静电粘附实验对整合素激活的T细胞研究

摘要

静态粘合试验是一种可以用于建模的T淋巴细胞和其他细胞类型之间的相互作用的有力工具。通过标记的T细胞注入到井中涂有粘附分子，而读板器是用于以下串行洗涤量化贴壁细胞的数量所产生的相互作用。

摘要

T淋巴细胞的黏附是必需的多种T细胞的功能，包括迁移到炎症和形成免疫突触与抗原提呈细胞的部位。 T细胞的调节完成粘附通过控制整，一类细胞粘附分子组成的异源二聚体对与靶分子上的伴侣细胞或细胞外基质相互作用的跨膜蛋白的的粘接性能。最突出的T细胞的整合素是淋巴细胞功能相关抗原（LFA）-1，亚基αL和β2，其目标是在细胞内粘附分子（ICAM）-1组成。 T细胞来控制粘附的能力来自于调节个人整合的亲和力状态的能力。由内而外的信令描述了进程，使细胞内的信号导致整合的外部域假设激活状态。大部分我们对这些复杂现象的知识是基于机械在简化进行体外模型系统研究。这里所描述的T淋巴细胞粘附实验是一个极好的工具，允许T细胞附着到目标分子，在静态条件下，然后利用荧光板读数器对量化的粘合性。该测定法已在界定粘附刺激性或抑制性物质对淋巴细胞作用，以及表征所涉及的信号转导事件是有用的。虽然这里描述为LFA-1 - ICAM-1介导的粘附;此测定法可容易地适于允许的其他粘合剂的相互作用（ 例如，VLA-4 -纤连蛋白）的研究。

引言

T淋巴细胞的粘附是在免疫应答中¹的基本处理。这是需要的T细胞相互作用与内皮细胞装潢毛细管壁，对于淋巴结内扫描的抗原呈递细胞（APC），并为免疫突触的形成（IS）与靶细胞^2。这些要求在功能上和动力学截然不同。淋巴细胞外渗的过程包括趋化，滚动，粘附牢固，和轮回。滚动坚定的附着力过渡需要T细胞快速响应G蛋白偶联受体信号。这种反应产生，减缓和逮捕的滚动单元³的整联配体的相互作用。在整合的亲和力立即改变介导了这一过程。迁移需要动态相互作用betweenTcells和血管内皮细胞与形成粘连的“前端”和粘连在“后端”破损同的成形和分断⁴之间大约一分钟的时间间隔。在IS形成inminutes，但需要保持不变为⁶小时。

有趣的是，1粘附分子，整合素家族成员淋巴细胞功能相关抗原（LFA） - 1，是对所有这些过程⁵是必不可少的。 LFA-1介导的粘附通过相互作用与免疫球蛋白超家族的几个成员。最广​​泛研究的配体​​与LFA-1的最高亲和力的细胞间粘附分子（ICAM）-1。非活化的外周血淋巴细胞表达低亲和性的LFA-1在细胞表面上，因此不能粘附的ICAM-1包被的表面。 LFA-1的亲和力是可变的，通过几个信号传导事件，例如G蛋白偶联受体活化，细胞因子的刺激，并通过T细胞受体（TCR）介导的信号调节。的LFA-1表达的细胞内活化到细胞外空间将得到的高亲和性的形式吨hrough相互作用与ICAM-1。这个途径被称为由内而外的信令^7。同样地，通过LFA-1从细胞外空间的信号被称为由外向内的信令。

在细胞内信号参与由内而外和由外而内的信号级联是当前研究的一大重点。小GTP酶Rap1的最近成为的由内而外的重要组成部分信令是常见的两种TCR结扎和细胞因子信号^8。 Rap1的中整合素激活的关键作用是由Rap1的过度表达刺激T细胞的整合素依赖性粘附的发现凸显，而T细胞粘连阻塞由显性负Rap1的⁹的表达。在我们的整合调控Rap1的理解这些进展利用体外工具已经完成。其中之一是这里所描述的静态粘附实验。

