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利用基因编码传感器进行谷氨酰胺通量成像

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DOI：

10.3791/51657

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2014年7月31日

 , 
1Virginia Tech

本文内容

摘要

本文将演示如何使用FRET在活细胞中监测谷氨酰胺动态。基因编码的传感器可实现对生物分子在亚细胞分辨率下的实时监测。文章将讨论基因编码谷氨酰胺传感器的实验设计、实验条件的技术细节以及实验后分析的注意事项。

摘要

基因编码的传感器能够以亚细胞分辨率实时监测生物分子。在过去15年中，已有大量针对各类生物分子的此类传感器被开发出来，其中一些已成为许多实验室常规使用的不可或缺的工具。

基因编码传感器的一个令人兴奋的应用是利用这些传感器研究细胞转运过程。可以在细胞水平上研究转运蛋白的动力学特性及底物特异性等性质，从而为特定细胞类型的转运活性分析提供可能。本文将以基因编码的谷氨酰胺传感器为例，展示如何观察转运蛋白的动态变化，并讨论实验设计、实验条件的技术细节以及实验后分析的注意事项。

引言

由于能够在细胞水平上检测转录组和蛋白质组的技术取得了显著进展，目前人们已明确，生物化学过程及其导致的代谢物和离子流具有高度的细胞类型特异性。例如，在哺乳动物肝脏中，谷氨酰胺的逐步降解和合成分别由门脉周围细胞和中央静脉周围细胞同时进行，前者将铵离子供给尿素循环，而后者则消耗多余的氨1-3。在某些情况下，即使在同一“细胞类型”内也能检测到显著的生化异质性4,5。除了这种空间特异性外，细胞内代谢物和离子的水平也具有高度动态性（例如，Ca2+和环核苷酸等信号分子）。代谢物和离子的时空分布模式通常在信号转导中发挥关键作用。然而，监测代谢物和离子的细胞动态变化仍面临独特挑战。在许多情况下，其浓度变化迅速且短暂，典型例子是Ca2+信号分子，在树突棘中的衰减时间仅约20毫秒6。此外，细胞内及细胞间生化通路的区室化使得利用提取结合色谱/质谱技术来定量代谢物和离子的动态变化变得困难。

由于具有高时空分辨率，可让实验人员研究寿命短暂和/或局限于特定区室的分子动态，因此针对生物分子的遗传编码传感器目前已得到广泛应用（详见文献7,8综述）。这些遗传编码传感器大致可分为两类：基于强度的传感器和基于比率的传感器。基于强度的传感器通常由一个结合结构域和一个荧光蛋白（FPs）组成，溶质与结合结构域结合后会改变荧光强度。而基于比率的传感器则通常利用成对荧光蛋白之间的 Förster 共振能量转移（FRET）。这类传感器包含一个结合结构域和两个荧光蛋白，溶质的结合会诱导两个荧光蛋白之间 FRET 效率的变化。在过去十年中，已开发出大量针对生物学重要代谢物和离子的传感器8,9。

这类基因编码传感器提供的令人兴奋的可能性之一，是可用于此前在细胞水平上难以检测的膜转运过程的高分辨率分析。基因编码传感器有助于分析转运机制，例如底物特异性和pH依赖性10,11。此外，结合模式生物的RNAi载体文库等遗传资源，现在可以利用基因编码传感器开展全基因组范围的新转运过程筛选。事实上，在多种情况下，基因编码传感器的应用已成功发现了此前未被表征的转运蛋白12,13。

最近，我们的实验室开发了一系列基于FRET的谷氨酰胺传感器。我们已证明，可利用此类FRET谷氨酰胺传感器对细胞内谷氨酰胺水平进行可视化观察。 10这些传感器由插入到细菌谷氨酰胺结合蛋白glnH中的FRET供体（mTFP1）以及位于glnH C末端的FRET受体（venus）组成图1。这些传感器在结合谷氨酰胺后，FRET效率降低，导致受体/供体荧光强度比值下降。谷氨酰胺转运过程的精细调控在神经传递等生物过程中具有重要意义 14,15 以及肝脏中尿素循环的维持 1,16,17.

