本方案描述了小鼠胚胎甲状腺原基的解剖，以及在半透滤膜或显微镜用塑料载片上对外植体进行培养的方法。该体系非常适合研究野生型或基因敲除胚胎甲状腺发育过程中发生的形态发生或分化事件，也可用于基因功能获得性和缺失性实验。
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本文内容
摘要
摘要
甲状腺是位于颈部基部的双叶状内分泌腺，可产生甲状腺激素 T3、T4 和降钙素。T3 和 T4 由分化成熟的滤泡上皮细胞（thyrocytes）产生，这些细胞排列成称为滤泡的闭合球状结构；而降钙素则由C细胞合成，C细胞散布于滤泡之间，并与密集的毛细血管网络相邻。尽管成年甲状腺的结构和功能已被广泛描述和研究，但“血管-滤泡”单位的形成机制、C细胞在实质组织中的分布规律，以及上皮细胞与内皮细胞之间的旁分泌通讯仍远未阐明。
该方法描述了小鼠胚胎甲状腺原基分离及其在半透滤膜或显微镜用塑料载片上培养的连续操作步骤。在此培养系统中，四天内可真实地重现 体内 甲状腺发育。事实上，（i）器官出现分叶现象（针对 e12.5 外植体），（ii）甲状腺细胞前体形成滤泡并建立极性，（iii）甲状腺细胞与C细胞发生分化，以及（iv）显微解剖组织中存在的内皮细胞增殖、迁移至甲状腺叶内，并与上皮细胞紧密关联，正如其在体内所表现的那样 体内.
甲状腺组织可从野生型、基因敲除型或荧光转基因胚胎中获取。此外，通过添加抑制剂、阻断性抗体、生长因子，甚至细胞或条件培养基，可对器官外培养物进行操控。Ex vivo 发育过程可通过免疫染色和实时荧光定量PCR在培养期间的任意时间点进行实时分析或检测。
综上所述，甲状腺外植体培养结合后续整体或切片成像以及基因表达谱分析，为研究甲状腺器官发生过程中的形态发生和分化事件提供了一个强大的实验系统。
引言
甲状腺由许多独立的上皮细胞球体（称为滤泡）组成，其周围分布着密集的内皮毛细血管网。这种结构支持了甲状腺的功能：内皮毛细血管为甲状腺细胞提供合成T3和T4激素所必需的碘，并将这些激素输送至全身。滤泡与毛细血管之间散在分布的C细胞则分泌降钙素这一降低血钙的激素1。尽管成年甲状腺的结构和功能已较为明确，但参与甲状腺胚胎发育过程（包括滤泡形成与细胞分化）的细胞和分子机制仍远未被阐明。
在胚胎发育过程中，甲状腺滤泡上皮细胞的前体细胞起源于小鼠胚胎第8.5天（e8.5）前肠内胚层腹侧壁的增厚区域（即中线原基），而C细胞前体则起源于胚胎第11.5天（e11.5）第四对咽囊呈水滴状突出的结构（即最后鳃体）2-6。随后，中线芽体从内胚层脱离，向两侧扩展，并于e13.5时在气管两侧分别与最后鳃体融合。最终，甲状腺滤泡上皮细胞形成滤泡结构，C细胞完成分化。
目前关于甲状腺形成的认知主要来源于对固定组织的组织学分析，但甲状腺形成过程中的形态发生事件具有高度动态性，涉及不同类型细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的通讯和相互作用。近期研究表明，甲状腺细胞前体细胞可产生高水平的VEGF，以招募内皮细胞至发育中的甲状腺；而被招募的内皮细胞反过来促进滤泡的形成以及C细胞的分化7。
大多数关于甲状腺的ex vivo研究均....
