将基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱（MS）技术直接应用于血培养增菌液，可加快细菌的鉴定速度。本方法是一种直接从血培养增菌液中快速、可靠地鉴定革兰氏阴性细菌的方法。
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摘要
摘要
临床微生物学实验室的一项重要职责是快速鉴定引起血流感染的细菌。传统的鉴定方法需要对发出信号的血培养液进行亚培养，只有在固体琼脂平板上的菌落成熟后才能获得鉴定结果。当应用于固体培养基上的菌落时，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种可靠且快速的方法，可用于鉴定大多数临床相关细菌。将MALDI-TOF MS直接应用于血培养液是一种具有吸引力的方法，因其有望加速细菌的种属鉴定并改善临床管理。然而，一个需要克服的重要问题是分析前必须去除血培养标本中干扰性的树脂、蛋白质和血红蛋白 ，如果不去除这些物质，它们会干扰质谱信号，导致鉴定结果不充分或分辨得分偏低。此外，还需对细菌进行浓缩，以获得足够质量的质谱图。本方法描述了革兰阴性菌的浓缩、纯化和提取过程，从而实现从发出信号的血培养液中对细菌进行早期鉴定。
引言
由细菌引起的血流感染（BSI）患者院内死亡率仍然较高，范围在6%至48%之间1。及时给予适当的初始经验性抗生素治疗有助于提高生存率；对于重症脓毒症患者亚组，每延迟一小时给予恰当治疗，生存率即随之下降2,3。因此，临床实验室的关键目标之一是快速检测、鉴定并报告血培养中的细菌存在情况，以支持临床决策。已有研究表明，微生物学实验室在报告革兰染色结果时对抗菌治疗的影响最大4；最近一项观察性研究显示，直接对血培养增菌液进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析 (MALDI-TOF MS)，可影响超过三分之一由革兰阴性菌引起的BSI患者的处方用药5。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的商业化发展已使其成为一种高效用于微生物鉴定的实验室工具6,7。该技术现已成熟，并已被许多实验室采用，用于快速、准确地鉴定在固体培养基上分离出的微生物6,8。将MALDI-TOF MS直接应用于已发出“阳性”信号的血培养（BC）培养液，因其能够在低成本条件下更早地获得微生物鉴定结果，而受到临床医生和实验室管理人员的广泛关注。
与基于标准表型培养的鉴定方法相比，将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）直接应用于血培养增菌液的临床实用性受到限制，其观察到的灵敏度范围较....
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方案
1. 血液培养液提示“阳性”
- 从连续监测培养箱中取出已报警的血培养瓶，并将其放入生物安全柜中。注意：培养瓶可能含有危险微生物，需遵循通用预防措施。由于取样过程中存在产生感染性气溶胶的风险，所有取样操作必须在二级生物安全水平的层流生物安全柜中进行。
2. 革兰染色的制备
- 根据当地机构的规程，从报阳的血培养肉汤中制备革兰染色涂片。注意：当显微镜下鉴定为革兰阴性微生物时，按以下方法处理血培养肉汤；当鉴定为革兰阳性微生物时，则采用另一种针对基因鉴定和耐药标记的分子检测方法处理肉汤（本文未涉及该方法）13。
3. 将有标记的血培养肉汤转移至血清分离管
- 轻轻混匀血培养瓶，倒置2-3次。
- 在生物安全柜内，将一个10 ml 的注射器连接到安全血液转移装置上。
- 将血液转移装置连接至血培养瓶，并抽取5 ml 培养液至注射器中。将抽吸出的血培养液转移至血清分离管中。
4. 血培养肉汤的浓缩
- 将血清分离管在1,250 × g条件下离心15分钟 ，以去除大量红细胞。
- 使用无菌移液管小心吸除并弃去上清液，注意保留约1 ml 位于....
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结果
将生成的MALDI-TOF质谱图与集成的参考数据库谱图进行比对。根据待测菌株与数据库中参考菌株谱图匹配的置信度，赋予一个对数评分，建议评分≥1.7时可进行属水平的可靠鉴定（图1），评分≥2.0时可进行种水平的可靠鉴定（图2）。当评分≥1.7且分型软件匹配出的前5个鉴定结果一致时，可报告至种水平（图1）12。图3展示了混合菌种血培养液的分析结果，本例中为Escherichia coli和Serratia marcescens。请注意，前5个匹配谱图结果不一致。已有研究证实，该方法仅能在约30%的混合培养物中检出混合菌属12。需注意的是，在混合培养物中，仍有可能获得单一菌种的鉴定结果且置信度评分较高。表1总结了该方法验证研究中已发表的结果，其中91.8%的单菌培养物MALDI-TOF评分>1.7，属水平和种水平的符合率分别为100%和97.0%12。
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讨论
在将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）应用于血培养肉汤时，离心后的操作步骤必须足够谨慎，以避免已分离的组分重新混合。尤其重要的是去除血培养成分及人体细胞蛋白（包括血红蛋白），因为这些物质可能产生干扰MALDI-TOF质谱图的尖峰信号。
尽管质谱（MS）制造商推荐种水平鉴定的阈值分数≥2.0、属水平鉴定的阈值分数≥1.7，但其他研究报道指出，当应用于血培养增菌肉汤（BC broth）时，可采用较低的对数分数阈值（范围为≥1.4至≥1.6）10,12,14-18。临床微生物学实验室仅可在完成适当的本地法规要求和验证程序后，方可考虑采用较低的质谱鉴定分数。
此方法偶尔会产生质量较差的质谱图，这些质谱图可能无法匹配，或仅以较低的可信度得分被报告。对每个分离株进行双份或三份点样，可在某个单一点样失败时减少重复实验带来的不便。极少数情况下，所有重复点样的样本均无法获得足够高的鉴定得分。鉴定效果不佳的原因可能在于数据库不完整，但更常见的原因是血培养液中细菌的初始浓度较低。在本方法已发表的验证数.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BACTEC Plus 需氧/富营养培养基 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 厌氧/富营养培养基 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus 培养基 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer - 血液转移装置 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | 一次性采样装置，可降低针刺伤风险 |
| Vacutainer SST 5.0 ml，Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | 血清分离管 |
| 10 ml 注射器 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| 移液管 | Samco, USA | 222-20S | |
| 移液管（细尖） | Samco, USA | 232-20S | |
| 微量离心管（2.0 ml） | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| 无菌水（无 DNA酶 和 RNA酶） | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| 基质溶液 | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸，50% 乙腈，2.5% 三氟乙酸 |
| 台式 microflex LT MALDI-TOF 质谱仪 | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 使用 BioTyper 3.1 (Build 65) 和 FlexControl 3.3 (Build 99) 软件 |
参考文献
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream....
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