本文展示了利用荧光显微镜宽场成像系统，通过谷氨酰胺FRET传感器分析转运活性的方法。本实验旨在检测单个细胞中的转运蛋白活性，并研究瞬时表达转运蛋白的底物特异性。

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方案

1. 样品制备

注意：在许多情况下，灌流实验会冲走大量细胞，这可能成为一个令人困扰的问题。尽管并非所有细胞系都需要，但在盖玻片表面包被多聚-L-赖氨酸（向表面加入 1.0 ml/25 cm2 的 0.01% 溶液，孵育 >5 分钟，用细胞培养级水洗涤两次，并在生物安全柜中干燥）可增强细胞贴附。同时，请注意所用细胞系的生物安全等级（BSL），并遵循当地环境健康与安全办公室批准的标准操作程序。本实验使用了 cos7 细胞，因其内源性谷氨酰胺转运活性较低（见图 4）。

  1. 在6孔培养板中放置无菌的25 mm玻璃盖玻片或8孔玻璃底培养皿，接种cos7细胞，细胞融合度约为70–80%，培养基为含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。于37 °C、5% CO2、100%湿度条件下培养24小时。
  2. 根据制造商说明书，将生长培养基更换为含10%胎牛血清但不含抗生素的DMEM。于37 °C、5% CO2、100%湿度条件下过夜培养。
  3. 将编码谷氨酰胺传感器（pcDNA3.1，携带由CMV启动子驱动的FLIPQTV3.0传感器10）和mCherry标记的ASCT210的质粒DNA各0.4 mg加入50 ml无血清培养基（OPTI-MEM）中，轻轻混匀。
  4. 将1 ml转染试剂加入50 ml无血清培养基中，室温孵育5分钟。
  5. 将含DNA的溶液（步骤1.3）与含转染试剂的溶液（步骤1.4）混合，孵育20分钟。
  6. 将转染混合液轻轻加至细胞表面，通过轻柔摇晃培养容器混匀。于37 °C、5% CO2、100%湿度条件下孵育24小时。
  7. 24小时后，更换培养基为含10%胎牛血清（CCS）和100单位青霉素/链霉素的DMEM。
  8. 转染后48–72小时对细胞进行成像。

2. 灌注实验

注意：本实验所用的cos7细胞，灌流培养基和培养腔室均保持在室温及常氧CO2浓度条件下。然而，若所用细胞存活需要更高的温度和CO2浓度控制，则应使用加热显微镜载物台和/或环境培养舱。

  1. 准备灌流缓冲液 A-F（参见材料列表）。将活塞接在 50 ml 注射器上，关闭活塞，然后用灌流液填充注射器。短暂打开活塞，使活塞顶部空间充满缓冲液。
  2. 打开 8 通道重力驱动灌流系统及灌流笔，然后在“选择功能”选项下选择“手动模式”。在灌流笔下方放置废液容器。
  3. 通过按相应的数字手动激活各通道，使用装有水的 10 ml 注射器填充管路，然后关闭通道。当所有通道均充满水后，将装有缓冲液 A-F 的注射器安装至灌流系统的通道 1-6，并打开活塞。再次打开各通道，用水替换管路中的缓冲液。流速应约为 0.8 ml/min。
  4. 在灌流控制器上按一次“取消”键，返回“选择功能”菜单。切换至“编辑程序”选项，然后输入 表 1 中所示的灌流程序。保存该灌流程序。
  5. 从培养箱中取出细胞。用灌流缓冲液洗涤两次，然后将细胞置于显微镜载物台上。将灌流系统连接至灌流腔室。若使用开放式腔室，需另设置一个泵以从腔室中移除灌流液。
  6. 打开 Slidebook 软件，新建一张载片。
    注意：以下步骤专用于 Slidebook 软件，但其他软件如 MetaFluor 和 Nis-Element 也可用于此处所述类型的成像。理论上，任何支持时间序列成像的软件均可用于实验，图像序列可在实验后使用 ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）或 Fiji（http://fiji.sc/Fiji）等软件进行分析。然而，支持实时监测受体/供体比值的软件具有显著优势。
  7. 将载片安装至荧光显微镜载物台上。使用适当的滤光片组（参见材料列表），在“聚焦”功能下找到共表达传感器和 ASCT-mCherry 的细胞。点击“相机”选项卡，通过滑动“增益”滑块调节增益。同时，从中性密度滤光片下拉菜单中调节中性密度滤光片设置。注意：若滤光立方体未包含目镜滤光片，请勿使用目镜观察，因为短波长激发光对眼睛有害。应使用计算机屏幕定位细胞。
  8. 采集细胞在 供体 (mTFP1)ex供体(mTFP1)em 、供体(mTFP1)ex受体(venus)em 和 受体(mTFP1)ex受体(venus)em m 通道的图像（滤光片详见材料列表）。点击“图像采集”，在采集窗口中指定将使用的滤光片。点击“测试”按钮，在滤光片设置旁的输入框中键入所需曝光时间以调整曝光时间。注意：三个通道的曝光时间必须相同。调整成像参数时，需考虑预期的 FRET 效率变化及倍数增加：例如，若实验过程中 FRET 效率预计升高 2 倍，则应调整成像参数，使静息状态下 供体ex受体em 通道的强度低于仪器可记录最大值的 <50%，以避免实验过程中信号饱和。标记细胞的信号强度应至少为背景区域信号的三倍。
  9. 使用软件中的区域工具绘制感兴趣区域。或者，可使用软件功能选择高于特定强度的像素，再将其转换为区域。操作方法为：点击“掩膜—分割”，然后移动滑块以高亮显示目标区域。
  10. 在采集类型框中选择“时间间隔”，然后指定实验的时间间隔（本实验为 10 秒）和时间点。
  11. 在无荧光细胞的区域绘制一个区域，用于背景扣除。右键点击所绘制区域，并将其设为背景。注意：理想情况下，应选择不表达传感器的细胞作为背景区域，以同时校正自发荧光和相机检测到的背景荧光。若视野中无此类细胞，至少应选择无细胞区域以校正背景荧光。
  12. 在“选择功能—运行程序”选项下选择所需程序。切换至已保存的程序（见步骤 2.3），然后在灌流控制器上按“回车”键。此时程序已加载，按下任意键即可开始灌流。
  13. 通过同时点击采集窗口中的“开始”按钮和灌流控制器上的任意键，确保灌流与成像实验同步启动。
    注意：建议记录溶液交换的时间点（可通过采集选项卡内的“注释”功能实现）。
  14. 对表达在实验条件下预期处于饱和或未结合状态的传感器的细胞，执行相同的灌流程序。
    注意：此处使用在实验条件下处于饱和状态的 FLIPQTV3.0_1.5μ 作为对照，见 图 6。此类对照实验对于确认 FRET 效率的变化源于底物的真实变化而非其他参数（如细胞内 pH）的变化至关重要。

