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方法文章

高通量分析哺乳动物嗅觉受体：通过荧光素酶活性检测受体激活

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⸱

DOI：

10.3791/51640

⸱

2014年6月2日

 ,  , 
1Monell Chemical Senses Center

本文内容

摘要

嗅觉受体的激活模式编码了气味的身份信息，但由于目前尚无公开发表的数据来明确哺乳动物嗅觉受体的气味配体，这阻碍了构建全面的气味编码模型。本实验方案描述了一种方法，可促进嗅觉受体配体的高通量鉴定以及受体激活程度的定量分析。

摘要

气味分子可产生独特且相互重叠的嗅觉受体激活模式，使得约1,000种小鼠和400种人类嗅觉受体能够识别数千种气味分子。目前发表的配体仅针对不到6%的人类嗅觉受体1-11这一数据缺乏部分是由于在异源系统中功能性表达这些受体存在困难。本文介绍了一种在Hana3A细胞中表达大多数嗅觉受体的方法，随后利用荧光素酶报告基因检测法对嗅觉受体的激活进行高通量评估。该检测方法可用于：（1）对一系列气味分子与一系列嗅觉受体进行筛选；（2）通过剂量反应曲线验证气味分子与受体的相互作用；（3）比较不同受体变异体之间的激活水平。在我们的示例数据中，对328个嗅觉受体与26种气味分子进行了筛选。选取了响应评分不同的气味分子/受体组合进行剂量反应测试。这些结果表明，筛选是一种有效富集可通过剂量反应实验验证的气味分子/受体组合的方法。 即 对气味分子具有真实响应的受体。因此，这种高通量荧光素酶检测方法是表征嗅觉受体的有效手段，是建立哺乳动物嗅觉系统气味编码模型的关键步骤。

引言

哺乳动物的嗅觉系统能够响应大量气味刺激，从而实现对数千种气味分子的检测与区分。嗅觉受体（ORs）是由嗅上皮中的嗅觉感觉神经元所表达的分子感受器12。哺乳动物对气味的识别是通过气味分子差异性地激活不同的OR实现的，而OR基因家族十分庞大，包含约1000个鼠源和400个人源受体12-16。既往在嗅觉神经元及异源细胞系统中对OR进行的功能分析表明，不同气味分子可被独特但存在重叠的OR组合所识别10,17-20。将配体与OR准确匹配对于解析嗅觉编码机制至关重要，也是构建有效嗅觉模型的基础。然而，由于OR在异源系统中表达困难，加之气味分子和OR数量庞大，相关数据在该领域中长期匮乏；事实上，已发表配体的人源OR不足6%1-11。本实验方案描述了利用荧光素酶报告基因检测法来表征气味分子与OR相互作用的方法。该检测方法可实现对OR的高通量功能表征，这对于深入理解气味分子与OR的相互作用以及建立气味编码模型具有重要意义。

OR 的高通量研究面临三大主要挑战。首先，在异源细胞中表达的 OR 通常滞留在内质网中，并随后在蛋白酶体中被降解21,22，从而阻止了 OR 在检测系统中与气味分子相互作用23-25。这一问题因发现辅助蛋白而得到解决，这些蛋白可促进多种 OR 在细胞表面稳定表达19,26,27。受体转运蛋白 1 和 2（RTP1 和 RTP2）可促进 OR 在细胞表面的表达，并在气味刺激下激活受体19。基于此项研究，HEK293T 细胞被改造为稳定表达 RTP1 长亚型（RTP1L）、RTP2、受体表达增强蛋白 1 以及 Gαolf，由此构建出 Hana3A 细胞系19,27。此外，3 型毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M3-R）可在细胞表面与 OR 相互作用，并增强其对气味分子的响应活性26。将一种 OR 与 RTP1S 和 M3-R 共转染至 Hana3A 细胞中，可实现多种 OR 在细胞表面强健、稳定且具有功能性的表达27。第二，哺乳动物的 OR 基因库规模庞大。例如在人类中，OR 基因库的数量级远超味觉受体基因库，并且比视觉受体基因库大 2 个数量级。尽管克隆单个 OR 是一项相对直接的操作流程，但要构建一个全面的文库仍需大量前期投入。第三，尽管我们已知在视觉中波长对应颜色，在听觉中频率对应音高，但气味的编码机制仍不清楚，这使得研究人员难以从代表性气味分子样本中进行推断。尽管在此方面已取得一定进展10,28，但嗅觉图谱仍不完整。对数万个分子与数百种 OR 进行筛选是一项艰巨任务；该领域的高通量筛选需要精心设计的系统性方案。目前主要的挑战在于后勤与成本，而非技术本身固有的问题。尽管异源筛选尚未被学术界广泛用于配体鉴定，但已有私营企业利用相同技术鉴定了 100 种人类 OR 的配体29。遗憾的是，这些数据仍属商业机密。

