利用基因编码传感器进行谷氨酰胺通量成像

摘要

本文将演示如何使用FRET在活细胞中监测谷氨酰胺动态。基因编码的传感器可实现对生物分子在亚细胞分辨率下的实时监测。文章将讨论基因编码谷氨酰胺传感器的实验设计、实验条件的技术细节以及实验后分析的注意事项。

摘要

基因编码的传感器能够以亚细胞分辨率实时监测生物分子。在过去15年中，已有大量针对各类生物分子的此类传感器被开发出来，其中一些已成为许多实验室常规使用的不可或缺的工具。

基因编码传感器的一个令人兴奋的应用是利用这些传感器研究细胞转运过程。可以在细胞水平上研究转运蛋白的动力学特性及底物特异性等性质，从而为特定细胞类型的转运活性分析提供可能。本文将以基因编码的谷氨酰胺传感器为例，展示如何观察转运蛋白的动态变化，并讨论实验设计、实验条件的技术细节以及实验后分析的注意事项。

引言

由于能够在细胞水平上检测转录组和蛋白质组的技术取得了显著进展，目前人们已明确，生物化学过程及其导致的代谢物和离子流具有高度的细胞类型特异性。例如，在哺乳动物肝脏中，谷氨酰胺的逐步降解和合成分别由门脉周围细胞和中央静脉周围细胞同时进行，前者将铵离子供给尿素循环，而后者则消耗多余的氨^1-3。在某些情况下，即使在同一“细胞类型”内也能检测到显著的生化异质性^4,5。除了这种空间特异性外，细胞内代谢物和离子的水平也具有高度动态性（例如，Ca²⁺和环核苷酸等信号分子）。代谢物和离子的时空分布模式通常在信号转导中发挥关键作用。然而，监测代谢物和离子的细胞动态变化仍面临独特挑战。在许多情况下，其浓度变化迅速且短暂，典型例子是Ca²⁺信号分子，在树突棘中的衰减时间仅约20毫秒⁶。此外，细胞内及细胞间生化通路的区室化使得利用提取结合色谱/质谱技术来定量代谢物和离子的动态变化变得困难。

由于具有高时空分辨率，可让实验人员研究寿命短暂和/或局限于特定区室的分子动态，因此针对生物分子的遗传编码传感器目前已得到广泛应用（详见文献^7,8综述）。这些遗传编码传感器大致可分为两类：基于强度的传感器和基于比率的传感器。基于强度的传感器通常由一个结合结构域和一个荧光蛋白（FPs）....

方案

1. 样品制备

注意：在许多情况下，灌流实验会冲走大量细胞，这可能成为一个令人困扰的问题。尽管并非所有细胞系都需要，但在盖玻片表面包被多聚-L-赖氨酸（向表面加入 1.0 ml/25 cm² 的 0.01% 溶液，孵育 >5 分钟，用细胞培养级水洗涤两次，并在生物安全柜中干燥）可增强细胞贴附。同时，请注意所用细胞系的生物安全等级（BSL），并遵循当地环境健康与安全办公室批准的标准操作程序。本实验使用了 cos7 细胞，因其内源性谷氨酰胺转运活性较低（见图 4）。

1. 在6孔培养板中放置无菌的25 mm玻璃盖玻片或8孔玻璃底培养皿，接种cos7细胞，细胞融合度约为70–80%，培养基为含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。于37 °C、5% CO₂、100%湿度条件下培养24小时。
2. 根据制造商说明书，将生长培养基更换为含10%胎牛血清但不含抗生素的DMEM。于37 °C、5% CO₂、100%湿度条件下过夜培养。
3. 将编码谷氨酰胺传感器（pcDNA3.1，携带由CMV启动子驱动的FLIPQTV3.0传感器¹⁰）和mCherry标记的ASCT2¹⁰的质粒DNA各0.4 mg加入50 ml无血清培养基（OPTI-MEM）中，轻轻混....

结果

典型的时间过程实验以 图2. 在这些实验中，使用了亲和力为 8 mM 的 FRET 谷氨酰胺传感器（FLIPQTV3.0_8m， 图 2A 和 2B）和 100 μM (FlipQTV3.0_100 μ C 以及D)与必需氨基酸转运蛋白ASCT2共表达 ¹⁸ 在 COS7 细胞中 ¹⁰通过检测供体（mTFP1）与受体（venus）之间荧光强度比值的变化来测定谷氨酰胺的流入图 2A 和 2C）。在存在另一种底物（Ala）的情况下，谷氨酰胺的外流也在这些实验中得到明确证实。使用两种传感器时，归一化的荧光强度呈相反变化即， 供体强度上升时，受体强度下降， 图 2B 和 二维底物存在条件下的实验结果表明，所观察到的比值变化确实源于FRET效率的改变。这些实验显示，在实验条件下，这些细胞内的谷氨酰胺浓度波动非常动态；从检测范围来看 100 μM 将传感.......

