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小鼠实验性自身免疫性心肌炎中心脏异常的磁共振显微成像无创评估

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DOI：

10.3791/51654

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2014年6月20日

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1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究展示了磁共振显微成像成功建立为一种非侵入性工具，可用于评估患自身免疫性心肌炎小鼠的心脏异常。数据表明，该技术可用于在活体动物中监测疾病进展。

摘要

心肌炎是心肌的炎症，但仅有约10%的患者表现出疾病的临床症状。为了研究心肌损伤中的免疫事件，已广泛使用多种小鼠心肌炎模型。本研究采用在A/J小鼠中通过心脏肌球蛋白重链（Myhc）-α 334-352诱导的实验性自身免疫性心肌炎（EAM）模型；受影响的动物出现淋巴细胞性心肌炎，但无明显临床体征。在此模型中，展示了磁共振显微成像（MRM）作为一种无创手段，在Myhc-α 334-352免疫小鼠中评估心脏结构和功能变化的应用价值。EAM小鼠与健康小鼠均使用一台9.4 T（400 MHz）89 mm垂直超导磁体扫描仪进行成像，该设备配备4 cm螺旋射频成像探头和100 G/cm三轴梯度系统。通过基于梯度回波的电影脉冲序列对麻醉动物进行心脏成像，并利用呼吸和脉搏血氧监测仪对动物进行生理监测。分析结果显示，与健康小鼠相比，EAM小鼠心室壁厚度增加，同时心室内径相应减小。数据表明，活体动物炎症心脏的形态学和功能变化可通过MRM实现无创监测。综上所述，MRM在评估由感染性病原体引起的心肌损伤进展与消退，以及治疗反应方面具有优势。

引言

心力衰竭是导致死亡的首要原因，而心肌炎是青少年心力衰竭的主要病因之一1。大多数心肌炎患者无明显症状，且疾病可自行缓解2。然而，约10%-20%的患者可能发展为慢性疾病，进而导致扩张型心肌病（DCM）3。目前已建立多种动物模型用于研究心肌炎的免疫发病机制。在易感心肌炎的A/J和Balb/c小鼠中，可通过免疫心脏肌球蛋白重链（Myhc）-α或其免疫优势肽片段，或通过感染柯萨奇病毒B3等病原体来诱导疾病4-9。本研究采用Myhc-α 334-352肽段诱导A/J小鼠心肌炎。尽管存在心肌浸润，但患病动物临床上表现正常；诊断主要依据心脏组织炎症的组织学评估7和超声心动图检查10。

磁共振显微成像（MRM）是一种常用的方法，可用于获得高分辨率的三维心血管图像，能够评估微小血管（直径可达10 μm）水平的功能细节；然而，常规磁共振成像（MRI）扫描通常只能达到约1 mm的分辨率11-14，无法实现如此高的分辨能力。MRM的优势在于能够在疾病早期阶段获取高分辨率图像，并提取功能参数14。临床上，MRM成像已被广泛用于研究病变心脏、肺或脑的功能参数15-17。本研究展示了将MRM技术作为一种非侵入性工具，用于确定自身免疫性心肌炎A/J小鼠的心脏异常。具体而言，MRM成像能够以合理的准确性量化左心室（LV）舒张末期容积和射血分数（EF）等功能参数18。各参数定义如下：左心室舒张末期容积，指舒张期结束时左心室内血液的容积；射血分数，指每搏输出量与舒张末期容积的比值。数据分析采用免费提供的Segment软件进行，该软件专为处理磁共振扫描仪获取的符合DICOM标准的心血管图像而开发19。数据显示，与健康小鼠相比，心肌炎动物模型的左心室壁厚度增加，同时左心室舒张末期容积、每搏输出量和射血分数均降低。

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方案

伦理声明：

所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》的规定进行，并经美国内布拉斯加州林肯市内布拉斯加大学林肯分校批准。

