静态黏附实验是一种强大的工具，可用于模拟T淋巴细胞与其他细胞类型之间的相互作用。该实验通过将标记的T细胞注入包被有黏附分子的孔板中以形成相互作用，随后使用酶标仪在多次洗涤后定量测定黏附细胞的数量。
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摘要
摘要
T淋巴细胞黏附是多种T细胞功能所必需的，包括迁移至炎症部位以及与抗原呈递细胞形成免疫突触。T细胞通过调控整合素（integrin）的黏附特性来实现对黏附过程的调控。整合素是一类由跨膜蛋白异源二聚体组成的细胞黏附分子，可与相邻细胞或细胞外基质上的靶分子相互作用。在T细胞中最主要的整合素是淋巴细胞功能相关抗原（LFA）-1，它由αL和β2亚基组成，其靶分子为细胞间黏附分子（ICAM）-1。T细胞调控黏附的能力来源于其对单个整合素亲和力状态的调节能力。所谓“由内而外”（inside-out）信号通路，是指细胞内信号促使整合素的胞外结构域转变为活化状态的过程。目前对这些复杂现象的大部分认识，均基于在简化的体外（in vitro）模型系统中进行的机制性研究。本文所述的T淋巴细胞黏附实验是一种优良工具，可在静态条件下使T细胞与靶分子发生黏附，并利用荧光酶标仪定量检测黏附能力。该实验方法已被广泛用于鉴定作用于淋巴细胞的黏附刺激性或抑制性物质，并有助于表征相关信号转导事件。尽管本文以LFA-1与ICAM-1介导的黏附为例进行描述，但该方法可轻松改造，用于研究其他类型的黏附相互作用（例如，e.g. VLA-4与纤连蛋白的相互作用）。
引言
T淋巴细胞黏附是免疫应答中的一个基本过程1。该过程对于T细胞与毛细血管壁上皮细胞的相互作用、淋巴结内抗原呈递细胞（APC）的扫描，以及与靶细胞形成免疫突触（IS）至关重要2。这些功能在机制和动力学上各不相同。淋巴细胞穿出血管的过程包括趋化吸引、滚动、牢固黏附和跨内皮迁移。从滚动到牢固黏附的转变要求T细胞迅速响应G蛋白偶联受体信号，从而引发整合素与其配体的相互作用，使滚动的细胞减速并最终停止3。这一过程由整合素亲合力的快速变化所介导。细胞迁移需要T细胞与内皮细胞之间发生动态相互作用，在“前端”形成黏附结构，约一分钟后在“后端”解离黏附4。免疫突触在数分钟内形成，但需维持数小时的稳定性6。
有趣的是，一种黏附分子——整合素家族成员淋巴细胞功能相关抗原（LFA）-1，在所有这些过程中均起着关键作用5。LFA-1通过与免疫球蛋白超家族的多个成员相互作用介导细胞黏附。其中研究最为广泛、与LFA-1亲和力最高的配体是细胞间黏附分子（ICAM）-1。未活化的循环淋巴细胞在细胞表面表达低亲和力的LFA-1，因此无法黏附于包被ICAM-1的表面。LFA-1的亲和力具有可变性，并受到多种信号事件的调控，例如G蛋白偶联受体的激活、细胞因子刺激以及T细胞受体（TCR）介导的信号。高亲和力形式的LFA-1通过与ICAM-1相互作用，将细胞内活化信号传递至胞外空间，该通路被称为“由内向外”（inside-out）信号传导7。同样，由胞外空间经LFA-1传递的信号则称为“由外向内”（outside-in）信号传导。
参与由内而外和由外而内的信号转导通路是当前研究的主要焦点。小分子GTP酶Rap1最近被发现是T细胞受体交联和细胞因子信号通路中由内而外信号转导的共同关键组分8。Rap1在整合素活化中的关键作用已通过以下发现得到证实：Rap1的过表达可促进T细胞依赖整合素的黏附，而表达显性负性Rap1则可阻断T细胞的黏附9。这些关于Rap1调控整合素机制的认识进展，主要借助体外（in vitro）研究工具得以实现，其中就包括本文所述的静态黏附实验。