这种方法的总体目标是研究Ŧ细胞粘附性的ICAM-1包被的表面。更具体地讲，它是用来客观地测量和量化向着它的反配体LFA-1的亲和力在活细胞中的实时性，在不同条件下。这种技术使用涂有ICAM-1的模拟蜂窝表面的T细胞相互作用聚苯乙烯孔。许多先前所描述的静态T细胞黏附实验是实验复杂。这些通常需要T细胞的测定法进行放射性标记，用于培养的牛角膜细胞建立的细胞外基质作为基质的T细胞粘附，或称为非生理性T细胞的刺激在延长的持续时间，以促进T细胞粘附^10。利用荧光测量以下的粘附培养量化T细胞是一种更敏感和准确的定量的方法相比，流式细胞术和显微术，如被用在许多其他的检测系统^11。另外，单电池microscop整本地化的集成电路分析不允许以同样的方式作为荧光测量的宽峰，基于群体分析。而激活态特异性LFA-1抗体是市售的，这些抗体具有低灵敏度相对于此处所述的方法。过替代技术的主要优点是它的简单性，并同时检测多种实验条件的能力。当考虑这个方法，一个特定的应用，应该考虑到，T细胞应阴性选择，新鲜分离的，并用荧光标记物。

方案

1，涂料的微孔板

注意：该步骤的目的是涂层的聚苯乙烯表面与ICAM-1作为配体的T细胞LFA-1。

1. 准备了以下解决方案：
   1. 通过再悬浮制备涂布液的重组ICAM-1，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10毫米的Na ₂ HPO _4，2mM的KH ₂ PO _4，pH 7.4）中富含钙（1毫的CaCl _2）和镁（2纳米的MgCl _2）。确保ICAM-1的最终浓度为10微克/毫升，从0.7毫克/毫升的储备溶液制作并保存在-80℃冰箱。
   2. 通过丰富的PBS与0.5％人（或牛）血清白蛋白（HSA / BSA），2毫摩尔MgCl _2，和1mM的CaCl ₂制备的粘合溶液。
   3. 通过加入2毫摩尔MgCl ₂和1mM的CaCl _2，以PBS中制备洗涤液。温暖所有的解决方案37°C使用前。
2. 用50μl的洗涤液中洗涤24个孔。这将包括未洗井，正（PMA处理的细胞）和阴性（无涂层的孔中）控制。对于每个条件设置至少三个井（一式三份）。
3. 加50微升涂布液到每个孔中。不要添加未涂布对照孔。孵育内37℃培养箱中培养一小时。
4. 抽吸涂覆溶液轻轻地，不使前端触碰到井的底部。用50μl的洗涤液洗一次。
5. 加入50微升的粘附性解决方案和孵化微孔板1小时内37℃培养箱中培养。
6. 吸用50微升洗涤液轻轻洗一次。使用该板在同一天，但是也可以将其保持在4℃过夜，并用它翌日。

2，从外周血T细胞分离

1. 增加人体T细胞富集的鸡尾酒在50微升/毫升邻楼全血（ 如 3毫升抗凝剂（肝素，EDTA或柠檬酸盐）全血，加入150μl的鸡尾酒）。拌匀。
2. 孵育20分钟，在室温下进行。
3. 到50ml的离心管中加入3毫升处理过的血液和PBS等体积的（没有钙和镁）富含1％D-葡萄糖在室温下。用巴斯德吸管轻轻混匀。
4. 添加15毫升菲可 - 帕克PLUS的离心管中。
5. 仔细层6毫升稀释血液样品的淋巴细胞分离介质上。
6. 离心400×g离心20分钟，在20℃，折断。
7. 吸干使用干净巴斯德吸管，而使淋巴细胞层原状界面处的上层。 血浆的上层可以被保存以供以后使用。使用干净的巴斯德移液管的淋巴细胞层转移到一个干净的离心管中。
8. 添加PBS的3倍体积（9毫升）中的淋巴细胞。轻轻悬浮细胞DRA翼他们进出巴斯德吸管的。
9. 离心机在400×g离心5分钟，在20℃下
10. 除去上清液。淋巴细胞现在应该在培养基中适当的应用程序被暂停。转移细胞对T-75培养瓶中，在20毫升含有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。