3. 实验后分析

  1. 检查实验过程中是否发生样品漂移。在时间点为0时采集的图像上绘制感兴趣区域（ROI），然后移动成像窗口顶部的滑动条，观察后续时间点采集的图像中细胞是否移出ROI。
  2. 如果是，请使用追踪功能来校正漂移：首先，选择“Mask – Segment”在细胞周围创建掩膜，然后拖动设定阈值的线条，以高亮显示包含细胞的区域；接着，点击“Mask – Particle tracking – Basic particle tracking”对这些区域进行追踪。
  3. 必要时重新绘制 ROI 和背景区域。
  4. 导出实验过程中各 ROI 的平均强度。点击“统计”–“导出”–“比率/时间序列数据”。
  5. 当无需测定FRET效率或底物浓度的定量分析时，可绘制荧光强度比值随时间变化的曲线供体ex受体em, / 供体ex供体em) 作为底物动态变化的替代指标。为确定胞质浓度，需计算最大和最小比值变化（即， 在底物饱和和缺失的情况下，分别） Δr最大值 - Δr分钟，通过Δratio的非线性回归分析 (Δr) 通过以下公式：
    Δr = [S]/(Kd+[S]) × (Δr最大 - Δr分钟) + Δr分钟
    其中[S]为细胞质中的底物浓度。使用 Δr最大 - Δr分钟 所获得的值，传感器在给定条件下的饱和度（S） Δr 计算公式为
    S = (Δr - Δr分钟) / (Δr最大 - Δr分钟)
    S 还可以通过以下方程转换为底物浓度 [S]：
    S = [S]/(Kd+[S]
    注意：强度的 受体ex受体em 应同时绘制供体通道，以检验实验条件是否直接影响了受体的荧光信号。
  6. 当观察到由于光漂白引起的基线漂移时，应进行基线校正。为此，绘制供体和受体随时间变化的荧光强度曲线（图5A）。然后根据灌注系统的延迟以及特定细胞的转运活性，确定用于基线的时间点。图5B).
  7. 计算一个最能描述基线的多项式拟合，然后将每个时间点的原始强度相对于该基线进行归一化（图5C）。计算强度比（供体ex受体em, / 供体ex供体em) 从归一化的供体和受体强度中。

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结果

典型的时间过程实验以 图2. 在这些实验中，使用了亲和力为 8 mM 的 FRET 谷氨酰胺传感器（FLIPQTV3.0_8m， 图 2A 和 2B）和 100 μM (FlipQTV3.0_100 μ C 以及D)与必需氨基酸转运蛋白ASCT2共表达 18 在 COS7 细胞中 10通过检测供体（mTFP1）与受体（venus）之间荧光强度比值的变化来测定谷氨酰胺的流入图 2A 和 2C）。在存在另一种底物（Ala）的情况下，谷氨酰胺的外流也在这些实验中得到明确证实。使用两种传感器时，归一化的荧光强度呈相反变化即， 供体强度上升时，受体强度下降， 图 2B 和 二维底物存在条件下的实验结果表明，所观察到的比值变化确实源于FRET效率的改变。这些实验显示，在实验条件下，这些细胞内的谷氨酰胺浓度波动非常动态；从检测范围来看 100 μM 将传感...

