方法文章

SIVQ-LCM 用于 ArcturusXT 仪器的操作方案

DOI：

10.3791/51662

⸱

2014年7月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SIVQ-LCM 是一种创新性方法，利用计算机算法——空间不变向量量化（Spatially Invariant Vector Quantization, SIVQ）——来驱动激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）过程。SIVQ-LCM 工作流程显著提高了显微切割的速度与准确性，在科研和临床领域均有广泛应用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SIVQ-LCM 是一种新方法，可自动并简化传统的、依赖操作者经验的激光显微切割过程。 其目标是构建一种先进的、可快速定制的激光切割平台技术。在本报告中，我们描述了将图像分析软件“空间不变向量量化”（Spatially Invariant Vector Quantization, SIVQ）集成到 ArcturusXT 仪器上的实现过程。ArcturusXT 系统同时配备红外（IR）和紫外（UV）激光，可实现特定细胞或大面积组织的切割。主要目标是提高激光切割的速度、准确性和可重复性，从而提升样本处理通量。这种创新方法有助于在科研和临床工作流程中对动物和人类组织进行显微切割。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

激光捕获显微切割技术（LCM）最初于20世纪90年代中期开发，可通过显微观察使操作者精确地从组织学切片中捕获特定细胞或细胞区域1,2。许多比较LCM与组织刮取法在分子分析中效果的研究凸显了该方法的价值3-12。此外，目前已有三篇关于该技术的视频实验方案可供观看13,14。然而，尽管该技术已被证实具有重要价值，当目标细胞在异质性组织切片中呈弥散分布，或特定下游应用（如蛋白质组学）需要大量细胞时，LCM操作可能变得繁琐且费力。由于对人工操作者造成的负担，我们开发了一种半自动化的LCM切割方法，通过结合强大的图像分析算法来引导LCM过程15。

本实验室与密歇根大学合作，对先前开发并报道的空间不变向量量化（Spatially invariant vector quantization, SIVQ）算法进行了扩展，使其能够半自动地完成显微切割过程中固有的组织选择步骤，从而为病理学家或生命科学家提供了一种实用工具。空间不变向量量化（SIVQ）是一种算法，用户只需在感兴趣的组织学特征上“点击”，即可生成一个环形向量（谓词图像特征），该向量可用于在整个组织学图像中进行搜索，并根据需要调整统计阈值16-21。生成的热图显示了与初始谓词图像特征匹配的质量，随后被转换为单一颜色（红色）的注释图，可导入激光显微切割（LCM）仪器中。随后使用自动化选择软件AutoScanXT，依据SIVQ生成的注释图绘制切割路径，指导从组织样本中捕获目标细胞。以下详细方案描述了将SIVQ整合到显微切割工作流程中的具体实施步骤。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所述方案的实施遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于使用人体组织样本的规定。

1. 组织制备

  1. 开始前，须根据机构审查委员会（IRB）的规定获取人体组织样本。
  2. 选择组织/细胞块的类型及相应的处理方法［福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）、冷冻或乙醇固定石蜡包埋（EFPE）］。福尔马林固定可提供最佳的组织学效果，其次为乙醇固定和速冻。然而，固定和组织处理方法可能影响后续分子分析中DNA、RNA和蛋白质的数量与质量，应予以考虑。
  3. 将组织/细胞块切片置于所选类型的载玻片（普通玻璃、膜片玻璃或金属框膜片）上。 SIVQ分析在上述三种载玻片上均表现良好。请注意，使用二甲苯和乙醇的伪盖玻片法（如下所述）不能用于金属框膜片载玻片，因为该方法需将载玻片倒置在载物台上。
  4. 选择化学染色或免疫组化（IHC）染色方法，以从背景中识别目标细胞。需注意，染色方法也可能影响组织中DNA、RNA和蛋白质的质量与数量。在继续实验方案前，应对染色后的组织进行检测，以评估生物分子的基线质量。SIVQ-LCM已成功应用于经以下染色的组织/细胞学切片：使用DAB15的免疫组化（IHC）、免疫荧光、快红、de novo 红、甲苯胺蓝以及苏木精-伊红（H&E）染色（未发表数据）。