本方法的总体目标是研究T细胞对ICAM-1包被表面的黏附性。更具体而言，该方法用于在不同条件下，实时、客观地测量和量化活细胞中LFA-1对其配体的亲和力。该技术采用ICAM-1包被的聚苯乙烯孔板，以模拟T细胞相互作用的细胞表面。以往描述的许多静态T细胞黏附实验在操作上较为复杂，通常需要对T细胞进行放射性标记，使用培养的牛角膜细胞构建细胞外基质作为T细胞黏附的基底，或采用非生理性的长时间T细胞刺激以促进其黏附10。在黏附孵育后，采用荧光定量法检测T细胞数量，相较于流式细胞术和显微镜检测等其他常用检测方法，具有更高的灵敏度和准确性11。此外，单细胞水平的整合素定位显微分析无法像荧光定量法那样实现大范围的群体水平分析。尽管目前已有针对活化状态特异性LFA-1的商业化抗体，但其灵敏度相较于本方法仍较低。该方法相较于其他技术的主要优势在于操作简便，并可同时检测多种实验条件。在将本方法应用于特定研究时，需注意T细胞应通过阴性筛选获得，新鲜分离，并用荧光标记物进行标记。
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方案
1. 包被微孔板孔
注意：此步骤的目的是用 ICAM-1 包被聚苯乙烯表面，以作为 T 细胞 LFA-1 的配体。
- 准备以下溶液：
- 通过将重组 ICAM-1 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4）重悬，并添加钙（1 mM CaCl2）和镁（2 nM MgCl2）来制备包被液。确保 ICAM-1 的终浓度为 10 μg/ml，由 0.7 mg/ml 的储备液稀释而成，并保存于 -80 °C 冰箱中。
- 通过向 PBS 中添加 0.5% 人血清白蛋白（或牛血清白蛋白，HSA/BSA）、2 mM MgCl2, 和 1 mM CaCl2 来制备黏附液。
- 通过向 PBS 中添加 2 mM MgCl2 和 1 mM CaCl2 制备洗涤液。使用前将所有溶液预热至 37 °C。
- 用 50 μl 洗涤液清洗 24 个孔，包括未包被的孔、阳性对照（PMA 处理的细胞）和阴性对照（未包被的孔）。每种条件至少设置三个重复孔（三复孔）。
- 向每个孔中加入 50 μl 包被液，未包被的对照孔不加。在 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
- 轻柔地吸去包被液，避免吸头接触孔底。用 50 μl 洗涤液清洗一次。
- 向微孔板中加入 50 μl 黏附液，并在 37 °C 培养箱中孵育 1 小时 。
- 轻柔地吸去液体，并用 50 μl 洗涤液清洗一次。应于当天使用该微孔板，但也可在 4 °C 保存过夜，并于次日使用。
2. 从血液中分离T细胞
- 每毫升全血中加入 50 μl 人 T 细胞富集混合液（例如，对于 3 ml 抗凝全血（肝素、EDTA 或枸橼酸盐抗凝），加入 150 μl 混合液）。充分混匀。
- 在室温下孵育 20 分钟 。
- 向一个 50 ml 离心管中加入 3 ml 处理后的血液和等体积的 PBS（不含钙和镁），PBS 中添加 1% D-葡萄糖，温度为室温。用巴氏吸管轻轻混匀。
- 向离心管中加入 15 ml Ficoll-Paque PLUS。
- 小心地将 6 ml 稀释后的血液样本叠加于淋巴细胞分离液上层。
- 在 20 °C 条件下以 400 × g 离心 20 分钟 ，关闭刹车。
- 用洁净的巴氏吸管吸去上层液体，保留界面处的淋巴细胞层不受扰动。血浆上层可保存以备后续使用。 使用洁净的巴氏吸管将淋巴细胞层转移至另一洁净离心管中。
- 向淋巴细胞中加入 3 倍体积（9 ml）的 PBS。通过巴氏吸管轻柔地反复吸打，使细胞悬浮。
- 在 20 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟 。
- 弃去上清液。此时淋巴细胞应悬浮于适合后续应用的培养基中。将细胞转移至含 20 ml RPMI 1640 培养基（含 10% FBS、1% 青霉素/链霉素）的 T-75 培养瓶中。
3. 细胞的制备
注意：细胞需预先用荧光试剂标记。本方案中使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE），但表达绿色荧光蛋白（GFP）的细胞也可作为可接受的替代方案。