该细胞3。下游

注意：一个先决条件是对细胞进行标记，用荧光试剂。在这个协议中使用的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE），但绿色荧光蛋白（GFP）表达的细胞是一种可接受的选择。

1. 使用血球计数2.4×10 ⁶个T细胞（1×10 ^5，每孔）。
2. 悬浮细胞在培养基中缺乏血清（血清饥饿）。孵育在37℃培养箱中培养的细胞2小时。
3. 离心细胞5分钟（400×g离心）。吸媒体和重新悬浮于1ml PBS中。
4. 加入CFSE在1:1000稀释（股票，以5毫米制造）。从灯罩后，于室温下8分钟。
5. 停止反应，加入10ml的37℃的PBS和自旋，在400×g离心5分钟。
6. 重悬细胞沉淀1.2毫升预热的密合性溶液（每50μl1×10 ⁵个细胞）。

的细胞4。刺激

注：为了启动粘连，细胞必须被刺激。在下面的实验中，细胞通过T细胞受体使用抗-CD3抗体交联刺激，但是可溶的SDF-1可以作为一种替代方法。取决于实验的目的，多种药理试剂可能之前或期间刺激被添加来研究细胞粘附的影响。佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）是一个佛波醇酯是在结构上类似于所述第二信使二酰基甘油（DAG），因此激活多种蛋白激酶s下行的T细胞受体（主要是蛋白激酶C）;这里它被用作阳性对照。

1. 温暖的微孔板至37°C。
2. 分裂细胞进入8个空1.5毫升管（150微升每管），一管为每个条件。
3. 相应地处理细胞：
   1. 刺激一管与物业管理公司在10毫微克/毫升，作为阳性对照。保持三根管治疗，作为对照用于刺激（“无刺激”），未洗涤的负载控制（“不洗涤”），并且控制对ICAM-1的涂层（“未包衣”）。
   2. 激发四个管子用不同浓度的抗CD3抗体（0.1，1，5，和10微克/毫升）。继续而不延误下一个步骤。
4. 分装50μL刺激细胞混合到每个空井。每孔细胞的最终数量为1×10 ^5。
5. 将微孔板在37℃培养箱中培养15分钟。
   注意：某些T细胞系需要更短的增产 tion时间。在这段时间内，细胞将沉淀下来到孔的底部，并且附着到目标配体。

5，洗去非贴壁细胞

注意：该步骤的目的是去除细胞，是不能够形成与配体包被的表面紧密接触。使用以多道移液器此步骤，以确保在相同的物理力施加到所有的孔中。它保持未洗，以协助贴壁细胞的百分比计算所指示的对照孔是非常重要的。

1. 加入150μl的温暖附着力解决方案，每个井。从井中取出介质之前，轻轻摇动板为几秒钟。请勿触摸孔的底部与技巧。
2. 重复此步骤三次。吹打进出缓冲时更改吸管的方向。

