一个 离体 用于研究甲状腺发育的培养系统

摘要

本方案描述了小鼠胚胎甲状腺原基的解剖，以及在半透滤膜或显微镜用塑料载片上对外植体进行培养的方法。该体系非常适合研究野生型或基因敲除胚胎甲状腺发育过程中发生的形态发生或分化事件，也可用于基因功能获得性和缺失性实验。

摘要

甲状腺是位于颈部基部的双叶状内分泌腺，可产生甲状腺激素 T3、T4 和降钙素。T3 和 T4 由分化成熟的滤泡上皮细胞（thyrocytes）产生，这些细胞排列成称为滤泡的闭合球状结构；而降钙素则由C细胞合成，C细胞散布于滤泡之间，并与密集的毛细血管网络相邻。尽管成年甲状腺的结构和功能已被广泛描述和研究，但“血管-滤泡”单位的形成机制、C细胞在实质组织中的分布规律，以及上皮细胞与内皮细胞之间的旁分泌通讯仍远未阐明。

该方法描述了小鼠胚胎甲状腺原基分离及其在半透滤膜或显微镜用塑料载片上培养的连续操作步骤。在此培养系统中，四天内可真实地重现 体内 甲状腺发育。事实上，（i）器官出现分叶现象（针对 e12.5 外植体），（ii）甲状腺细胞前体形成滤泡并建立极性，（iii）甲状腺细胞与C细胞发生分化，以及（iv）显微解剖组织中存在的内皮细胞增殖、迁移至甲状腺叶内，并与上皮细胞紧密关联，正如其在体内所表现的那样 体内.

甲状腺组织可从野生型、基因敲除型或荧光转基因胚胎中获取。此外，通过添加抑制剂、阻断性抗体、生长因子，甚至细胞或条件培养基，可对器官外培养物进行操控。Ex vivo 发育过程可通过免疫染色和实时荧光定量PCR在培养期间的任意时间点进行实时分析或检测。

综上所述，甲状腺外植体培养结合后续整体或切片成像以及基因表达谱分析，为研究甲状腺器官发生过程中的形态发生和分化事件提供了一个强大的实验系统。

引言

甲状腺由许多独立的上皮细胞球体（称为滤泡）组成，其周围分布着密集的内皮毛细血管网。这种结构支持了甲状腺的功能：内皮毛细血管为甲状腺细胞提供合成T3和T4激素所必需的碘，并将这些激素输送至全身。滤泡与毛细血管之间散在分布的C细胞则分泌降钙素这一降低血钙的激素¹。尽管成年甲状腺的结构和功能已较为明确，但参与甲状腺胚胎发育过程（包括滤泡形成与细胞分化）的细胞和分子机制仍远未被阐明。

在胚胎发育过程中，甲状腺滤泡上皮细胞的前体细胞起源于小鼠胚胎第8.5天（e8.5）前肠内胚层腹侧壁的增厚区域（即中线原基），而C细胞前体则起源于胚胎第11.5天（e11.5）第四对咽囊呈水滴状突出的结构（即最后鳃体）^2-6。随后，中线芽体从内胚层脱离，向两侧扩展，并于e13.5时在气管两侧分别与最后鳃体融合。最终，甲状腺滤泡上皮细胞形成滤泡结构，C细胞完成分化。

目前关于甲状腺形成的认知主要来源于对固定组织的组织学分析，但甲状腺形成过程中的形态发生事件具有高度动态性，涉及不同类型细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的通讯和相互作用。近期研究表明，甲状腺细胞前体细胞可产生高水平的VEGF，以招募内皮细胞至发育中的甲状腺；而被招募的内皮细胞反过来促进滤泡的形成以及C细胞的分化⁷。

大多数关于甲状腺的ex vivo研究均使用分离的成年甲状腺来源细胞进行，这些细胞可在2D组织培养塑料皿上或3D基质中生长。利用此类培养方式，分化的滤泡细胞要么保持极性并以滤泡形式组织化，要么重新获得3D结构^8-10。然而，这些从其生理环境中分离出的纯上皮细胞在2D条件下培养时，忽略了其在in vivo状态下通常会遇到的细胞外基质、细胞因子、生长因子以及其他细胞类型（如内皮细胞或神经细胞）之间的相互作用。最近一项出色的研究描述了一种将ES细胞分化为甲状腺滤泡的方案，其最终培养步骤在3D Matrigel中进行¹¹。然而，这些3D培养体系缺乏与其他细胞类型的接触。

