将基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱（MS）技术直接应用于血培养增菌液，可加快细菌的鉴定速度。本方法是一种直接从血培养增菌液中快速、可靠地鉴定革兰氏阴性细菌的方法。
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摘要
摘要
临床微生物学实验室的一项重要职责是快速鉴定引起血流感染的细菌。传统的鉴定方法需要对发出信号的血培养液进行亚培养，只有在固体琼脂平板上的菌落成熟后才能获得鉴定结果。当应用于固体培养基上的菌落时，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种可靠且快速的方法，可用于鉴定大多数临床相关细菌。将MALDI-TOF MS直接应用于血培养液是一种具有吸引力的方法，因其有望加速细菌的种属鉴定并改善临床管理。然而，一个需要克服的重要问题是分析前必须去除血培养标本中干扰性的树脂、蛋白质和血红蛋白 ，如果不去除这些物质，它们会干扰质谱信号，导致鉴定结果不充分或分辨得分偏低。此外，还需对细菌进行浓缩，以获得足够质量的质谱图。本方法描述了革兰阴性菌的浓缩、纯化和提取过程，从而实现从发出信号的血培养液中对细菌进行早期鉴定。
引言
由细菌引起的血流感染（BSI）患者院内死亡率仍然较高，范围在6%至48%之间1。及时给予适当的初始经验性抗生素治疗有助于提高生存率；对于重症脓毒症患者亚组，每延迟一小时给予恰当治疗，生存率即随之下降2,3。因此，临床实验室的关键目标之一是快速检测、鉴定并报告血培养中的细菌存在情况，以支持临床决策。已有研究表明，微生物学实验室在报告革兰染色结果时对抗菌治疗的影响最大4；最近一项观察性研究显示，直接对血培养增菌液进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析 (MALDI-TOF MS)，可影响超过三分之一由革兰阴性菌引起的BSI患者的处方用药5。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的商业化发展已使其成为一种高效用于微生物鉴定的实验室工具6,7。该技术现已成熟，并已被许多实验室采用，用于快速、准确地鉴定在固体培养基上分离出的微生物6,8。将MALDI-TOF MS直接应用于已发出“阳性”信号的血培养（BC）培养液，因其能够在低成本条件下更早地获得微生物鉴定结果，而受到临床医生和实验室管理人员的广泛关注。
与基于标准表型培养的鉴定方法相比，将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）直接应用于血培养增菌液的临床实用性受到限制，其观察到的灵敏度范围较广，关于革兰阴性菌成功鉴定的报道范围为47%至98.9%9-11。灵敏度的差异可能与血培养增菌液的成分、初始细菌浓度、样本处理方法的差异以及研究人群中遇到的多种革兰阴性微生物有关9。与其他已发表的方案相比，本文所述方法避免使用乙醇、氯化铵或额外的（非基质）乙腈。因此，细菌沉淀物将保持活性（直至蛋白质提取步骤），从而允许对增菌液中的这些微生物直接进行潜在的表型药敏试验。此外，该方法已被证明成本低、可靠且快速，可在血培养革兰染色结果出具后25分钟内完成细菌鉴定，且所需人工操作时间极少12。
本方法是一种简单的实验室自制离心裂解方案，通过将甲酸直接提取法应用于阳性血培养液，以MALDI-TOF MS技术鉴定革兰氏阴性细菌。
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方案
1. 血液培养液提示“阳性”
- 从连续监测培养箱中取出已报警的血培养瓶，并将其放入生物安全柜中。注意：培养瓶可能含有危险微生物，需遵循通用预防措施。由于取样过程中存在产生感染性气溶胶的风险，所有取样操作必须在二级生物安全水平的层流生物安全柜中进行。
2. 革兰染色的制备
- 根据当地机构的规程，从报阳的血培养肉汤中制备革兰染色涂片。注意：当显微镜下鉴定为革兰阴性微生物时，按以下方法处理血培养肉汤；当鉴定为革兰阳性微生物时，则采用另一种针对基因鉴定和耐药标记的分子检测方法处理肉汤（本文未涉及该方法）13。
3. 将有标记的血培养肉汤转移至血清分离管
- 轻轻混匀血培养瓶，倒置2-3次。
- 在生物安全柜内，将一个10 ml 的注射器连接到安全血液转移装置上。
- 将血液转移装置连接至血培养瓶，并抽取5 ml 培养液至注射器中。将抽吸出的血培养液转移至血清分离管中。
4. 血培养肉汤的浓缩
- 将血清分离管在1,250 × g条件下离心15分钟 ，以去除大量红细胞。