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方案
小鼠的饲养和处理遵循大学动物福利委员会的实验动物护理原则。所有实验操作和方案均经该委员会批准。
1. 显微镜用塑料培养皿的包被
注意：所有以下步骤均须在层流罩内的无菌条件下进行。这两种包被方法在功能上是等效的。
- 在分离甲状腺组织前一天，用纤维连接蛋白包被塑料培养腔：
- 将无菌纤维连接蛋白用M199培养基稀释至终浓度为50 μg/ml，M199培养基中需添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.25 μg/ml两性霉素B和2 mM谷氨酰胺12。
- 每孔加入200 μl稀释后的纤维连接蛋白覆盖孔底，4 °C冰箱中孵育过夜。
- 解剖当天，吸除纤维连接蛋白溶液，用M199培养基冲洗孔一次，然后每孔加入至少200 μl含抗生素、谷氨酰胺和10%胎牛血清的M199培养基。
- 将包被好的培养腔置于培养箱中，待接种外植体时使用。
- 在分离甲状腺组织前2小时，用I型胶原包被塑料培养腔：
- 将无菌I型胶原用10 mM HCl稀释至终浓度为50 μg/ml。注意：胶原原液需保持在冰上。
- 每孔加入200 μl稀释后的I型胶原，室温（RT）孵育2小时。
- 吸除I型胶原溶液，用M199培养基冲洗孔一....
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结果
分别于 e12.5 和 e13.5/e14.5 从小鼠胚胎中分离甲状腺原基（中线部分及 UB，连同周围组织）以及甲状腺叶（图 1）。在滤膜上培养一天后，中线原基可见（图 2A），表现为沿气管上方延伸的细长组织，逐步在气管两侧形成两个叶。若培养分离的甲状腺叶（e13.5 或 e14.5），其将发生扩张，经历形态发生过程，上皮细胞将排列成肉眼可见的滤泡样结构（图 2B）。
通过ezrin免疫标记可观察到以E-cadherin标记的上皮细胞的组织结构与极性化（图3A）。Ezrin阳性的细胞内结构逐步且协同地与细胞的一极融合，该极将发育为顶端极。在此过程中，PECAM阳性的内皮细胞增殖并围绕发育中的滤泡组织，形成血管-滤泡单元（图3B）。为定量分析甲状腺滤泡上皮细胞和C细胞的分化情况，可从培养的甲状腺叶中提取RNA，并通过RT-qPCR检测基因表达（图3C）。尽管在培养过程中甲状腺转录因子.......
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讨论
本文描述了一种分离和培养甲状腺外植体（e12.5）的方法 或叶（e14.5）以研究并深入理解甲状腺形成的复杂过程。由于甲状腺原基具有双重来源（中线原基和两个外侧的最后鳃体），且其体积微小，因此需对e12.5时期位于咽弓动脉前方、包含气管但不包含食管的一小块组织进行显微解剖。如图所示，在四天的培养过程中，该培养体系可真实地重现 体内 甲状腺发育过程，因为：(i) 中线始基向两侧迁移并扩展，与UB共同形成两个由狭窄峡部连接的甲状腺叶（图 2A)，（ii）甲状腺前体细胞从细胞团重新组织为滤泡结构，并最终发生极化（图 2B 和 3A)，（iii）显微解剖组织中存在的内皮细胞增殖、迁移至甲状腺小叶内，并与上皮细胞紧密关联（图 3B），以及（iv）滤泡上皮细胞与C细胞发生定性分化（图 3C），因为它们会 体内7
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了鲁汶天主教大学（协同研究行动项目）和比利时医学科学研究基金会（F.R.S.-FNRS）的资助。A.-S.D. 获比利时 Télévie 博士奖学金资助，A.-C.H. 曾获得比利时工业与农业研究培训基金会的资助，M.V. 由杜夫研究所提供支持，C.E.P. 为比利时 F.R.S.-FNRS 的资深研究合作者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-slide 8 孔，ibtreat，组织培养处理，无菌 | proxylab | 80826 | |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | Millipore | 08-115 | |
| 人血浆来源纤连蛋白 | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| 钨丝 | Goodfellow | LS237450 | |
| 培养板插件（12 mm 直径） | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-钙黏蛋白 | BD Biosciences | 610182 | 1/1,000 |
| 埃兹蛋白 | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| 血小板内皮细胞黏附分子（PECAM） | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| 赫斯特染料（Hoechst） | Sigma | B2261 |
参考文献
- Colin, I. M., Denef, J. -F., Lengelé, B., Many, M. -C., Gérard, A. -C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M.
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重印与许可
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