SIVQ-LCM 是一种创新性方法，利用计算机算法——空间不变向量量化（Spatially Invariant Vector Quantization, SIVQ）——来驱动激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）过程。SIVQ-LCM 工作流程显著提高了显微切割的速度与准确性，在科研和临床领域均有广泛应用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
SIVQ-LCM 用于 ArcturusXT 仪器的操作方案
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
SIVQ-LCM 是一种新方法，可自动并简化传统的、依赖操作者经验的激光显微切割过程。 其目标是构建一种先进的、可快速定制的激光切割平台技术。在本报告中，我们描述了将图像分析软件“空间不变向量量化”（Spatially Invariant Vector Quantization, SIVQ）集成到 ArcturusXT 仪器上的实现过程。ArcturusXT 系统同时配备红外（IR）和紫外（UV）激光，可实现特定细胞或大面积组织的切割。主要目标是提高激光切割的速度、准确性和可重复性，从而提升样本处理通量。这种创新方法有助于在科研和临床工作流程中对动物和人类组织进行显微切割。
引言
激光捕获显微切割技术（LCM）最初于20世纪90年代中期开发，可通过显微观察使操作者精确地从组织学切片中捕获特定细胞或细胞区域1,2。许多比较LCM与组织刮取法在分子分析中效果的研究凸显了该方法的价值3-12。此外，目前已有三篇关于该技术的视频实验方案可供观看13,14。然而，尽管该技术已被证实具有重要价值，当目标细胞在异质性组织切片中呈弥散分布，或特定下游应用（如蛋白质组学）需要大量细胞时，LCM操作可能变得繁琐且费力。由于对人工操作者造成的负担，我们开发了一种半自动化的LCM切割方法，通过结合强大的图像分析算法来引导LCM过程15。
本实验室与密歇根大学合作，对先前开发并报道的空间不变向量量化（Spatially invariant vector quantization, SIVQ）算法进行了扩展，使其能够半自动地完成显微切割过程中固有的组织选择步骤，从而为病理学家或生命科学家提供了一种实用工具。空间不变向量量化（SIVQ）是一种算法，用户只需在感兴趣的组织学特征上“点击”，即可生成一个环形向量（谓词图像特征），该向量可用于在整个组织学图像中进行搜索，并根据需要调整统计阈值16-21。生成的热图显示了与初始谓词图像特征匹配的质量，随后被转换为单一颜色（红色）的注释图，可导入激....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所述方案的实施遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于使用人体组织样本的规定。
1. 组织制备
- 开始前，须根据机构审查委员会（IRB）的规定获取人体组织样本。
- 选择组织/细胞块的类型及相应的处理方法［福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）、冷冻或乙醇固定石蜡包埋（EFPE）］。福尔马林固定可提供最佳的组织学效果，其次为乙醇固定和速冻。然而，固定和组织处理方法可能影响后续分子分析中DNA、RNA和蛋白质的数量与质量，应予以考虑。
- 将组织/细胞块切片置于所选类型的载玻片（普通玻璃、膜片玻璃或金属框膜片）上。 SIVQ分析在上述三种载玻片上均表现良好。请注意，使用二甲苯和乙醇的伪盖玻片法（如下所述）不能用于金属框膜片载玻片，因为该方法需将载玻片倒置在载物台上。
- 选择化学染色或免疫组化（IHC）染色方法，以从背景中识别目标细胞。需注意，染色方法也可能影响组织中DNA、RNA和蛋白质的质量与数量。在继续实验方案前，应对染色后的组织进行检测，以评估生物分子的基线质量。SIVQ-LCM已成功应用于经以下染色的组织/细胞学切片：使用DAB15的免疫组化（IHC）、免疫荧光、快红、de novo 红、甲苯胺蓝以及苏木精-伊红（H&E）染色（未发表数据）。
2. 标本成像
- ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
采用标准免疫组化（IHC）方案23对一张福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人乳腺组织切片进行细胞角蛋白AE1/AE3染色。染色完成后，将组织切片置于ArcturusXT显微切割仪载物台上，并按前述方法启动SIVQ-LCM流程。由于组织在显微切割过程中无法加盖盖玻片，免疫组化染色阳性的细胞在视觉上可能难以分辨（图1A）。因此，为改善折射率匹配并获得更清晰的图像，向组织切片滴加二甲苯，以形成伪盖玻片效果15（图1B）。随后，采集伪盖玻片处理区域的jpeg图像，并导入SIVQ系统进行算法分析。用户选定的目标图像特征（深棕色DAB染色）触发SIVQ算法对图像进行分析（图1C）。SIVQ生成的热图随后被转换为“红色标记”，该标记可被自动选择软件识别（图1D）。待二甲苯完全挥发后，将SIVQ热图导入自动选择软件（图1E），并使用红外激光对高亮显示的细胞进行切割。随后将显微切割帽转移至ArcturusXT仪器的质控（QC）站点，进行肉眼检查.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种将SIVQ-LCM应用于从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人乳腺组织切片中显微切割免疫染色上皮细胞的实验方案。采用SIVQ等图像分析算法，可显著减少显微切割过程中的手动操作时间。这一进展对该领域可能具有重要意义，因为操作人员的时间和精力通常是精确分离目标细胞过程中的限速步骤。在本方案中，我们特别将该方法适配于ArcturusXT仪器，但SIVQ及其他类似算法也可能适用于其他市售的显微切割设备。除了提高操作效率外，这种新方法还可使非组织病理学专业人员也能完成显微切割操作。最后，通过算法驱动显微切割过程，可消除操作者在识别目标细胞时的主观性，从而提升不同实验场所之间结果的可重复性。
尽管SIVQ对包括组织学在内的多种图像类型具有广泛的适应性，但必须认识到，它并非旨在作为通用的图像处理/分割工具，而是一种高效的初步前景选择工具。在此用途下，SIVQ在预测某一类图像内容是否适用于数值化分割方法方面具有很高的实用价值。当SIVQ取得成功时，能够高度预测以下两种情况之一：a）更精细、更有针对性的图像分析/分割方法将非常成功，和/或 b）经过优化、由机器选定的SIVQ向量将能有效.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
Michael R. Emmert-Buck 是美国国立卫生研究院（NIH）持有专利的激光显微切割技术的发明人之一，并通过 NIH 技术转化项目获得基于专利使用费的付款。
致谢
本研究部分由美国国立卫生研究院、国家癌症研究所癌症研究中心的院内研究计划资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带正电荷的玻片 | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| 二甲苯，ACS 级试剂，≥98.5% 二甲苯 + 乙苯含量 | Sigma Aldrich | 247642 | 注意：请遵循适当的安全操作规程。 |
| 乙醇，U.S.P. 200 证明，无水 | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | 注意：请遵循适当的安全操作规程。 |
| Arcturus CapSure Macro LCM 盖帽 | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT 激光显微切割仪 | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT 软件 | Life Technologies | ArcturusXT 激光显微切割设备的可选图像分析程序。SIVQ-LCM 需要使用该软件。 | |
| 空间不变向量量化（SIVQ） | 密歇根大学 | 该工具套件可公开用于学术合作。如需获取 SIVQ 算法，请联系 Ulysses Balis 博士 [Ulysses@med.umich.edu] |
参考文献
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Edwards, R. A.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