- 使用血细胞计数板计数 2.4 × 106 个 T 细胞（每孔 1 × 105 个）。
- 将细胞重悬于无血清培养基中（血清饥饿处理），在 37 °C 培养箱中孵育 2 小时 。
- 以 400 × g 离心 5 分钟 ，吸除上清液，并将细胞重悬于 1 ml PBS 中。
- 按 1:1,000 比例加入 CFSE（储存液浓度为 5 mM），避光并在室温下孵育 8 分钟 。
- 加入 10 ml 37 °C 的 PBS 终止反应，然后以 400 × g 离心 5 分钟。
- 用 1.2 ml 预热的黏附溶液重悬细胞沉淀（每 50 μl 含 1 × 105 个细胞）。
4. 细胞刺激
注意：为了启动细胞黏附，必须对细胞进行刺激。在以下实验中，通过使用抗 CD3 交联抗体刺激 T 细胞受体（TCR）来实现细胞刺激，但也可使用可溶性 SDF-1 作为替代方法。根据实验目的，可在刺激前或刺激过程中加入不同的药理学试剂，以研究其对细胞黏附的影响。佛波酯肉豆蔻酸酯（PMA）是一种佛波酯，其结构与第二信使二酰甘油（DAG）相似，因此可激活 TCR 下游的多种激酶（主要是蛋白激酶 C）；本实验中将其用作阳性对照。
- 将微孔板预热至 37 °C。
- 将细胞分装至 8 个空的 1.5 ml 离心管中（每管 150 μl），每管对应一种实验条件。
- 相应处理细胞：
- 向其中一管加入 PMA 至终浓度为 10 ng/ml，作为阳性对照；保留三管不作处理，分别作为刺激对照（“无刺激”）、未洗涤上样对照（“无洗涤”）以及 ICAM-1 包被对照（“未包被”）。
- 向四管中分别加入不同浓度的抗 CD3 抗体（0.1、1、5 和 10 μg/ml）进行刺激。处理后立即进入下一步操作，避免延迟。
- 将 50 μl 刺激后的细胞悬液分装至各空孔中。每孔最终细胞数量为 1 × 105 个。
- 将微孔板置于 37 °C 培养箱中孵育 15 分钟。
注意：某些 T 细胞系需要较短的刺激时间。在此期间，细胞将沉降至孔底并黏附于目标配体上。
5. 洗去非贴壁细胞
注意：此步骤的目的是去除未能与配体包被表面形成紧密接触的细胞。此步骤应使用多通道移液器，以确保对所有孔施加相同的物理作用力。必须保留指定的对照孔不进行洗涤，以便计算黏附细胞的百分比。
- 向每个孔中加入 150 μl 温热的黏附溶液。轻轻振荡培养板数秒，然后吸去孔中的培养基。移液时切勿让枪头接触孔底。
- 重复此步骤三次。吸取缓冲液时应改变移液器的方向。
6. 测定贴壁细胞百分比
注意：此步骤使用荧光酶标仪测量每个孔中的荧光强度。荧光强度与贴壁细胞数量呈直接相关。
- 打开酶标仪。通过点击桌面上的快捷图标启动酶标仪软件。
- 在“Task”菜单中点击“New”，以建立一个新的实验方案。
- 在“Actions”菜单中选择“Read”选项，点击“Fluorescent intensity”，然后点击“Ok”按钮。
- 在下拉菜单中选择“Excitation wavelength 485”和“Emission wavelength 528”，然后点击“Ok”按钮。
- 在“Optic”选项菜单中选择“Bottom”，点击“Ok”按钮。返回“Actions”菜单，将温度设置为 37 °C，然后点击“Ok”。
- 将微孔板插入酶标仪，点击“Run”。结果将导出至 Excel 表格中。
- 使用以下公式计算贴壁细胞的百分比：贴壁细胞百分比 = （洗涤孔中测得的平均荧光强度）/（未洗涤孔中测得的平均荧光强度） × 100%。
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结果
以下是一个使用不同浓度抗CD3抗体刺激的原代T细胞进行黏附实验的示例。了解未洗涤细胞的荧光强度是有帮助的（即 总上样量）。未刺激的细胞作为抗CD3抗体的阴性对照，PMA处理的细胞作为阳性对照。接种于未包被孔中的细胞作为ICAM-1的对照。在典型实验中，PMA处理细胞的黏附率介于40%至50%之间，而未刺激细胞的黏附率介于5%至10%之间。另一种量化细胞黏附性的方法是计算各实验条件下荧光强度相对于未刺激细胞的倍数增加。