1. 实验性自身免疫性心肌炎的诱导

  1. 将 Myhc-α 334-352 溶解于 1× 磷酸盐缓冲液中，配制成终浓度为 2 mg/1.5 ml 的多肽溶液。
  2. 取含 50 μg 冻干百日咳毒素（PT）的小瓶，加入 1 ml 无菌 1× PBS，配制成 50 ng/μl 的储备液。取 20 μl 储备液加入无菌 1.5 ml 离心管中，再加入 980 μl 无菌 1× PBS，配制成 1 ng/μl 的工作液。
  3. 向 10 ml 完全弗氏佐剂（CFA）中加入 40 mg 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37Rv（MTB）提取物，配制成终浓度为 5 mg/ml 的 CFA。
  4. 制备多肽-CFA 乳剂。注意：用于诱导实验性自身免疫性心肌炎（EAM）时，每只动物皮下注射 150 μl 乳剂，含 100 µg Myhc-α 334-352。例如，免疫 10 只小鼠需使用含 1 mg Myhc-α 334-352 的 1.5 ml 多肽-CFA 乳剂。
    1. 为配制 1.5 ml 乳剂，取 750 μl Myhc-α 334-352 多肽溶液加入一个 1.5 ml 离心管中，另取等体积含 MTB 的 CFA 加入另一个 1.5 ml 离心管中。使用一支 3 ml 鲁尔锁扣注射器，先吸取多肽溶液，再吸取 CFA/MTB 混合液。
    2. 将注射器连接至三通阀，并将三通阀的另一出口连接一支空的 3 ml 注射器。调节三通阀的通畅度，使多肽-CFA 混合液在两支注射器之间转移时具有适当阻力。
    3. 反复推动注射器活塞，使液体在两支注射器间转移约 1 分钟，然后将整个装置置于冰上约 3 分钟。此操作至少重复 10 次。
    4. 通过将少量乳剂滴入 100 ml 玻璃烧杯的静水中，检测乳剂的稠度。乳剂滴不应在水中扩散；若发生扩散，则需继续混合，直至达到理想稠度。
    5. 更换连接在三通阀上的其中一支 3 ml 注射器为 1 ml 鲁尔锁扣注射器，将乳剂从 3 ml 注射器转移至 1 ml 注射器中，并在 1 ml 注射器上安装 27½ G 针头。
  5. 在 6 至 8 周龄雌性 A/J 小鼠的双侧腹股沟区域，皮下分次注射共 150 µl 多肽-CFA 乳剂（每侧约 75 µl）。
  6. 在免疫当天（第 0 天）和免疫后第 2 天，每只动物腹腔注射 100 μl PT 悬液（含 100 ng PT）。
  7. 于第 7 天重复免疫程序：将 150 µl 新鲜配制的多肽-CFA 乳剂分次皮下注射至胸骨两侧（每侧约 75 µl）。随后于第 21 天对动物进行 MRM 成像，参见步骤 3。

2. 动物操作

  1. 将每只小鼠放入麻醉诱导室中，室内含有2%异氟烷-空气混合气体，并在下方放置加热垫以维持体温，随后将动物转移至特制的动物固定装置（图 1）。
  2. 将动物以俯卧位固定在动物固定装置上，使其鼻部插入鼻罩以维持麻醉（图 1）。使用与小鼠门齿相连的咬合杆固定其头部。
  3. 开启空气吹热器，并将其出气软管插入扫描仪的垂直孔中，以在实验期间维持动物体温。
  4. 在整个成像过程中，以2 ml/min的流速维持0.5%至2%的异氟烷浓度进行麻醉。通过脚趾夹捏法确认麻醉深度，应无任何运动反应。
  5. 设置气动枕式传感器、小鼠尾部/踝部光纤脉搏血氧传感器以及直肠温度探针，分别用于监测呼吸、心率和体温（图 1）。注意：心脏门控通过脉搏血氧仪实现，可无创监测动脉血氧饱和度。脉搏血氧传感器应固定于左踝，足部用线圈固定并用胶带缠绕，以保持踝部位于传感器内。磁共振显微成像（MRM）通过呼吸和心脏信号门控实现，无需使用任何对比剂。