讨论

成像实验的成功取决于若干关键因素。其中一个是所用传感器的亲和力，如上所述。然而，通常未知的是目标亚细胞区室中底物的绝对浓度。因此，我们建议尝试具有不同亲和力的多种传感器，以找到在特定实验条件下表现最佳的一种。例如，在本例中，我们将谷氨酰胺传感器（亲和力分别为1.5μ、100μ、2m和8m）转染至cos7细胞中（图3及未展示数据）。

另一个重要因素是传感器蛋白的表达水平。不同实验所需的表达水平各不相同，例如，当需要观测短暂发生的事件（如单个动作电位）时，可能需要更高的表达水平¹⁹。因此，在大多数情况下，所需表达水平需通过实验经验确定。如果目标分子在细胞内的浓度极低，则由于目标分子被消耗而对内源性过程造成干扰的问题可能会出现²⁰。因此，若有条件，应采用独立的检测方法来评估这种可能性。在本文所示实验中，由CMV启动子驱动的蛋白表达水平已被证明足够。在必须使用活性较弱的启动子的情况下，可能需要调整以增强信号强度。例如，需在信号强度与曝光过程中发生的光漂白之间取得平衡。除了延长曝光时间外，还可通过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
倒置荧光显微镜	Olympus	IX81F-3-5	其他供应商的等效倒置荧光显微镜也可适用。
激发滤光片（mTFP1）	Omega Optical	3RD450-460	带宽 450–460 nm
激发滤光片（Venus）	Chroma	ET500/20	带宽 490–510 nm
发射滤光片（mTFP1）	Chroma	HQ495/30m	带宽 475–505 nm
发射滤光片（Venus）	Chroma	ET535/30m	带宽 520–550 nm
二向色镜（FRET 通道）	Chroma	470dcxr	长通，截止波长 470 nm
二向色镜（YFP 通道）	Chroma	89002bs	透过 445–490 nm、510–560 nm、590–680 nm
mCherry 滤光片组	Chroma	49008	激发 540–580 nm，长通二向色镜截止波长 585 nm，发射滤光片 595–695 nm
光源	Olympus	U-LH100L-3-5	LED 或卤素光源，可提供稳定的光强，不推荐使用汞灯
CCD 相机	Qimaging	Rolera-MGi EMCCD
复消色差荧光物镜	Olympus
灌流系统，ValveBank II	AutoMate Scientific	[01-08]	其他可实现快速溶液更换的灌流系统也可使用
层流室	C&L Instruments	VC-MPC-TW	其他层流室也可使用。
腔室载玻片	Lab-Tek	154534	用于开放式腔室实验
灌流泵	Thermo Scientific	74-046-12131	用于开放式腔室实验
支持比率测量的软件	Intelligent Imaging Innovation	Slidebook 5.5
层流通风生物安全柜	ESCO	LA-3A2
Isotemp CO2 培养箱	Thermo Scientific	13-255-25
DMEM 培养基（Dulbecco's MEM）	Hyclone	SH30243.01
胎牛血清	Hyclone	SH3008703
青霉素/链霉素	Hyclone	SV30010
用于转染的无血清培养基（OPTI-MEM I）	Invitrogen	31985	与 Lipofectamine 2000 配合使用
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma	P4707
25 mm 圆形玻璃盖玻片	Thermo Scientific	12-545-102	当使用 VC-MPC-TW 时需要
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	其他转染试剂也可使用。
溶液 A（Hank's 缓冲液）			9.7 g HANK 盐（Sigma H1387），0.35 g NaHCO3，5.96 g HEPES 定容至 1 L，用 NaOH 调节 pH 至 7.35
溶液 B			溶液 A + 0.04 mM 谷氨酰胺（Gln）
溶液 C			溶液 A + 0.2 mM 谷氨酰胺（Gln）
溶液 D			溶液 A + 1 mM 谷氨酰胺（Gln）
溶液 E			溶液 A + 5 mM 谷氨酰胺（Gln）
溶液 F			溶液 A + 5 mM 丙氨酸（Ala）