表1显示了用不同浓度的可溶性抗CD3抗体刺激并接种于ICAM-1包被孔板上的CFSE标记的原代T细胞的荧光强度。图1展示了类似实验的代表性图像。细胞从外周血中通过阴性筛选获得。血清饥饿处理2小时后，将2.4 × 106个细胞用CFSE标记，随后用不同浓度的可溶性抗CD3抗体进行刺激。刺激后的细胞接种至ICAM-1包被的孔板中，在避光条件下孵育15分钟。孵育结束后，未贴壁细胞被洗涤三次，然后使用酶标仪在485 nm波长下测定荧光强度。以PMA处理组和未刺激组细胞作...
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讨论
有多种检测方法可用于研究LFA-1活化及T细胞黏附的信号通路12。流式细胞术可用于测量活细胞中LFA-1的亲和状态，其原理是利用单克隆抗体选择性地结合弯曲型或伸展型的LFA-1。该方法的一个局限性在于无法反映整合素的亲合力（avidity）。迁移实验是有效的研究工具，但其测量的是细胞迁移过程，而非特定时间点的单纯黏附情况。用于研究T淋巴细胞迁移的小鼠模型（例如皮肤超敏反应模型）具有生理相关性，但这些模型的应用涉及多种因素，操作复杂。本文所述的静态黏附实验主要优势在于能够以简便的方式同时检测亲和力（affinity）与亲合力（avidity）。该方法的另一优点是可快速、准确地检测少量细胞。与其他方法相比，在功能性实验（如本文所述）中更易于对细胞进行操作，并用不同试剂处理。此外，黏附细胞可通过酶标仪进行客观计数，避免了人工计数带来的偏差。该方法可用于筛选多种药物或基因操作对黏附过程的影响。
然而，该技术也存在一定的局限性。一个潜在的缺点是，黏附细胞的百分比是一个相对数值，可能因实验而异。另一个缺点是无法使用母细胞样淋巴细胞，因为这类细胞必须新鲜分...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了 Hirschil Trust、Michael Saperstein 医学学者研究基金以及纽约大学 Whitehead 会士项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酶标仪 | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| 多通道移液器 | Fisher | 21-377-829 | |
| 带光学底的96孔微孔板 | Corning Costar | 3603 | |
| 重组ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| 抗CD3抗体 | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| 含钙和镁的DPBS | Gibco | 14190250 | |
| 外周淋巴细胞 | e.g. 小鼠或人源 | ||
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Gen5 软件 | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 和 50 ml 离心管 | Fisher | 352099, 352070 | |
| 一次性塑料巴斯德吸管 | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 培养瓶 | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T细胞富集试剂盒 | StemCell Technologies | 15061 |
参考文献
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