本文所述的高通量荧光素酶检测方法相较于其他评估嗅觉受体（OR）激活的方法具有多项优势。尽管已有研究通过电生理学和钙成像技术测量了天然嗅觉感觉神经元的反应，但由于嗅觉神经元的反应特性存在重叠，这些技术难以区分具体是哪种OR介导了神经元的响应。虽然通过敲入GFP标记的受体类型30,31、利用腺病毒将特定受体递送至小鼠嗅觉神经元32,33，或在记录后进行RT-PCR17,24,33等方法可将电生理记录与单一受体类型关联，但这些方法通量较低，不适用于大规模筛选。异源筛选系统更具可扩展性，文献中主要有两种形式：cAMP通路报告系统和三磷酸肌醇（IP3）通路报告系统。在气味刺激下，OR激活Gαolf介导的转导信号级联反应，导致环磷酸腺苷（cAMP）的生成12。通过共转染由cAMP反应元件（CRE）调控的萤火虫荧光素酶报告基因，可测量气味响应所引发的荧光素酶产量，从而定量评估OR的激活程度。OR的激活也可通过共表达Gα15/16或Gα15-olf嵌合体等G蛋白，与IP3通路相偶联24,25,34。我们选择本实验方案基于以下三个因素：（1）RTP1与Rho标签化嗅觉受体共表达可增强嗅觉受体在细胞表面的表达水平19,27；（2）采用cAMP响应性报告基因可经由经典的第二信使通路检测OR激活；（3）该方法适用于高通量筛选。

这种高通量荧光素酶检测方法适用于嗅觉研究领域的多种研究。首先，可将大量嗅觉受体（OR）与单一气味分子进行筛选，以确定特定气味分子的受体激活模式。此类研究已鉴定出OR7D4是响应类固醇气味分子雄甾酮的嗅觉受体8。相反，也可将单一OR与一组气味分子进行筛选，以确定该受体的响应谱型10。当通过上述筛选鉴定出潜在的嗅觉气味分子/OR配对后，可通过剂量-反应实验进一步验证其相互作用，即检测OR对逐步增加浓度的气味分子的响应情况。剂量-反应曲线还可用于评估OR基因变异如何影响体外（in vitro）对气味分子的响应8,9,11,35，这些研究亦可扩展至不同物种间的OR变异，从而探究受体在物种间的进化过程及进化中的因果突变36,37。最后，该检测方法还可用于筛选已知气味分子/受体配对中能够拮抗特定气味分子诱导的OR响应的气味拮抗剂38,39。总之，这种高通量荧光素酶检测方法适用于一系列研究，有助于表征OR的激活模式，并增进对嗅觉系统中气味编码机制的理解。

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方案

1. Hana3A 细胞的培养

  1. 通过在最低必需培养基（MEM）中添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）来制备M10培养基。
  2. 细胞培养维护
    1. 在M10培养基中培养细胞。注意：RTP1L、RTP2、REEP1和Gαolf的表达载体赋予Hana3A细胞嘌呤霉素抗性，但使用该抗生素维持细胞培养对检测结果无显著影响。
    2. 每2-3天以1:8的比例在10 cm培养皿中传代。
    3. 在37 °C、5% CO2条件下孵育。

2. 转染用细胞的铺板

  1. 从一个100%融合的10 cm培养皿的Hana3A细胞中吸除培养基。
  2. 加入10 ml PBS洗涤细胞，轻轻晃动培养皿后吸除PBS。
  3. 加入3 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA，等待细胞解离（约1分钟）。
  4. 加入5 ml M10以终止胰蛋白酶作用，并用10 ml移液器反复吹打约10次 以分散细胞团块。移液时应小心操作，避免将气泡引入培养基中。
  5. 对于每块96孔板，将1 ml细胞悬液转移至15 ml锥形离心管中，以200 × g离心5分钟，随后吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  6. 按照每转移1 ml细胞加入6 ml M10的比例重悬细胞。
  7. 向每孔96孔板中加入50 µl细胞悬液，于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。