基于先前在胰腺和唾液腺器官培养方面的经验^12-14，已建立一种从小鼠胚胎中分离甲状腺原基并将其外植体培养在半透膜滤器或显微镜用塑料载片上的方法。

在操作 e12.5 胚胎时，由于甲状腺原基具有双重来源（即中线原基和两个外侧的最后鳃体），需要显微解剖一大块组织。该组织包含气管但不包含食管，从咽弓动脉延伸至杓状软骨隆起。当在滤膜上培养时，中线原基向气管两侧横向延伸，并与最后鳃体融合，形成两个甲状腺叶，二者仍通过一条狭窄的峡部相连。

在培养过程中，上皮细胞增殖、组织成滤泡，并根据其来源分化为甲状腺滤泡细胞和C细胞。显微解剖组织中含有的内皮细胞同样会增殖并侵入甲状腺小叶，最终与上皮性滤泡结构紧密关联，该过程独立于血流或循环因子。由于外植体的发育能够真实再现 体内 发育过程中，该培养系统是研究甲状腺发育期间形态发生和分化事件的最佳选择。

甲状腺组织可取自野生型、基因敲除型或荧光转基因胚胎，该培养系统适用于基因功能缺失和功能获得实验。最后，利用显微镜塑料培养皿对荧光标记的甲状腺外植体进行延时成像，可进一步研究形态发生过程中细胞运动的动力学特征及其连续性 体内时间序列成像已被用于研究胰腺的分支形态发生^15,16 或输尿管芽¹⁷.

方案

小鼠的饲养和处理遵循大学动物福利委员会的实验动物护理原则。所有实验操作和方案均经该委员会批准。

1. 显微镜用塑料培养皿的包被

注意：所有以下步骤均须在层流罩内的无菌条件下进行。这两种包被方法在功能上是等效的。

1. 在分离甲状腺组织前一天，用纤维连接蛋白包被塑料培养腔：
   1. 将无菌纤维连接蛋白用M199培养基稀释至终浓度为50 μg/ml，M199培养基中需添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.25 μg/ml两性霉素B和2 mM谷氨酰胺¹²。
   2. 每孔加入200 μl稀释后的纤维连接蛋白覆盖孔底，4 °C冰箱中孵育过夜。
   3. 解剖当天，吸除纤维连接蛋白溶液，用M199培养基冲洗孔一次，然后每孔加入至少200 μl含抗生素、谷氨酰胺和10%胎牛血清的M199培养基。
   4. 将包被好的培养腔置于培养箱中，待接种外植体时使用。
2. 在分离甲状腺组织前2小时，用I型胶原包被塑料培养腔：
   1. 将无菌I型胶原用10 mM HCl稀释至终浓度为50 μg/ml。注意：胶原原液需保持在冰上。
   2. 每孔加入200 μl稀释后的I型胶原，室温（RT）孵育2小时。
   3. 吸除I型胶原溶液，用M199培养基冲洗孔一次，然后每孔加入至少200 μl含抗生素、谷氨酰胺和10%胎牛血清的M199培养基。
   4. 将包被好的培养腔置于培养箱中，待接种外植体时使用。

2. 甲状腺原基组织（e12.5）或甲状腺叶（e13.5-e14.5）的解剖

注意：使用洁净的解剖工具和培养皿/培养板。下述的一般步骤和切口操作对 e12.5 和 e14.5 胚胎均适用。

1. 在预定的胚胎发育日（e12.5至e14.5）处死妊娠母鼠，并使用解剖器械取出子宫。
2. 将解剖好的子宫置于10 含HBSS的cm培养板
3. 用镊子夹住子宫的一端，用小剪刀剪开子宫，逐步取出所有胚胎。
4. 用剪刀将胚胎与胎盘分离，并将带有胚外膜的胚胎转移至新的10 含HBSS的cm培养皿。
5. 去除卵黄囊和羊膜。注意：从此步骤开始，在体视显微镜下操作，并使用下方透射光源；随着解剖步骤的进行逐步增加放大倍数。使用玻璃毛细管中的钨针作为解剖工具。
6. 用针如同使用刀叉一般，移除头部上半部分，包括上颌和耳朵（图 1A，沿 a) 切开。
7. 将胚胎背侧朝上固定，先切除一段额外的神经管组织（图 1A，沿 b) 线切开，然后取胚胎的下部，位置在前肢下方、心脏上方图 1B).
8. 将包含舌部（用于定位组织）和颈部区域的胚胎切片转移至新的10 含HBSS的cm培养板
9. 去除神经管及食管/气管后方的组织图1C，沿 a) 切开。
10. 沿舌头两侧轻轻切开组织切片图 1C，沿 b 和 b’ 切割）。
11. 定位食管和气管，位于舌的延续部分，解剖去除舌组织，保留杓状软骨隆起（图 1D，沿a处剪开，以及食管/气管两侧的组织（图 1D，沿 b 和 b’ 切开）。
12. 去除食管，将气管腹侧朝上放置。
13. 剥离掉不需要的组织，例如胸腺（图 1E）以及位于咽弓动脉外侧的所有组织。对于e13.5或e14.5胚胎，可在气管两侧观察甲状腺左右叶图 1F；红色虚线）并进一步从气管上解剖分离肺叶。
14. 将分离的 e12.5 气管区域或 e13.5–e14.5 甲状腺叶转移至 35 含预热的M199培养基（添加抗生素、谷氨酰胺和10%胎牛血清）的mm培养板。使用预先润湿的滤芯吸头，通过P-200移液器转移组织块。对于e12.5胚胎组织块，需剪去吸头末端以扩大开口。注意：常规操作中，若胚胎基因型相同，可进行步骤6 & 7 对所有胚胎，然后 9-11，最后 12 & 13.