2. 标本成像

  1. 将载玻片装载到显微切割仪器的电动载物台上，并启动相关软件。勾选复选框以指定已装载载玻片的位置，并确保捕获的图像文件以jpeg格式保存。
  2. 通过手动调焦旋钮或解剖仪器的软件调节屏幕图像的亮度和焦距，以优化图像质量。
    1. 使用解剖仪器软件中的图像工具箱，适当设置光源亮度和相机增益。示例参数为：亮度 = 60，增益 = 220（使用漫射器时）。
    2. 使用手动方式或软件中的自动对焦功能进行对焦。
  3. 拍摄载玻片的缩略概览图像，以提供解剖过程的路线图。
    1. 为获得未加盖玻片载玻片的最佳成像质量，可使用仪器聚光镜下方的散光片，或添加少量（约30 μl）乙醇或二甲苯以改善折射率（伪盖玻片法）。使用二甲苯时需注意其具有毒性，必须采取适当的安全防护措施，包括在通风橱中操作，并穿戴防护实验服、护目镜和手套。
    2. 做 不 将LCM帽置于载玻片上，直至乙醇或二甲苯溶液完全透明，否则帽上的聚合物会发生变形。
  4. 移动载玻片，并在10X、20X或40X放大倍数下拍摄待解剖区域的图像。如有必要，可使用软件（如 Microsoft Office Picture Manager 中的 AutoCorrect）对图像进行增强，方法如前所述22. 图像必须以 jpeg 格式保存，以便重新导入自动筛选软件。

3. 图像的算法分析

  1. 将显微切割仪器捕获的图像转移至 SIVQ 文件夹。 在连接切割仪器的计算机上安装并打开 ArcturusXT、AutoScan 和 SIVQ 软件包。如需获取 SIVQ 软件，请联系 Ulysses Balis 博士（ulysses@med.umich.edu）。
  2. 打开 SIVQ 并加载感兴趣的捕获图像（jpeg 格式）。
  3. 导航至目标区域和/或调整显示窗口（Viewport 5 & 6）的大小。 在 SIVQ 软件中，Viewport 5 显示预处理图像，Viewport 6 显示后处理图像16。
  4. 选择将要使用的环向量大小和环的数量。
  5. 在 Viewport 6 中右键单击以选择要捕获的谓词图像特征。
  6. 点击“scan”以分析图像。
  7. 使用两个滑动条调整图像匹配的统计概率。 上方滑动条用于调节整体向量特异性，可在初始扫描中排除可能包含过多区域的部分（灵敏度由所选的“Stat”变量定义）。 相反，下方滑动条用于在完成扫描后提高灵敏度，以增加被分类为匹配的区域。 这两个滑动条均以“Stat”变量作为初始基准灵敏度阈值。
  8. 点击“save as jpeg”保存图像（图像现保存于 c:/vq_test 文件夹/pics 中）。
  9. 使用算法分析图像。算法分析的输出必须生成一幅带注释的图像，方可用于 SIVQ-LCM。目前，SIVQ 核心引擎的当前版本正处于测试阶段的 beta 版本，预计完整生产版本（2014 年第一季度发布）将集成完整的软件开发工具包（SDK）和应用程序编程接口（API），以便简化用户生成的空间滤波器及下游工作流程数据处理步骤与核心环匹配引擎的整合。 该 SDK 将附带一套完整的文档。
    1. 确保 SIVQ 热图变为均匀的红色。
  10. 导出图像。必须使用十六进制编辑器将原始切割仪器图像的文件头中的位置坐标重新嵌入到分析后的 jpeg 图像中。 相关数据位于“图像开始”标记（0xFF, 0xD8）与第一个“定义量化表”标记（0xFF, 0xDB）之间。

4. 显微解剖

  1. 将LCM帽置于感兴趣区域的中心位置，该区域即为SIVQ分析时采集图像的位置。
  2. 校准并进行紫外/红外（UV/IR）激光的质量控制（QC），优化各项参数，包括激光功率、作用时间、激光位置以及紫外切割速度（按照制造商建议进行）。在重新导入分析图像之前完成这些校准步骤。 
  3. 打开AutoScanXT（自动选择软件），并从c:/vq_test文件夹/pics中导入已分析的图像。
  4. 训练自动选择软件以识别SIVQ标注，并生成切割图谱。
    1. 为创建训练文件，在SIVQ分析图像的“红色标记区域”上选择四个感兴趣区域（以“蓝色圆圈”标示）。
    2. 选择不需要切割的背景区域（以“红色方框”标示）。
    3. 点击“Analyze”按钮生成训练文件，该文件可保存以供后续使用。 
  5. 使用适当的红外（IR）和/或紫外（UV）激光进行显微切割。
    1. 将选定区域复制到“实时”图像上。
    2. 在“microdissect”工具箱中，选择相应的IR捕获或UV切割按钮。
  6. 切割完成后，将LCM帽移至质控（QC）站，并拍摄切割后组织/细胞的图像。另一种方法是在将LCM帽移至QC站前，先将其放置在玻片的空白区域，以便用户可在不同放大倍数下拍摄图像。
  7. 显微切割后，对目标组织区域拍摄图像，以进一步评估捕获效率。
  8. 若目标细胞已成功切割，点击ArcturusXT软件中的"present stage"按钮，取下LCM帽，启动下游分析所需的分子提取程序。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