3. 嗅觉受体的转染

  1. 质粒DNA的制备
    1. 通过无内毒素方案制备质粒DNA。注：使用指定的无内毒素质粒DNA提取试剂盒 "无内毒素，" 或在质粒DNA制备方案中加入苯酚-氯仿抽提步骤。
    2. 将DNA用TE缓冲液稀释至浓度为100 ng/µl。
  2. 观察已铺板的细胞（步骤 2.7），确保每孔细胞汇合度约为 30–50%，然后放回培养箱。注意：尽管该汇合度并非脂质体转染试剂的最佳条件，但在转染后 24 小时检测荧光素酶活性时，此步骤的细胞汇合度为 30–50% 最为适宜。
  3. 转染混合物的制备
    1. 将 RTP1S-pCI、M3-R-pCI、pCRE-luc 和 pSV40-RL 质粒按上述详细体积加入 MEM 培养基中 表1 制备质粒混合物（所示体积为每块96孔板的用量）。
      质粒混合物
      每孔每96孔板
      MEM--500 µl
      RTP1S-pCI5 ng480 ng
      M3-R-pCI2.5 ng240 ng
      pCRE-luc10 ng960 ng
      pSV40-RL5 ng480 ng

      表1. 质粒混合物组分 每孔及每块96孔板中RTP1S-pCI、M3-R-pCI、pCRE-luc和pSV40-RL的体积，以及MEM的体积。
    2. 每个96孔板中，将18 µl脂质转染试剂加入450 µl MEM培养基中稀释。
    3. 将质粒混合物（来自步骤 3.3.1）、pCI 质粒中的视紫红质标记嗅觉受体（Rho-OR-pCI）以及脂质转染混合物（来自步骤 3.3.2）移液，以制备详细的复合物 表2用移液器吹打混匀溶液，在室温下孵育15分钟。根据方案加入M10终止反应。 表2注意：该反应对时间敏感，不应超过30分钟。计算“孔数+10%”对于确保后续步骤有足够的体积至关重要。
      复杂
      每孔每孔 + 10%
      质粒混合物4.2 µl4.58 µl
      Rho-OR-pCI0.05 ng0.06 ng
      脂质转染混合物4.2 µl4.58 µl
      M1041.7 µl45.83 µl

      表2. 复合成分。 每孔及每孔加10%体积的质粒混合物（表1），嗅觉受体质粒（Rho-OR-pCI）和脂质转染混合物。反应进行15分钟后加入M10以终止反应 室温孵育
  1. 轻敲细胞培养板以去除培养基。
  2. 向每孔加入 50 µl 复合物，并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。

4. 气味刺激

  1. 观察转染后的细胞，确保每个孔的汇合度为50-80%，然后放回培养箱。注意：如果细胞汇合度低于50%，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的读数可能过低，无法准确检测受体激活情况。建议弃用该孔板。
  2. 用DMSO配制每种气味分子的1 M储备液。
  3. 在CD293培养基中配制气味刺激溶液。
    1. 对于筛选实验，将气味储备液稀释至100 µM。同时准备无气味对照组（仅含CD293培养基），以排除嗅觉受体的本底激活。注意：在筛选实验中，每个受体/气味配对在每轮实验中仅测试一次。由于可能存在气味在孔间扩散的情况，建议每块孔板仅使用一种气味分子进行刺激。
    2. 对于剂量反应实验，从1 mM起始，对每种气味储备液进行7个10倍梯度稀释，每个浓度设三个复孔。同时，对转染空载体的细胞也配制相同的气味稀释系列，以控制气味本身的背景激活。注意：在剂量反应实验中，每个气味浓度处理均应设置三个复孔。
  4. 轻敲细胞板以去除孔内原有培养基。
  5. 向每孔加入25 µl气味刺激溶液，于37°C孵育4小时。