3. 甲状腺外植体的接种与培养

1. 将外植体依次转移至含有1 ml预温培养基（= M199，添加抗生素、谷氨酰胺和10%胎牛血清）的24孔板的三个孔中，进行洗涤。
2. 将甲状腺叶接种于包被的显微镜塑料培养腔中：
   1. 吸除包被培养腔中的M199培养基。
   2. 使用移液器和滤芯吸头小心地将甲状腺外植体转移至培养腔中，每孔中央放置一个外植体。
   3. 去除多余培养基，并将培养腔置于组织培养箱（37 °C；5% CO₂）中孵育2小时，使外植体贴附于基质。
   4. 轻柔地向每个孔中加入200至300 μl预温的培养基。
   5. 在组织培养箱中孵育以进行长期培养。
3. 将气管区域或甲状腺叶接种于半透性滤膜上：
   1. 向所需数量的24孔板孔中各加入330 μl预温的培养基。
   2. 将滤膜（e.g. 0.4 µm Millipore滤膜）放置于培养基表面，注意避免滤膜下方滞留气泡。
   3. 使用移液器和滤芯吸头，小心地将甲状腺外植体连同最小体积的培养基转移至滤膜中央（每片滤膜最多4个外植体）。
   4. 去除多余培养基，并用钨针将外植体彼此分开。
   5. 在组织培养箱中孵育以进行长期培养。注意：每隔一天在超净台中更换培养基。外植体可培养至7天。

4. 甲状腺外植体全组织免疫荧光染色方案

使用钨针或精细镊子将生长在滤膜上的外植体（见下文步骤2）松解，并转移至24孔板中进行所有操作，但一抗（步骤5）和二抗孵育（步骤7）需在96孔板中进行。对于培养在显微镜用塑料培养腔中的贴壁外植体，所有步骤均在培养腔内完成。

1. 吸弃 M199 培养基，用预冷的 4% 多聚甲醛（PFA）固定组织块 20 分钟（24 孔板中每孔 500 µl，载玻片上 300 µl）。
2. 室温下用含吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST；50 mM Tris HCl pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Triton X-100）洗涤2次，每次10分钟。
3. 立即处理外植体或在 -20 °C 下保存。注意：若需在 -20 °C 长期保存，需在 TBST 中逐步提高甲醇浓度，使外植体在甲醇中脱水至甲醇浓度达 100%。当准备继续进行免疫染色（步骤 4）时，通过在甲醇中逐步加入 TBST 重新水化外植体。
4. 用封闭液（TBST 中含 10% 正常山羊血清）替换 TBST，室温下在摇床上孵育 30–60 分钟。
5. 用封闭液稀释一抗（每种条件100–200 µl）。将“滤膜”外植体从24孔板转移至96孔板。在4 °C下，于摇床上避光孵育外植体与一抗，过夜。
6. 次日，弃去一抗溶液，将“滤膜”外植块转移回24孔板中，在室温下用TBST在摇床上至少洗涤5次，每次45-60分钟。
7. 稀释二抗（例如 山羊抗X-Alexa Fluor（1:2,000稀释）溶于含1%正常山羊血清的TBST中，将外植体于4 °C避光条件下在海藻摇床中与此稀释液孵育过夜。进行细胞核复染时，将1 μg/ml双苯并咪唑（Hoechst）与二抗溶液一同加入。
8. 第二天，弃去二抗溶液，在室温下将外植体置于摇床上用TBST振荡洗涤5次，每次45-60分钟。洗涤过程中需避光保存外植体。
9. 在4 °C避光条件下，轻轻振荡TBST缓冲液过夜，再进行一次洗涤。
10. 在4%多聚甲醛中于4 °C对免疫染色的外植体进行后固定，10分钟。
11. 洗涤 2 次 用 TBST 洗涤 10 分钟。
12. 将外植体转移至100%甲醇中，逐步置换，于-20 °C长期保存，或立即进行分析。对于在滤膜上培养并在24孔板中完成免疫染色的外植体，转移至显微镜观察室（例如 LabTek 或 Ibidi）中，再进行双光子或共聚焦显微镜分析。