- 使用无菌移液管小心吸除并弃去上清液，注意保留约1 ml 位于凝胶/液体界面正上方的白膜层。注意：需氧瓶中可见红细胞清晰地沉降至管底，凝胶/液体界面呈不透明的白色。相比之下，当应用于裂解型厌氧血培养肉汤时，由于裂解的红细胞成分仍悬浮于上清液中，凝胶/液体界面呈现深红色。
5. 重复离心洗涤步骤
- 用无菌移液管轻轻混匀凝胶界面以上最后1 ml 的血沉棕黄层液体，然后将全部液体转移至一个1.5 ml 微量离心管中。将新管在288 × g下离心30秒。
- 使用一次性塑料1 ml 转移移液管将上清液转移至新的1.5 ml 微量离心管中，并丢弃含有沉淀物的管。注意：此步骤中必须小心操作，避免转移沉淀物。对于从厌氧血培养瓶处理的标本而言，这一点尤为重要，因为上清液仍带有色素，沉淀物并不总是清晰可见。
6. 残余细胞的裂解
- 将样本在 18,407 × g 离心 1 分钟 ，然后使用细尖移液管吸除（并弃去）上清液，尽可能留下少量残留液体，同时不破坏沉淀。
- 用 1 ml 无菌、无 DNA 酶和 RNA 酶的水通过反复吹打重悬残留沉淀。注意：一些研究者描述可使用醇溶液代替无菌水重悬沉淀，此操作会使细菌失去活性。
- 将重悬后的溶液在 18,407 × g 离心 1 分钟。
7. 细菌蛋白质的提取
- 使用细尖移液器吸出并弃去上清液，再次吸出时应确保尽可能去除所有液体。
- 将沉淀重悬于 10 µl 甲酸（70% v/v）中。注意：甲酸若被吸入或接触皮肤，可能对人体造成影响。在配制或操作该溶液时，建议工作人员除个人防护装备外，还应在通风橱中进行操作。
- 使用移液器充分混匀，以确保形成均一的重悬液。必要时可用移液器吸头物理性地搅动沉淀，以获得更均一的溶液。
8. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱靶板的制备
- 取2 µl 制备好的菌悬液，接种至洁净的MALDI-TOF靶板上的每个靶点。每个样本准备3个靶点，以避免偶尔出现读数失败的问题。
- 让MALDI-TOF靶板自然干燥。可将靶板置于通风橱边缘以增加空气流通，从而加快干燥速度。
- 每个干燥后的靶点上覆盖1 µl 基质溶液（10 mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA），50%乙腈，2.5%三氟乙酸）。注意：基质溶液若被吸入或接触皮肤，可能对人体造成影响。配制或操作该溶液时，建议工作人员除使用个人防护装备外，还应在通风柜内操作。
- 按照上述方法，将MALDI-TOF靶板置于通风橱边缘使其干燥。确保靶板上每个靶点的样品分布均匀。
9. 将MALDI-TOF靶板放入质谱仪
- 将MALDI-TOF靶板插入MALDI-TOF质谱仪中，确保靶板与弹簧加载的固定板完全贴合。注意：必须待所有靶点完全干燥后，方可插入靶板。
- 确保橡胶密封圈上无绒毛、灰尘或毛发，以保证能够形成所需的真空环境。
- 关闭MALDI-TOF仪器的样品台盖，然后按下仪器前面的“in/out”按钮。此时盖子将自动锁定，并开始建立必要的真空条件。
10. MALDI-TOF 质谱图采集
- 打开 MALDI Biotyping 和 FlexControl 软件。
- 在分型软件中，从标题为“file”的下拉菜单中选择“new classification”。命名项目后，选择“new”，然后点击“Next”以完成分型软件中的设置。
- 在控制软件窗口中，找到屏幕上的靶板图示。按住鼠标左键并移动光标至已接种的靶点位置，以高亮显示正在使用的 MALDI-TOF 靶点。
- 使用鼠标右键点击所选靶点位置的任意区域，然后从下拉菜单中选择“add Analytes”。
- 将血培养鉴定信息添加到每个靶点对应的“ID”列中，完成后点击“next”。
- 选择商用的“taxonomy”谱图数据库，然后点击“next”。注意：实验室可使用额外的内部或商用数据库，以增加参考谱图的数量。
- 点击“finish”，MALDI-TOF 质谱仪将开始生成谱图。注意：MALDI-TOF 的设置按照制造商推荐参数进行（线性正离子模式，60 Hz 激光频率，20 kV 加速电压，16.7 kV IS2 电压，170 nsec 提取延迟，质荷比范围为 2,000–20,137 m/z）。
- 如果 MALDI Control 软件未能生成峰图，可手动采集谱图（本方法未作描述）。
11. 分析后处理 MALDI-TOF MS 评分的解读
- 获得质谱并完成分析后，在分型软件上选择“物种鉴定”旁边的“+”按钮，以展开每个目标的鉴定列表。
- 查看前5个鉴定结果，注意前5个结果是否一致。若同一目标点的前5个属级鉴定结果不一致且得分均≥1.7，则提示可能存在混合培养物。注意：MALDI-TOF技术对混合培养物的检测灵敏度较差。例如，当培养液中含有多种微生物时，可能仅对其中一种微生物给出高置信度得分。
- 当某目标点的最高匹配得分≥2.0时，报告该种名。
