小鼠实验性自身免疫性心肌炎中心脏异常的磁共振显微成像无创评估

摘要

本研究展示了磁共振显微成像成功建立为一种非侵入性工具，可用于评估患自身免疫性心肌炎小鼠的心脏异常。数据表明，该技术可用于在活体动物中监测疾病进展。

摘要

心肌炎是心肌的炎症，但仅有约10%的患者表现出疾病的临床症状。为了研究心肌损伤中的免疫事件，已广泛使用多种小鼠心肌炎模型。本研究采用在A/J小鼠中通过心脏肌球蛋白重链（Myhc）-α 334-352诱导的实验性自身免疫性心肌炎（EAM）模型；受影响的动物出现淋巴细胞性心肌炎，但无明显临床体征。在此模型中，展示了磁共振显微成像（MRM）作为一种无创手段，在Myhc-α 334-352免疫小鼠中评估心脏结构和功能变化的应用价值。EAM小鼠与健康小鼠均使用一台9.4 T（400 MHz）89 mm垂直超导磁体扫描仪进行成像，该设备配备4 cm螺旋射频成像探头和100 G/cm三轴梯度系统。通过基于梯度回波的电影脉冲序列对麻醉动物进行心脏成像，并利用呼吸和脉搏血氧监测仪对动物进行生理监测。分析结果显示，与健康小鼠相比，EAM小鼠心室壁厚度增加，同时心室内径相应减小。数据表明，活体动物炎症心脏的形态学和功能变化可通过MRM实现无创监测。综上所述，MRM在评估由感染性病原体引起的心肌损伤进展与消退，以及治疗反应方面具有优势。

引言

心力衰竭是导致死亡的首要原因，而心肌炎是青少年心力衰竭的主要病因之一¹。大多数心肌炎患者无明显症状，且疾病可自行缓解²。然而，约10%-20%的患者可能发展为慢性疾病，进而导致扩张型心肌病（DCM）³。目前已建立多种动物模型用于研究心肌炎的免疫发病机制。在易感心肌炎的A/J和Balb/c小鼠中，可通过免疫心脏肌球蛋白重链（Myhc）-α或其免疫优势肽片段，或通过感染柯萨奇病毒B3等病原体来诱导疾病^4-9。本研究采用Myhc-α 334-352肽段诱导A/J小鼠心肌炎。尽管存在心肌浸润，但患病动物临床上表现正常；诊断主要依据心脏组织炎症的组织学评估⁷和超声心动图检查¹⁰。

磁共振显微成像（MRM）是一种常用的方法，可用于获得高分辨率的三维心血管图像，能够评估微小血管（直径可达10 μm）水平的功能细节；然而，常规磁共振成像（MRI）扫描通常只能达到约1 mm的分辨率^11-14，无法实现如此高的分辨能力。MRM的优势在于能够在疾病早期阶段获取高分辨率图像，并提取功能参数¹⁴。临床上，MRM成像已被广泛用于研究病变心脏、肺或脑的功能参数^15-17。本研究展示了将MRM技术作为一种非侵入性工具，用于确定自身免疫性心肌炎A/J小鼠的心脏异常。具体而言，MRM成像能够以合理的准确性量化左心室（....

方案

伦理声明：

所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》的规定进行，并经美国内布拉斯加州林肯市内布拉斯加大学林肯分校批准。

1. 实验性自身免疫性心肌炎的诱导

1. 将 Myhc-α 334-352 溶解于 1× 磷酸盐缓冲液中，配制成终浓度为 2 mg/1.5 ml 的多肽溶液。
2. 取含 50 μg 冻干百日咳毒素（PT）的小瓶，加入 1 ml 无菌 1× PBS，配制成 50 ng/μl 的储备液。取 20 μl 储备液加入无菌 1.5 ml 离心管中，再加入 980 μl 无菌 1× PBS，配制成 1 ng/μl 的工作液。
3. 向 10 ml 完全弗氏佐剂（CFA）中加入 40 mg 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37Rv（MTB）提取物，配制成终浓度为 5 mg/ml 的 CFA。
4. 制备多肽-CFA 乳剂。注意：用于诱导实验性自身免疫性心肌炎（EAM）时，每只动物皮下注射 150 μl 乳剂，含 100 µg Myhc-α 334-352。例如，免疫 10 只小鼠需使用含 1 mg Myhc-α 334-352 的 1.5 ml 多肽-CFA 乳剂。
   1. 为配制 1.5 ml 乳剂，取 750 μl Myhc-α 33....