5. 通过荧光素酶检测法测定OR活性

  1. 按照制造商说明重悬萤光素酶底物，并于 -80 °C 保存。
  2. 每块 96 孔板解冻 1 ml 萤光素酶底物。
  3. 新鲜配制萤光素酶反应终止剂和海肾萤光素酶底物试剂（每 1 ml 缓冲液中加入 5 µl 萤光素酶终止剂/海肾萤光素酶底物）。注：每块 96 孔板约需 1 ml 试剂。
  4. 准备化学发光微孔板读板仪。打开微孔板读板仪软件。在系统图标中：
    1. 在"预热"选项卡下，勾选"开启"，并将仪器温度设置为 25 °C。
    2. 在"分配器"选项卡下，用 1,000 µl 70% 乙醇对每个分配器进行预冲洗，随后用 1,000 µl 蒸馏水冲洗。注：每个分配器应使用单独的乙醇和水等分试样。乙醇用于对分配器进行消毒，水用于去除残留乙醇。
    3. 用 1,500 µl 空气对每个分配器进行预冲洗（将分配器从液体中取出）。注：用空气预冲洗可确保萤光素酶底物不会被残留水分稀释。
    4. 用 1,080 µl 萤光素酶底物（来自步骤 5.2）对分配器 1 进行预冲洗。用海肾萤光素酶底物（来自步骤 5.3）对分配器 2 进行预冲洗。注：注意避免萤光素酶底物交叉污染。用萤光素酶底物预冲洗可填充试剂分配器中的死体积。
  5. 设置以下程序以读取萤光素酶和海肾萤光素酶的化学发光信号。在微孔板读板仪配套软件中，点击"文件"菜单下的"新建任务"。选中左侧"方案"，点击"创建新方案"。在下一个窗口中，选择"标准方案"前的圆形按钮，点击"确定"。在屏幕左侧双击"操作流程"。
    1. 使用分配器 1 向所有孔中加入 10 µl 萤光素酶底物。在"操作"菜单下点击"分配"。在"分配步骤"窗口中设置："分配器"为 1，"预冲洗"为无，"分配体积"为 10 µl，"速率"为 225 µl/秒。点击"确定"。
    2. 振荡微孔板 30 秒。在"操作"菜单下点击"振荡"。在"振荡步骤"窗口中，设置"强度"为中等，"持续时间"为 0:30 分:秒。点击"确定"。
    3. 读取所有孔的化学发光信号，每孔读取 0.5 秒。在"操作"菜单下点击"读取"。在"读取步骤"窗口中设置："检测方法"为化学发光，"读取类型"为终点法，"积分时间"为 0:00:50 分:秒:毫秒，"滤光片设置"为 1，"发射光"为孔径，"光学位置"为顶部，"增益"为 135，"读取高度"为 1.00 mm。点击"确定"。
    4. 使用分配器 2 向所有孔中加入 10 µl 海肾萤光素酶底物。设置条件同步骤 5.6.1，但将"分配器"设为 2。
    5. 振荡微孔板 30 秒。设置条件同步骤 5.6.2。
    6. 读取所有孔的化学发光信号，每孔读取 0.5 秒。设置条件同步骤 5.6.3。
  6. 取下 96 孔板的盖子，将板放入微孔板读板仪中。启动步骤 5.5 中设置的程序以读取板的化学发光信号。
  7. 清洗试剂分配泵。在系统图标中"分配器"选项卡下：
    1. 将萤光素酶分配器中的 1,000 µl 萤光素酶底物排入回收管中。注：萤光素酶可于 -80 °C 保存并重复使用。
    2. 用 1,000 µl 蒸馏水对每个分配器进行预冲洗，随后用 1,000 µl 70% 乙醇冲洗，最后用 1,500 µl 空气冲洗（将分配器从液体中取出）。注：水用于清除试剂泵中的萤光素酶底物，乙醇用于消毒，空气用于吹干残留乙醇。

6. 数据分析

  1. 数据导出
    1. 在酶标仪软件中，于屏幕左侧双击 "Report/Export Builders"。
    2. 点击按钮 "New Export to Excel"，然后点击 "OK"。
    3. 选中 Export1，然后点击 "Edit"。
      1. 在 "Content" 下，勾选 "System Description"、"Procedure"、"Plate Description" 和 "Plate Layout Matrix"。同时包含 "Raw Data" 和 "Calculated Data"。
      2. 在 "Workflow" 下，勾选 "Autoexecute on completion of the procedure"。在 Export Mode 下，勾选 "All plates in the same workbook" 和 "As a new worksheet"。
      3. 在 "File" 下选择文件名格式和文件保存位置，然后点击 "OK"。
      4. 关闭 "Report/Export Builders" 窗口。
  2. 为获得标准化的荧光素酶值，将每个孔的萤火虫荧光素酶发光读数（步骤 5.6.3）除以同一孔的 Renilla 发光读数（步骤 5.6.6）。