6，确定贴壁细胞的百分比

_content“>注意：在此步骤中的荧光板读取器用于在每个孔中测量荧光强度的强度与所述贴壁细胞的数目直接相关。

1. 打开平板阅读器。通过点击桌面上的快捷方式图标，打开酶标仪软件。
   1. 从“任务”菜单上，单击“新建”来建立一个新的协议。
   2. 从“操作”菜单中选择“查看”选项。点击“荧光强度”并点击“确定”选项卡。
   3. 从下拉菜单中选择“激发波长485”和“发射波长528”。点击“确定”选项卡。
   4. 在“光学”选项菜单中选择“底部”，并点击“确定”选项卡。返回到“操作”菜单，设定温度为37℃，然后单击“确定”。
   5. 插入到微孔板读板器和单击“运行”。其结果将被导出到excel电子表格。
2. 计算贴壁细胞用下列公式的百分比： 贴壁细胞的百分比=（读入洗涤井平均荧光强度）/（读入未洗涤的细胞的平均荧光强度）×100％。

结果

下面是使用与各种浓度的抗-CD3抗体的刺激的初级T细胞粘附试验的一个例子。它是有用的知道洗过细胞的荧光（ 即总负荷）。未刺激的细胞作为阴性对照和PMA处理的细胞是阳性对照的抗-CD3抗体。细胞接种于无涂层的水井作为ICAM-1的控制。在一个典型的实验中附着的PMA处理的细胞的百分比在40％至50％，而未受刺激的细胞的百分比在5％至10％。量化细胞粘附性的另一种方法是通过荧光强度的计算倍的每个条件较未刺激的细胞。

表1示出的CFSE荧光强度标记的初级T细胞刺激了不同剂量的可溶性抗-CD3抗体以及镀上的ICAM-1包被的孔， 图1示出了代表性的即时通讯年龄相似的实验。将细胞负从外周血中选择。血清饥饿2小时后，2.4×10 ⁶个细胞用CFSE标记后跟刺激与可溶性抗CD3抗体以各种浓度。刺激的细胞铺板到ICAM-1包被的孔，并温育在黑暗中15分钟。温育后，非贴壁细胞洗涤三次，并用酶标仪在485nm处的荧光强度进行测定。 PMA处理和未刺激的细胞作为对照。注意，第一柱（图1A-1C）...

讨论

有几个实验来研究信号与LFA-1的活化和T细胞粘附^12。流式细胞术是用于使用结合选择性要么弯曲或延伸LFA-1单克隆抗体来测量LFA-1的亲和力状态中活细胞。一个这种方法的局限性是，它并没有考虑到整联“亲合力。迁移测定是有用的工具，但他们测量的迁移，而不是微不足道的密合性在特定的时间点。小鼠模型来研究T淋巴细胞的迁移（ 如皮肤过敏模型）是生理有关，但是利用这些模型是多因素的，复杂的执行。这里所描述的静态粘合力测定法的主要优点在于它的测量以简单的方式二者的亲合力和亲和力的能力。这种方法的另一个优点是它能够快速，准确地检测出少量的细胞的能力。当与其它方法相比，它更容易MANIP乌拉特细胞，在功能测定为我们描述一个不同的试剂对待他们。此外，该贴壁细胞用酶标仪，具有手动计数关联消除偏压客观计数。此方法可用于筛选多种药物或基因操作上的附着过程的影响。

但是这种技术是不自由的限制。一个潜在的缺点是，贴壁细胞的百分比是相对数，其可以变化从一个试验到另一个。另一个弱点是，爆炸淋巴细胞不能被使用，因为这些都必须新鲜分离的。此外，随着细胞从冷冻的外周血单核细胞中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微孔板检测仪	BioTek	Synergy H1 混合
型多通道移液器	Fisher	21-377-829
96 孔微孔板，带光学底部	Corning Costar	3603
重组 ICAM-1	R&D Systems	ADP4-050
抗 CD3 抗体	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	分子探针	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS，含钙和镁	Gibco
外周淋巴细胞	例如 小鼠或人
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
氯化钙	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 软件	BioTek	版本 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
15 和 50 ml 离心管	Fisher	352099， 352070
一次性塑料巴斯德移液器	Fisher	13-711-7M
T-75 培养瓶	Fisher	50-754-1366
RosetteSep T 细胞感染套件	StemCell Technologies	15061