3. 图像采集

  1. 在完成动物准备后（图 1），将小鼠置于MRM扫描仪中心，使心脏位于视场（FOV）中心，此处磁场均匀性最高。注：应使用配备100 G/cm三轴梯度和4 cm射频（RF）成像线圈的宽孔径（89 mm） 9.4 T垂直磁体，以获取高分辨率三维（3D）图像。注意：使用MRI扫描仪时，务必使用无磁性物品。 
  2. 运行成像界面，从“Study Options”菜单中选择“New Study”。在命令栏中输入“mtune”并运行，以调出“Tune GUI”。然后选择“Start Probe Tune”，并点击“Autoscale”按钮。Tune GUI将更新以显示RF信号。使用线圈末端的远程调谐/匹配旋钮，将RF线圈调谐至质子共振频率（400 MHz）。在“Start”选项卡中进入“Prescan”页面，点击相应按钮执行频率和功率校准。在“Study”选项卡的“Shim”选项卡中点击XYZ（快速）按钮，调出匀场页面。进入匀场页面，选择所有迭代项，点击shim按钮以执行自动匀场。
  3. 在成像界面的“Study”选项卡中选择一个定位序列，以定位小鼠心脏。在“Acquire”选项卡中将FOV调整为35 mm2，并保持设备默认设置。点击“Start”运行序列；若心脏未位于FOV中心，调整动物固定装置的位置，重新调谐RF线圈，并再次获取定位图像。
  4. 在“Study”选项卡中点击“GEMS”序列按钮，然后在相应的“Acquire”选项卡中输入采集参数，以获取沿心脏短轴和长轴的两个正交平面图像20,21。注：梯度回波扫描的典型采集参数为：层厚1 mm；重复时间（TR）200 msec；回波时间（TE）2.67 msec（最小值）；翻转角25°；面内矩阵大小128 × 128；FOV 22 mm2；采集次数4次；总采集时间约1分钟 30秒。
  5. 在“Adv”选项卡中选择“CINE”序列，采集脉搏血氧门控的短轴电影MR图像，以测量左心室（LV）解剖和功能参数。根据心脏长轴视图，通过鼠标悬停和拖动调整成像层面的位置和角度。在“Acquire”选项卡中输入以下成像参数以获取梯度回波电影序列：TR 500 msec；TE 5 msec；FOV 22 mm2；采集矩阵256 × 256；层厚1 mm；采集次数8次；帧数6帧；采集时间约17分钟。点击“Start”开始采集。
  6. 使用成像软件的“I/O”选项卡将采集的图像转换为DICOM格式，并将相应文件传输至数据中心进行处理。
  7. 成像过程结束后，将小鼠置于滤帽笼中恢复麻醉。在小鼠恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得离开无人看护，并根据需要保留用于后续研究。

4. 心脏磁共振显微成像的数据分析

  1. 使用 Segment 软件分析左心室的解剖与功能参数19。通过“文件”菜单中的“打开图像文件”子菜单，将 DICOM 格式的电影图像导入软件。在图形用户界面（GUI）中选择“MRGE”作为成像技术，“Cine”作为图像类型，“短轴中室”作为图像切面。
  2. 分别通过“编辑”菜单中的“将当前时间帧设为舒张末期”和“将当前时间帧设为收缩末期”子菜单，指定用于舒张末期和收缩末期的时间帧。
  3. 首先点击“LV”命令按钮，然后点击右下方面板上的“ENDO”和“EPI”命令按钮，分别手动绘制左心室心内膜和心外膜。点击相应的命令按钮去除乳头肌，以提高计算的准确性。
  4. 在右上面板读取定量的左心室参数，如舒张期容积、收缩期容积、每搏输出量和射血分数。点击“Misc”命令按钮，然后点击“Measurement Caliper”命令按钮，测量左心室壁厚度和心室直径等参数22。
  5. 点击“文件”菜单中的“保存图像堆栈和分割结果”子菜单，将包含分割信息的图像以“.mat”格式保存，以便按需重新处理图像。

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结果

本报告展示了MRM技术作为一种无创手段，在评估患EAM动物心脏结构和功能变化中的应用价值。通过使用Myhc-α 334-352肽段在CFA7中免疫A/J小鼠以诱导心肌炎，并在免疫后第21天对动物进行MRM实验。MRM成像在异氟烷麻醉下的活体动物中进行，磁场强度为9.4 T（质子共振频率400 MHz），采用配备三轴梯度系统（最大强度100 G/cm）的89 mm垂直腔磁体。首先获取定位像以确定小鼠心脏位置并将其置于FOV中心，随后获取轴向图像以获得长轴四腔视图。两腔视图的心脏成像角度如图2A所示。心脏图像使用直径4 cm的千足虫射频成像探头，结合基于梯度回波的电影脉冲序列采集。利用Segment软件分析心脏功能指标（成像参数：左心室壁厚度；输出参数：左心室舒张末期容积和射血分数）。与健康小鼠相比，患EAM小鼠心脏的结构异常表现为左心室壁厚度增加约1.5倍（p = 0.018）（图2B和表1），同时伴随左心室舒张末期容积[18.0 ± 4.2 µl vs. 37.5 ± 3.5 µl，图2C