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讨论

成像实验的成功取决于若干关键因素。其中一个是所用传感器的亲和力，如上所述。然而，通常未知的是目标亚细胞区室中底物的绝对浓度。因此，我们建议尝试具有不同亲和力的多种传感器，以找到在特定实验条件下表现最佳的一种。例如，在本例中，我们将谷氨酰胺传感器（亲和力分别为1.5μ、100μ、2m和8m）转染至cos7细胞中（图3及未展示数据）。

另一个重要因素是传感器蛋白的表达水平。不同实验所需的表达水平各不相同，例如，当需要观测短暂发生的事件（如单个动作电位）时，可能需要更高的表达水平19。因此，在大多数情况下，所需表达水平需通过实验经验确定。如果目标分子在细胞内的浓度极低，则由于目标分子被消耗而对内源性过程造成干扰的问题可能会出现20。因此，若有条件，应采用独立的检测方法来评估这种可能性。在本文所示实验中，由CMV启动子驱动的蛋白表达水平已被证明足够。在必须使用活性较弱的启动子的情况下，可能需要调整以增强信号强度。例如，需在信号强度与曝光过程中发生的光漂白之间取得平衡。除了延长曝光时间外，还可通过...

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致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R21NS064412、美国国家科学基金会（NSF）资助项目1052048以及杰弗里斯纪念信托基金（Jeffress Memorial Trust）资助项目J-908的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
倒置荧光显微镜OlympusIX81F-3-5其他供应商的等效倒置荧光显微镜也可适用。
激发滤光片（mTFP1）Omega Optical3RD450-460带宽 450–460 nm
激发滤光片（Venus）ChromaET500/20带宽 490–510 nm
发射滤光片（mTFP1）ChromaHQ495/30m带宽 475–505 nm
发射滤光片（Venus）ChromaET535/30m带宽 520–550 nm
二向色镜（FRET 通道）Chroma470dcxr长通，截止波长 470 nm
二向色镜（YFP 通道）Chroma89002bs透过 445–490 nm、510–560 nm、590–680 nm
mCherry 滤光片组Chroma49008激发 540–580 nm，长通二向色镜截止波长 585 nm，发射滤光片 595–695 nm
光源OlympusU-LH100L-3-5LED 或卤素光源，可提供稳定的光强，不推荐使用汞灯
CCD 相机QimagingRolera-MGi EMCCD
复消色差荧光物镜Olympus
灌流系统，ValveBank IIAutoMate Scientific[01-08]其他可实现快速溶液更换的灌流系统也可使用
层流室C&L InstrumentsVC-MPC-TW其他层流室也可使用。
腔室载玻片Lab-Tek154534用于开放式腔室实验
灌流泵Thermo Scientific74-046-12131用于开放式腔室实验
支持比率测量的软件Intelligent Imaging InnovationSlidebook 5.5
层流通风生物安全柜ESCOLA-3A2
Isotemp CO2 培养箱Thermo Scientific13-255-25
DMEM 培养基（Dulbecco's MEM）HycloneSH30243.01
胎牛血清HycloneSH3008703
青霉素/链霉素HycloneSV30010
用于转染的无血清培养基（OPTI-MEM I）Invitrogen31985与 Lipofectamine 2000 配合使用
聚-L-赖氨酸溶液SigmaP4707
25 mm 圆形玻璃盖玻片Thermo Scientific12-545-102当使用 VC-MPC-TW 时需要
Lipofectamine 2000Invitrogen11668027其他转染试剂也可使用。
溶液 A（Hank's 缓冲液）9.7 g HANK 盐（Sigma H1387），0.35 g NaHCO3，5.96 g HEPES 定容至 1 L，用 NaOH 调节 pH 至 7.35
溶液 B溶液 A + 0.04 mM 谷氨酰胺（Gln）
溶液 C溶液 A + 0.2 mM 谷氨酰胺（Gln）
溶液 D溶液 A + 1 mM 谷氨酰胺（Gln）
溶液 E溶液 A + 5 mM 谷氨酰胺（Gln）
溶液 F溶液 A + 5 mM 丙氨酸（Ala）

参考文献

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