高通量分析哺乳动物嗅觉受体：通过荧光素酶活性检测受体激活

摘要

嗅觉受体的激活模式编码了气味的身份信息，但由于目前尚无公开发表的数据来明确哺乳动物嗅觉受体的气味配体，这阻碍了构建全面的气味编码模型。本实验方案描述了一种方法，可促进嗅觉受体配体的高通量鉴定以及受体激活程度的定量分析。

摘要

气味分子可产生独特且相互重叠的嗅觉受体激活模式，使得约1,000种小鼠和400种人类嗅觉受体能够识别数千种气味分子。目前发表的配体仅针对不到6%的人类嗅觉受体^1-11这一数据缺乏部分是由于在异源系统中功能性表达这些受体存在困难。本文介绍了一种在Hana3A细胞中表达大多数嗅觉受体的方法，随后利用荧光素酶报告基因检测法对嗅觉受体的激活进行高通量评估。该检测方法可用于：（1）对一系列气味分子与一系列嗅觉受体进行筛选；（2）通过剂量反应曲线验证气味分子与受体的相互作用；（3）比较不同受体变异体之间的激活水平。在我们的示例数据中，对328个嗅觉受体与26种气味分子进行了筛选。选取了响应评分不同的气味分子/受体组合进行剂量反应测试。这些结果表明，筛选是一种有效富集可通过剂量反应实验验证的气味分子/受体组合的方法。 即 对气味分子具有真实响应的受体。因此，这种高通量荧光素酶检测方法是表征嗅觉受体的有效手段，是建立哺乳动物嗅觉系统气味编码模型的关键步骤。

引言

哺乳动物的嗅觉系统能够响应大量气味刺激，从而实现对数千种气味分子的检测与区分。嗅觉受体（ORs）是由嗅上皮中的嗅觉感觉神经元所表达的分子感受器¹²。哺乳动物对气味的识别是通过气味分子差异性地激活不同的OR实现的，而OR基因家族十分庞大，包含约1000个鼠源和400个人源受体^12-16。既往在嗅觉神经元及异源细胞系统中对OR进行的功能分析表明，不同气味分子可被独特但存在重叠的OR组合所识别^10,17-20。将配体与OR准确匹配对于解析嗅觉编码机制至关重要，也是构建有效嗅觉模型的基础。然而，由于OR在异源系统中表达困难，加之气味分子和OR数量庞大，相关数据在该领域中长期匮乏；事实上，已发表配体的人源OR不足6%^1-11。本实验方案描述了利用荧光素酶报告基因检测法来表征气味分子与OR相互作用的方法。该检测方法可实现对OR的高通量功能表征，这对于深入理解气味分子与OR的相互作用以及建立气味编码模型具有重要意义。

OR 的高通量研究面临三大主要挑战。首先，在异源细胞中表达的 OR 通常滞留在内质网中，并随后在蛋白酶体中被降解^21,22，从而阻止了 OR 在检测系统中与气味分子相互作用^23-25。这一问题因发现辅助蛋白而得到解决，这些蛋白可促进多种 OR 在细胞表面稳定表达^19,26,27。受体转运蛋白 1 和 2（RTP1 和 RTP....

方案

1. Hana3A 细胞的培养

1. 通过在最低必需培养基（MEM）中添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）来制备M10培养基。
2. 细胞培养维护
   1. 在M10培养基中培养细胞。注意：RTP1L、RTP2、REEP1和G_αolf的表达载体赋予Hana3A细胞嘌呤霉素抗性，但使用该抗生素维持细胞培养对检测结果无显著影响。
   2. 每2-3天以1:8的比例在10 cm培养皿中传代。
   3. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育。

2. 转染用细胞的铺板

1. 从一个100%融合的10 cm培养皿的Hana3A细胞中吸除培养基。
2. 加入10 ml PBS洗涤细胞，轻轻晃动培养皿后吸除PBS。
3. 加入3 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA，等待细胞解离（约1分钟）。
4. 加入5 ml M10以终止胰蛋白酶作用，并用10 ml移液器反复吹打约10次 以分散细胞团块。移液时应小心操作，避免将气泡引入培养基中。
5. 对于每块96孔板，将1 ml细胞悬液转移至15 ml锥形离心管中，以200 × g离心5分钟，随后吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
6. 按照每转移1 ml细胞加入6 ml M10的比例重悬细胞。