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结果

初筛实验在100 µM浓度下，对328个嗅觉受体（ORs）与26种气味分子进行了配对测试。该气味分子浓度已被证实可有效激活大多数已知配体的嗅觉受体10。首先，通过将萤火虫荧光素酶读数除以海肾荧光素酶读数，计算归一化的荧光素酶活性。接着，通过从各孔归一化荧光素酶读数中减去无气味分子对照孔的归一化读数，计算基线校正后的数值（图1）。根据图1中彩色柱状图所示的基线校正后数值分布范围，随机选取48对气味分子/受体进行剂量-反应曲线实验。对每个嗅觉受体施加7个浓度梯度的气味分子，浓度范围从1 nM至1 mM，并采用非线性回归将所得反应数据拟合为S型曲线。当气味分子/受体对满足以下三项标准时，被判定为激动剂：（1）logEC50的标准误差小于1个对数单位；（2）曲线顶部和底部参数的95%置信区间无重叠；（3）额外平方和检验确认，与转染空载体的对照细胞相比，该气味分子对含嗅觉受体细胞的激活作用具有显著性差异。剂量-反应实验结果汇总于表3。

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讨论

气味分子的身份由嗅觉受体的激活模式编码，但目前已知的嗅觉受体激活模式（包括哪些受体被激活及其激活程度）仅占人类嗅觉受体总数的不到6%1-11。对嗅觉受体进行表征的研究受到方法繁琐或仅适用于嗅觉受体家族中部分成员的限制17,23,24,33,34。Hana3A异源表达系统能够稳健表达大多数经测试的嗅觉受体，并可与cAMP响应型荧光素酶报告系统联用，以监测嗅觉受体的激活情况19,26,27。该检测方法在96孔板格式下的应用支持多种高通量实验设计，包括筛选潜在的气味分子/嗅觉受体配对组合，以及开展剂量-反应曲线实验以确认相互作用，并评估受体激活水平如何受到种内和种间变异的影响。在筛选中表现出较高活性值的气味分子/受体配对更有可能呈现显著的剂量依赖性反应。这些数据表明，该筛选方法能够富集那些可通过剂量-反应验证的气味分子/受体配对，从而促进气味配体及嗅觉受体激活模式的鉴定。

该嗅觉受体分析实验的成功依赖于多个因素。所有质粒DNA必须通过无内毒素的实验方案制备。细胞表面嗅觉受体表达的一致性至关重要。Hana3A细胞系稳定表达多...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。 

致谢

本工作由 R01 DC013339、R03 DC011373 及露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖 T32 DC000014 资助。部分工作使用了 Monell 化学感受器信号传导核心设施完成，该核心设施部分由美国国立卫生研究院-国家耳聋及其他沟通障碍研究所核心资助 P30 DC011735 支持。作者感谢 C. Sezille 在数据收集方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Hana3A 细胞可向Matsunami实验室索取
RTP1S-pCI可向Matsunami实验室索取
M3-R-pCI可向松波实验室索取
pCRE-lucAgilent219076LUC
pSV40-RLPromegaE2231RL
最低必需培养基，EagleSigma AldrichM4655MEM
FBSLife Technologies16000-044FBS
PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+)Cellgro21-040-CVPBS
胰蛋白酶（0.05% 胰蛋白酶 EDTA）Life Technologies25300胰蛋白酶
CD293Life Technologies11913-019CD293
96孔PDL白色/透明板BD BioCoat356693板
脂质体转染试剂：Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019Lipofectamine
萤光素酶底物，萤光素酶淬灭剂/Renilla 荧光素酶底物：Dual-Glo 检测试剂盒PromegaE2980双荧光素酶
Synergy S2 BioTekSLADBioTek S2
微孔板读数仪软件：Gen5 数据分析软件BioTekGen5Gen5
BIOSTACKBioTekBIOSTACK2WRBioStack
MultifloBioTekMFPMultiFlo
300 μl GripTipsIntegra4433GripTips
12.5 μl GripTipsIntegra4414GripTips
300 μl GripTips ViaFlo96Integra6433XYZ 技巧
12.5 μl GripTips 384 XYZIntegra6403XYZ 技巧
384ViaFloIntegra6030384ViaFlo
TE缓冲液Macherey Nagel740797.1
DMSOSigma AldrichD2650-100MLDMSO
ForskolinEnzo Life SciencesBML-CN100-0010用于

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