结果

本报告展示了MRM技术作为一种无创手段，在评估患EAM动物心脏结构和功能变化中的应用价值。通过使用Myhc-α 334-352肽段在CFA⁷中免疫A/J小鼠以诱导心肌炎，并在免疫后第21天对动物进行MRM实验。MRM成像在异氟烷麻醉下的活体动物中进行，磁场强度为9.4 T（质子共振频率400 MHz），采用配备三轴梯度系统（最大强度100 G/cm）的89 mm垂直腔磁体。首先获取定位像以确定小鼠心脏位置并将其置于FOV中心，随后获取轴向图像以获得长轴四腔视图。两腔视图的心脏成像角度如图2A所示。心脏图像使用直径4 cm的千足虫射频成像探头，结合基于梯度回波的电影脉冲序列采集。利用Segment软件分析心脏功能指标（成像参数：左心室壁厚度；输出参数：左心室舒张末期容积和射血分数）。与健康小鼠相比，患EAM小鼠心脏的结构异常表现为左心室壁厚度增加约1.5倍（p = 0.018）（图2B和表1），同时伴随左心室舒张末期容积[18.0 ± 4.2 µl vs. 37.5 ± 3.5 µl，图2C

讨论

本研究描述了MRM技术及其作为非侵入性工具在确定患自身免疫性心肌炎小鼠心脏异常方面的应用价值。由于实验性自身免疫性心肌炎（EAM）的组织学特征与人类感染后心肌炎相似，小鼠模型常被用于阐明心肌损伤的免疫机制^23-25。然而，患心肌炎的小鼠在临床上通常表现正常，诊断依赖于实验终点时的组织学检查⁷。动物通常在免疫后第21天被处死。这种仅在单一时间点评估疾病进程的方法限制了这些模型的应用，尤其是在药物研究中，对治疗干预下疾病进展的动态监测是一个关键需求。

为了确定活体动物的心脏异常，可采用磁共振成像（MRM）等非侵入性手段。此处描述的 MRM 技术具有无需使用对比剂即可获取心脏结构和功能特征的优势。然而，该技术需要在强磁场中采集高分辨率的三维解剖图像。尽管如此，一旦完成图像采集，即可利用商业软件后续分析左心室舒张末期容积和射血分数等功能参数，而无需再次组装 MRM 设备。如图 2所示，对免疫 Myhc-α 334-352 的动物进行 MRM 检查发现，其左心室壁厚度大于健康小鼠（图
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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)	Neopeptide，马萨诸塞州剑桥		4 °C 保存
CFA	Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯	5881	4 °C 保存
MTB H37Rv 提取物	Difco Laboratories，密歇根州底特律	231141	4 °C 保存
PT	List Biologicals Laboratories，加利福尼亚州坎贝尔	181	4 °C 保存
1x PBS	Corning，弗吉尼亚州马纳萨斯	21-040-CV	4 °C 保存
异氟烷	Piramal Healthcare，印度孟买	NDC66794-013-25
雌性 A/J 小鼠	Jackson Laboratories，缅因州巴港	646
Luer-lok 无菌 1 ml 注射器	BD，新泽西州富兰克林湖	309628
Luer-lok 无菌 3 ml 注射器	BD，新泽西州富兰克林湖	309657
无菌针头，18 G	BD，新泽西州富兰克林湖	305195
无菌针头，27 1/2 G	BD，新泽西州富兰克林湖	305109
三通阀	Smiths Medical ASD, Inc.，俄亥俄州都柏林	MX5311L
Kerlix 纱布绷带卷	Covidien，马萨诸塞州曼斯菲尔德	6720
Kimwipes 擦拭纸	Kimberly-Clark Professional，佐治亚州罗斯韦尔	34155
Protouch 织物套管	Medline Industries，伊利诺伊州芒德莱因	30-1001
无菌手术剪刀和镊子	INOX tool Corporation
微波炉	GE Healthcare,
ThermiPAQ 冷热治疗系统	Theramics Corporation，伊利诺伊州斯普林菲尔德
爬行动物加热灯	Energy Savers Unlimited, Inc. 加利福尼亚州卡森
3M Transpore 胶带	Target Corporation，明尼苏达州
Up and Up 多粘菌素B硫酸盐/杆菌肽/新霉素硫酸盐抗生素软膏	Target Corporation，明尼苏达州
North Safety DeciDamp-2PVC 泡沫耳塞	North Safety Products，罗德岛州史密斯菲尔德
棉签，6’’ 木质杆	Jorgensen Laboratories, Inc. 科罗拉多州洛夫兰
麻醉诱导室	Summit Anesthesia Solutions，密歇根州安娜堡
Summit 麻醉支持系统，用于调节麻醉气体流量	Summit Anesthesia Solutions，密歇根州安娜堡
特制动物固定装置	Agilent Technologies，加利福尼亚州圣克拉拉
Bickford Omnicon F/Air 麻醉气体过滤装置	A.M. Bickford, Inc. 纽约州威尔士中心
脉搏血氧仪模块，适用于磁共振的小动物监测与门控系统	Small Animal Instruments, Inc. 纽约州斯托尼布鲁克
氧气瓶	Matheson-Tri Gas，内布拉斯加州林肯，中北区
气体调节器	Western Medica，俄亥俄州西湖
信号中断模块，适用于磁共振的小动物监测与门控系统	Small Animal Instruments, Inc. 纽约州斯托尼布鲁克
9.4 T (400 MHz) 89 mm 垂直腔体磁共振扫描仪	Agilent Technologies，加利福尼亚州圣克拉拉
4 cm 百足虫式显微成像射频线圈	Agilent Technologies，加利福尼亚州圣克拉拉
SAM PC 监视器	Small Animal Instruments, Inc. 纽约州斯托尼布鲁克
定量医学图像分析软件	http://segment.heiberg.se;  Segment v1.8 R1430,  Medviso，瑞典厄勒松地区
Matlab 软件	The Mathworks, Inc.  马萨诸塞州纳蒂克
计算机-Unix 操作系统