结果

初筛实验在100 µM浓度下，对328个嗅觉受体（ORs）与26种气味分子进行了配对测试。该气味分子浓度已被证实可有效激活大多数已知配体的嗅觉受体¹⁰。首先，通过将萤火虫荧光素酶读数除以海肾荧光素酶读数，计算归一化的荧光素酶活性。接着，通过从各孔归一化荧光素酶读数中减去无气味分子对照孔的归一化读数，计算基线校正后的数值（图1）。根据图1中彩色柱状图所示的基线校正后数值分布范围，随机选取48对气味分子/受体进行剂量-反应曲线实验。对每个嗅觉受体施加7个浓度梯度的气味分子，浓度范围从1 nM至1 mM，并采用非线性回归将所得反应数据拟合为S型曲线。当气味分子/受体对满足以下三项标准时，被判定为激动剂：（1）logEC₅₀的标准误差小于1个对数单位；（2）曲线顶部和底部参数的95%置信区间无重叠；（3）额外平方和检验确认，与转染空载体的对照细胞相比，该气味分子对含嗅觉受体细胞的激活作用具有显著性差异。剂量-反应实验结果汇总于表3。

讨论

气味分子的身份由嗅觉受体的激活模式编码，但目前已知的嗅觉受体激活模式（包括哪些受体被激活及其激活程度）仅占人类嗅觉受体总数的不到6%^1-11。对嗅觉受体进行表征的研究受到方法繁琐或仅适用于嗅觉受体家族中部分成员的限制^{17,23,24,33,34}。Hana3A异源表达系统能够稳健表达大多数经测试的嗅觉受体，并可与cAMP响应型荧光素酶报告系统联用，以监测嗅觉受体的激活情况^19,26,27。该检测方法在96孔板格式下的应用支持多种高通量实验设计，包括筛选潜在的气味分子/嗅觉受体配对组合，以及开展剂量-反应曲线实验以确认相互作用，并评估受体激活水平如何受到种内和种间变异的影响。在筛选中表现出较高活性值的气味分子/受体配对更有可能呈现显著的剂量依赖性反应。这些数据表明，该筛选方法能够富集那些可通过剂量-反应验证的气味分子/受体配对，从而促进气味配体及嗅觉受体激活模式的鉴定。

该嗅觉受体分析实验的成功依赖于多个因素。所有质粒DNA必须通过无内毒素的实验方案制备。细胞表面嗅觉受体表达的一致性至关重要。Hana3A细胞系稳定表达多.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hana3A 细胞	可向Matsunami实验室索取
RTP1S-pCI	可向Matsunami实验室索取
M3-R-pCI	可向松波实验室索取
pCRE-luc	Agilent	219076	LUC
pSV40-RL	Promega	E2231	RL
最低必需培养基，Eagle	Sigma Aldrich	M4655	MEM
FBS	Life Technologies	16000-044	FBS
PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+)	Cellgro	21-040-CV	PBS
胰蛋白酶（0.05% 胰蛋白酶 EDTA）	Life Technologies	25300	胰蛋白酶
CD293	Life Technologies	11913-019	CD293
96孔PDL白色/透明板	BD BioCoat	356693	板
脂质体转染试剂：Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019	Lipofectamine
萤光素酶底物，萤光素酶淬灭剂/Renilla 荧光素酶底物：Dual-Glo 检测试剂盒	Promega	E2980	双荧光素酶
Synergy S2	BioTek	SLAD	BioTek S2
微孔板读数仪软件：Gen5 数据分析软件	BioTek	Gen5	Gen5
BIOSTACK	BioTek	BIOSTACK2WR	BioStack
Multiflo	BioTek	MFP	MultiFlo
300 μl GripTips	Integra	4433	GripTips
12.5 μl GripTips	Integra	4414	GripTips
300 μl GripTips ViaFlo96	Integra	6433	XYZ 技巧
12.5 μl GripTips 384 XYZ	Integra	6403	XYZ 技巧
384ViaFlo	Integra	6030	384ViaFlo
TE缓冲液	Macherey Nagel	740797.1
DMSO	Sigma Aldrich	D2650-100ML	DMSO
Forskolin	Enzo Life Sciences	BML-CN100-0010	用于