋或焦虑状态、吸入氧浓度（FiO₂）等多种因素影响，变化较大。建议将呼吸频率调节至70–90次/分钟。调节吸气压力时应谨慎，不宜超过约8 cm H₂O（0.6 mmHg），以避免肺表面损伤。
   5. 将动物置于特制的限制装置中，该装置设计用于消除Z轴方向移动（图1D），并将其固定于置于恒温（电加热）垫上的金属板，在荧光显微镜下进行观察。使用直肠热敏电阻监测动物体温。调节动物固定装置的螺钉及呼吸机吸气压力，以实现对侧向移动的最佳控制。
      注意：哺乳动物的自然呼吸涉及肺部和胸廓在三个方向上的运动：双侧、背腹向和头尾向。为尽可能保留自然呼吸运动，应将Z轴方向的压迫限制在必要范围内。由于Z轴方向的限制可能引入影响血流及其他参数的人工假象，建议在同一动物的系列重复测量中保持条件恒定。

4. 微循环血流的成像与测量

1. 通过心脏穿刺收集红细胞，并按照先前所述方法用DiI（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）进行标记 ¹⁰.
2. 在进行窗式手术前，向大鼠尾静脉注射300 µl标记的红细胞，以避免红细胞首次通过时与玻璃窗发生粘附效应。注射器或导管中的任何气泡均需排除，因为将空气注入静脉会阻碍后续的注射操作。
3. 使用显微镜CCD相机在-40°C芯片冷却温度下成像血流，整体分辨率约为100倍即 使用10倍显微镜物镜和10倍前置相机目镜。采用标准的罗丹明/TRITC滤光片组（激发光波长450-490 nm，发射光波长 >515 nm）。记录所得图像序列的实际帧率和像素分辨率。每个图像堆栈至少记录200幅图像（理想情况下约300幅），以确保能够成功分析流速。
4. 每隔1小时通过腹腔注射约1 ml生理盐水，以补充动物的液体流失。
   注意：涉及干预措施的实验设置， 例如 一种可调节肺部癌症转移灶血流速度的药物，需要对肺部转移性癌症的血流速度进行重复测量。在这些长期实验中，为动物补充充足的液体至关重要。
5. 通过尾静脉注射 3 ml 3N KCl 处死动物
6. 使用已发表的、公开可获取的基于 Matlab 的计算机算法评估图像序列，该算法将为所有血流轨迹生成流速灰度图和彩色编码图 ^10,11随后，使用商业或公开的图像分析软件（如 Image J），在对表示无血细胞移动的数值进行阈值处理后，评估所得的灰度图像。 即 无活性血管系统。

结果

实体瘤中的脉管系统与正常血液供应存在显著差异，表现为更高的扭曲程度和更大的血管间距离¹³。因此，与正常的肺微循环（图2A，上层面板）相比，实验性肺转移性乳腺癌和肉瘤的血流路径呈现出不规则的形态以及较大的血管间隙（图2A，下两个面板）。在之前的一项研究中，已证明肺窗技术能够自动测量正常肺组织中血流速度的变化¹⁰。为了探究肺窗技术是否也能检测肺转移灶中血流速度的增加，本研究采用了拟交感药物麻黄碱与内皮素阻断剂安贝生坦的联合用药方案——该组合近期被发现可增强健康肺组织的微血管循环（相关数据正在别处审稿中）。本研究展示了该方法能够检测到小鼠肉瘤肺转移灶中因给予麻黄碱（20 mg/kg）和内皮素受体拮抗剂安贝生坦（0.5 mg/kg，两种药物均腹腔注射）联合治疗所引起的血流速度升高（图2B）。每个数据点代表在五只动物中获得的数据，每只动物进行三次间隔五分钟的测量，取其个体平均值后再进行汇总平均。第一次给药显著（p <0.01）提高了肿瘤区域的血流速度，从0.61 ± 0.12 mm/sec上升至0...

讨论

本文介绍了一种可行的模型，可用于通过活体显微镜和计算性血流分析，对大鼠肺转移灶中的微循环血流及其他动态过程的变化进行成像。尽管已有其他方法可在打开胸腔暴露肺组织的情况下对啮齿类动物肺部进行显微观察，但该模型是首个能够在闭合胸腔条件下，通过胸壁穿孔对肺转移灶进行成像的技术。利用该方法，已证实可有效测量药物诱导的肺转移灶微循环血流变化。

目前存在两种基本方法可用于对具有自主血流灌注且肺表面直接暴露的活体啮齿类动物肺部进行成像：开胸模型通过在肺表面应用负压吸引窗，消除了因呼吸和心脏活动引起的肺持续运动问题，同时允许心肺复合体在开放的胸腔内正常扩张与收缩^7,14。尽管该方法提供了良好的实验可及性，但开胸状态和负压吸引窗的使用相较于完整肺的生理条件会引入人为假象⁸。另一种方法为闭胸手术模型，其基本保持肋骨结构完整，有望维持完整胸腔内的原始生理状态，例如心脏与肺运动之间对彼此血流动力学的相互影响。这类模型通常包括一个缝合固定于胸壁并带有观察窗的支架¹⁵，或使用一层透明膜直接接触肺表面以防止组织干燥⁹。然而，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无胸腺裸鼠	Charles River	品系编号 316	10 周龄雌性无胸腺裸鼠
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	使用 MicroCT 检测转移灶
DiI（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）	Sigma Aldrich	468495-100MG	将 100 µl 压积红细胞与 100 µl 浓度为 0.5 mg/ml 的 DiI 溶于 200 体积乙醇中，加入 2 ml 5% 葡萄糖水溶液，并用生理盐水补足至终体积 10 ml
啮齿类动物呼吸机	Kent Scientific	TOPO 小动物呼吸机	该设备对于在造成气胸后维持肺部正压至关重要
蔡司 Axioskop 直立荧光显微镜	蔡司	Axioskop	用于活体成像的显微镜
Andor CCD 相机	Andor	iXonEM 885	用于血流实时成像的 CCD 相机
脉搏血氧仪	StarrLife	MouseOx	脉搏血氧仪
荧光显微镜	蔡司	Axioskop	荧光显微镜