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讨论

本研究描述了MRM技术及其作为非侵入性工具在确定患自身免疫性心肌炎小鼠心脏异常方面的应用价值。由于实验性自身免疫性心肌炎（EAM）的组织学特征与人类感染后心肌炎相似，小鼠模型常被用于阐明心肌损伤的免疫机制23-25。然而，患心肌炎的小鼠在临床上通常表现正常，诊断依赖于实验终点时的组织学检查7。动物通常在免疫后第21天被处死。这种仅在单一时间点评估疾病进程的方法限制了这些模型的应用，尤其是在药物研究中，对治疗干预下疾病进展的动态监测是一个关键需求。

为了确定活体动物的心脏异常，可采用磁共振成像（MRM）等非侵入性手段。此处描述的 MRM 技术具有无需使用对比剂即可获取心脏结构和功能特征的优势。然而，该技术需要在强磁场中采集高分辨率的三维解剖图像。尽管如此，一旦完成图像采集，即可利用商业软件后续分析左心室舒张末期容积和射血分数等功能参数，而无需再次组装 MRM 设备。如图 2所示，对免疫 Myhc-α 334-352 的动物进行 MRM 检查发现，其左心室壁厚度大于健康小鼠（图...

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致谢

本研究工作由美国国立卫生研究院（HL114669）资助。CM 获得了新泽西州心肌炎基金会颁发的博士后研究奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide，马萨诸塞州剑桥4 °C 保存
CFASigma Aldrich，密苏里州圣路易斯58814 °C 保存
MTB H37Rv 提取物Difco Laboratories，密歇根州底特律2311414 °C 保存
PTList Biologicals Laboratories，加利福尼亚州坎贝尔1814 °C 保存
1x PBSCorning，弗吉尼亚州马纳萨斯21-040-CV4 °C 保存
异氟烷Piramal Healthcare，印度孟买NDC66794-013-25
雌性 A/J 小鼠Jackson Laboratories，缅因州巴港646
Luer-lok 无菌 1 ml 注射器BD，新泽西州富兰克林湖309628
Luer-lok 无菌 3 ml 注射器BD，新泽西州富兰克林湖309657
无菌针头，18 GBD，新泽西州富兰克林湖305195
无菌针头，27 1/2 GBD，新泽西州富兰克林湖305109
三通阀Smiths Medical ASD, Inc.，俄亥俄州都柏林MX5311L
Kerlix 纱布绷带卷Covidien，马萨诸塞州曼斯菲尔德6720
Kimwipes 擦拭纸Kimberly-Clark Professional，佐治亚州罗斯韦尔34155
Protouch 织物套管Medline Industries，伊利诺伊州芒德莱因30-1001
无菌手术剪刀和镊子INOX tool Corporation
微波炉GE Healthcare, 
ThermiPAQ 冷热治疗系统 Theramics Corporation，伊利诺伊州斯普林菲尔德
爬行动物加热灯Energy Savers Unlimited, Inc. 加利福尼亚州卡森
3M Transpore 胶带Target Corporation，明尼苏达州
Up and Up 多粘菌素B硫酸盐/杆菌肽/新霉素硫酸盐抗生素软膏Target Corporation，明尼苏达州
North Safety DeciDamp-2PVC 泡沫耳塞North Safety Products，罗德岛州史密斯菲尔德
棉签，6’’ 木质杆 Jorgensen Laboratories, Inc. 科罗拉多州洛夫兰
麻醉诱导室 Summit Anesthesia Solutions，密歇根州安娜堡
Summit 麻醉支持系统，用于调节麻醉气体流量 Summit Anesthesia Solutions，密歇根州安娜堡
特制动物固定装置Agilent Technologies，加利福尼亚州圣克拉拉
Bickford Omnicon F/Air 麻醉气体过滤装置 A.M. Bickford, Inc. 纽约州威尔士中心
脉搏血氧仪模块，适用于磁共振的小动物监测与门控系统 Small Animal Instruments, Inc. 纽约州斯托尼布鲁克
氧气瓶 Matheson-Tri Gas，内布拉斯加州林肯，中北区
气体调节器 Western Medica，俄亥俄州西湖
信号中断模块，适用于磁共振的小动物监测与门控系统Small Animal Instruments, Inc. 纽约州斯托尼布鲁克
9.4 T (400 MHz) 89 mm 垂直腔体磁共振扫描仪Agilent Technologies，加利福尼亚州圣克拉拉
4 cm 百足虫式显微成像射频线圈Agilent Technologies，加利福尼亚州圣克拉拉
SAM PC 监视器Small Animal Instruments, Inc. 纽约州斯托尼布鲁克
定量医学图像分析软件http://segment.heiberg.se;  Segment v1.8 R1430,  Medviso，瑞典厄勒松地区
Matlab 软件The Mathworks, Inc.  马萨诸塞州纳蒂克
计算机-Unix 操作系统