采用标准IHC方案23对一张FFPE人乳腺组织切片进行细胞角蛋白AE1/AE3的免疫染色。染色完成后，将组织玻片置于ArcturusXT显微切割仪载物台上，并按前述方法启动SIVQ-LCM流程。由于组织在显微切割过程中无法加盖盖玻片，IHC染色阳性的细胞在视觉上可能难以分辨（图1A）。因此，为改善折射率匹配并获得更清晰的图像，向组织切片滴加二甲苯，以形成伪盖玻片效果15（图1B）。随后，采集该伪盖玻片处理区域的jpeg图像，并导入SIVQ系统进行算法分析。用户选定一个谓词图像特征（深棕色DAB染色）后，SIVQ算法即开始分析图像（图1C）。SIVQ生成的热图随后被转换为“红色标记”，该标记可被自动选择软件识别（图1D）。待二甲苯完全挥发后，将SIVQ热图导入自动选择软件（图1E），并使用红外激光对高亮显示的细胞进行显微切割。随后将显微切割帽转移至ArcturusXT仪器的质控（QC）站点，进行肉眼检查以评估切割效率（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种将SIVQ-LCM应用于从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人乳腺组织切片中显微切割免疫染色上皮细胞的实验方案。采用SIVQ等图像分析算法，可显著减少显微切割过程中的手动操作时间。这一进展对该领域可能具有重要意义，因为操作人员的时间和精力通常是精确分离目标细胞过程中的限速步骤。在本方案中，我们特别将该方法适配于ArcturusXT仪器，但SIVQ及其他类似算法也可能适用于其他市售的显微切割设备。除了提高操作效率外，这种新方法还可使非组织病理学专业人员也能完成显微切割操作。最后，通过算法驱动显微切割过程，可消除操作者在识别目标细胞时的主观性，从而提升不同实验场所之间结果的可重复性。

尽管SIVQ对包括组织学在内的多种图像类型具有广泛的适应性，但必须认识到，它并非旨在作为通用的图像处理/分割工具，而是一种高效的初步前景选择工具。在此用途下，SIVQ在预测某一类图像内容是否适用于数值化分割方法方面具有很高的实用价值。当SIVQ取得成功时，能够高度预测以下两种情况之一：a）更精细、更有针对性的图像分析/分割方法将非常成功，和/或 b）经过优化、由机器选定的SIVQ向量将能有效...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Michael R. Emmert-Buck 是美国国立卫生研究院（NIH）持有专利的激光显微切割技术的发明人之一，并通过 NIH 技术转化项目获得基于专利使用费的付款。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究部分由美国国立卫生研究院、国家癌症研究所癌症研究中心的院内研究计划资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带正电荷的玻片Thermo Scientific4951Plus-001
二甲苯，ACS 级试剂，≥98.5% 二甲苯 + 乙苯含量 Sigma Aldrich247642注意：请遵循适当的安全操作规程。
乙醇，U.S.P. 200 证明，无水The Warner-Graham Company6.505E+12注意：请遵循适当的安全操作规程。
Arcturus CapSure Macro LCM 盖帽Life TechnologiesLCM0211
ArcturusXT 激光显微切割仪Life TechnologiesARCTURUSXT
AutoScanXT 软件Life TechnologiesArcturusXT 激光显微切割设备的可选图像分析程序。SIVQ-LCM 需要使用该软件。
空间不变向量量化（SIVQ）密歇根大学该工具套件可公开用于学术合作。如需获取 SIVQ 算法，请联系 Ulysses Balis 博士 [Ulysses@med.umich.edu]

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  3. Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
  4. El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
  5. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
  6. Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
  7. Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
  8. Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
  9. Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
  10. Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48(2011).
  11. Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13(2009).
  12. Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711(2013).
  13. Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
  14. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
  15. Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19(2011).
  16. Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13(2011).
  17. Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
  18. Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
  19. Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
  20. Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37(2011).
  21. Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
  22. Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
  23. Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

JPEG

相关文章