5. 甲状腺RNA提取

在无RNase的环境中操作。因此，应使用无核酸和无核酸酶的移液器吸头，并对实验台面和设备进行清洁，以去除污染物和RNase。本实验方案基于苯酚/氯仿法，前几步（步骤1至7）需在化学通风橱中进行。

1. 使用一次性研磨棒，将一个甲状腺外植体或两个甲状腺叶与 300 µl RNA 提取液充分匀浆 用于1.5 ml离心管。样品之间，用2% SDS清洗研杵，然后用水，再用乙醇。
2. 加入另外100 µl RNA提取液，涡旋振荡10秒，室温孵育10分钟。
3. 涡旋30秒，向每个样品中加入20 ng tRNA。
4. 涡旋1分钟，加入80 µl氯仿。
5. 剧烈涡旋振荡30秒，室温孵育15分钟。
6. 在4 °C预冷的离心机中以19,000 x g离心15分钟。
7. 小心地将无色上层水相转移至含有20 μg甘油作为共沉淀剂的新离心管中。
8. 涡旋并加入200 µl 100%异丙醇。
9. 剧烈涡旋15-30秒，然后在-20 °C下沉淀RNA 2-3小时，或在-80 °C下沉淀1小时。
10. 在 4 °C 条件下以 19,000 × g 离心 30 分钟，弃去上清液。
11. 用450 µl预冷的75%乙醇洗涤沉淀，涡旋振荡以充分悬浮沉淀。
12. 在 4 °C 条件下以 19,000 x g 离心 10 分钟，弃去上清液。
13. 在通风橱中干燥沉淀物5分钟。
14. 用10 µl无RNase的水重悬沉淀，室温孵育10分钟。
15. 测定RNA浓度，于-80 °C保存，或进行逆转录以用于基因表达分析。

结果

分别在 e12.5 和 e13.5/e14.5 时期从小鼠胚胎中分离甲状腺原基（中线部分及UB，连同周围组织）以及甲状腺叶（图1）。在滤膜上培养一天后，中线原基可见（图2A），表现为沿气管上方延伸的细长组织，并逐渐在气管两侧形成两个甲状腺叶。若培养分离的甲状腺叶（e13.5 或 e14.5），它们将发生扩张，经历形态发生过程，上皮细胞将自组织形成肉眼可见的滤泡样结构（图2B）。

通过ezrin免疫标记可观察到上皮细胞的排列和极化情况，这些细胞以E-钙黏蛋白标记（图3A）。ezrin阳性的细胞内结构逐步且协调地融合至细胞的一极，该极将发育为顶膜极。在此过程中，PECAM阳性的内皮细胞增殖并围绕发育中的滤泡组织化，形成血管-滤泡单位（图3B）。为定量分析甲状腺滤泡上皮细胞和C细胞的分化情况，可从培养的甲状腺叶中提取RNA，并通过RT-qPCR检测基因表达（图3C）。尽管甲状腺转录因子N...

讨论

本文描述了一种分离和培养甲状腺外植体（e12.5）的方法 或叶（e14.5）以研究并深入理解甲状腺形成的复杂过程。由于甲状腺原基具有双重来源（中线原基和两个外侧的最后鳃体），且其体积微小，因此需对e12.5时期位于咽弓动脉前方、包含气管但不包含食管的一小块组织进行显微解剖。如图所示，在四天的培养过程中，该培养体系可真实地重现 体内 甲状腺发育过程，因为：(i) 中线始基向两侧迁移并扩展，与UB共同形成两个由狭窄峡部连接的甲状腺叶（图 2A)，（ii）甲状腺前体细胞从细胞团重新组织为滤泡结构，并最终发生极化（图 2B 和 3A)，（iii）显微解剖组织中存在的内皮细胞增殖、迁移至甲状腺小叶内，并与上皮细胞紧密关联（图 3B），以及（iv）滤泡上皮细胞与C细胞发生定性分化（图 3C），因为它们会 体内⁷

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ-slide 8 孔，ibtreat，组织培养处理，无菌	proxylab	80826
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源	Millipore	08-115
人血浆来源纤连蛋白	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
钨丝	Goodfellow	LS237450
培养板插件（12 mm 直径）	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-钙黏蛋白	BD Biosciences	610182	1/1,000
埃兹蛋白	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
血小板内皮细胞黏附分子（PECAM）	BD Biosciences	550274	1/100
赫斯特染料（Hoechst）	Sigma	B2261