参考文献

  1. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
  2. Fujinami, R. S., et al. Molecular mimicry, bystander activation, or viral persistence: infections and autoimmune disease. Clin Microbiol Rev. 19 (1), 80-94 (2006).
  3. Cihakova, D., Rose, N. R. Pathogenesis of myocarditis and dilated cardiomyopathy. Adv Immunol. 99, 95-114 (2008).
  4. Donermeyer, D. L., et al. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
  5. Gangaplara, A., et al. Coxsackievirus B3 infection leads to the generation of cardiac myosin heavy chain-alpha-reactive CD4 T cells in A/J mice. Clin Immunol. 144 (3), 237-249 (2012).
  6. Huber, S. A., Lodge, P. A. Coxsackievirus B-3 myocarditis in Balb/c mice. Evidence for autoimmunity to myocyte antigens. Am J Pathol. 116 (1), 21-29 (1984).
  7. Massilamany, C., et al. Identification of novel mimicry epitopes for cardiac myosin heavy chain-alpha that induce autoimmune myocarditis in A/J mice. Cell Immunol. 271, 438-449 (2011).
  8. Pummerer, C. L., et al. Identification of cardiac myosin peptides capable of inducing autoimmune myocarditis in BALB/c mice. J Clin Invest. 97 (9), 2057-2062 (1996).
  9. Rose, N. R., Hill, S. L. The pathogenesis of postinfectious myocarditis. Clin Immunol Immunopathol. 80, (1996).
  10. Saraste, A., et al. Coronary flow reserve and heart failure in experimental coxsackievirus myocarditis. A transthoracic Doppler echocardiography study. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, (2006).
  11. Altes, T. A., et al. Hyperpolarized 3He MR lung ventilation imaging in asthmatics: preliminary findings. J Magn Reson Imaging. 13 (3), 378-384 (2001).
  12. Driehuys, B., et al. Small animal imaging with magnetic resonance microscopy. ILAR J. 49 (1), 35-53 (2008).
  13. Smith, B. R. Magnetic resonance microscopy with cardiovascular applications. Trends Cardiovasc Med. 6 (8), 247-254 (1996).
  14. Potter, K. Magnetic resonance microscopy approaches to molecular imaging: sensitivity vs specificity. J Cell Biochem Suppl. 39, 147-153 (2002).
  15. Benveniste, H., Blackband, S. MR microscopy and high resolution small animal MRI: applications in neuroscience research. Prog Neurobiol. 67, 393-420 (2002).
  16. Epstein, F. H., et al. MR tagging early after myocardial infarction in mice demonstrates contractile dysfunction in adjacent and remote regions. Magn Reson Med. 48 (2), 399-403 (2002).
  17. Gewalt, S. L., et al. MR microscopy of the rat lung using projection reconstruction. Magn Reson Med. 29 (1), 99-106 (1993).
  18. Kern, M. J. The cardiac catheterization handbook., Edn 5th. , (2011).
  19. Heiberg, E., et al. Design and validation of Segment--freely available software for cardiovascular image analysis. BMC Med Imaging. 10, (2010).
  20. Cranney, G. B., et al. Left ventricular volume measurement using cardiac axis nuclear magnetic resonance imaging. Validation by calibrated ventricular angiography. Circulation. 82 (1), 154-163 (1990).
  21. Hiba, B., et al. Cardiac and respiratory double self-gated cine MRI in the mouse at 7 T. Magn Reson Med. 55 (3), 506-513 (2006).
  22. Bryant, D., et al. Cardiac failure in transgenic mice with myocardial expression of tumor necrosis factor-alpha. Circulation. 97 (14), 1375-1381 (1998).
  23. Neu, N., et al. Cardiac myosin-induced myocarditis as a model of postinfectious autoimmunity. Eur Heart J. 12 Suppl D, 117-120 (1991).
  24. Neumann, D. A., et al. Induction of multiple heart autoantibodies in mice with coxsackievirus B3- and cardiac myosin-induced autoimmune myocarditis. J Immunol. 152 (1), 343-350 (1994).
  25. Rose, N. R., et al. Postinfectious autoimmunity: two distinct phases of coxsackievirus B3-induced myocarditis. Ann N Y Acad Sci. 475, 146-156 (1986).
  26. Farmer, J. B., Levy, G. P. A simple method for recording the electrocardiogram and heart rate from conscious animals. Br J Pharmacol Chemother. 32 (1), 193-200 (1968).

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