- 当某目标点的最高得分≥1.7但<2.0时，仅报告属名。若前5个鉴定结果的其他标准也一致，则可报告至种水平。
12. 移除 MALDI-TOF 目标板
- 当所有质谱采集完成后，按下 MALDI-TOF 仪器上的“in/out”按钮。
- 打开 MALDI-TOF 靶板插槽，取出 MALDI-TOF 靶板。
- 若使用可重复使用的 MALDI-TOF 靶板，需用酒精清洁所有靶点，并在靶板清洁干燥后于室温保存。
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结果
将生成的MALDI-TOF质谱图与集成的参考数据库谱图进行比对。根据待测菌株与数据库中参考菌株谱图匹配的置信度，赋予一个对数评分，建议评分≥1.7时可进行属水平的可靠鉴定（图1），评分≥2.0时可进行种水平的可靠鉴定（图2）。当评分≥1.7且分型软件匹配出的前5个鉴定结果一致时，可报告至种水平（图1）12。图3展示了混合菌种血培养液的分析结果，本例中为Escherichia coli和Serratia marcescens。请注意，前5个匹配谱图结果不一致。已有研究证实，该方法仅能在约30%的混合培养物中检出混合菌属12。需注意的是，在混合培养物中，仍有可能获得单一菌种的鉴定结果且置信度评分较高。表1总结了该方法验证研究中已发表的结果，其中91.8%的单菌培养物MALDI-TOF评分>1.7，属水平和种水平的符合率分别为100%和97.0%12。
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讨论
在将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）应用于血培养肉汤时，离心后的操作步骤必须足够谨慎，以避免已分离的组分重新混合。尤其重要的是去除血培养成分及人体细胞蛋白（包括血红蛋白），因为这些物质可能产生干扰MALDI-TOF质谱图的尖峰信号。
尽管质谱（MS）制造商推荐种水平鉴定的阈值分数≥2.0、属水平鉴定的阈值分数≥1.7，但其他研究报道指出，当应用于血培养增菌肉汤（BC broth）时，可采用较低的对数分数阈值（范围为≥1.4至≥1.6）10,12,14-18。临床微生物学实验室仅可在完成适当的本地法规要求和验证程序后，方可考虑采用较低的质谱鉴定分数。
此方法偶尔会产生质量较差的质谱图，这些质谱图可能无法匹配，或仅以较低的可信度得分被报告。对每个分离株进行双份或三份点样，可在某个单一点样失败时减少重复实验带来的不便。极少数情况下，所有重复点样的样本均无法获得足够高的鉴定得分。鉴定效果不佳的原因可能在于数据库不完整，但更常见的原因是血培养液中细菌的初始浓度较低。在本方法已发表的验证数...
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BACTEC Plus 需氧/富营养培养基 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 厌氧/富营养培养基 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus 培养基 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer - 血液转移装置 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | 一次性采样装置，可降低针刺伤风险 |
| Vacutainer SST 5.0 ml，Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | 血清分离管 |
| 10 ml 注射器 | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| 移液管 | Samco, USA | 222-20S | |
| 移液管（细尖） | Samco, USA | 232-20S | |
| 微量离心管（2.0 ml） | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| 无菌水（无 DNA酶 和 RNA酶） | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| 基质溶液 | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸，50% 乙腈，2.5% 三氟乙酸 |
| 台式 microflex LT MALDI-TOF 质谱仪 | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 使用 BioTyper 3.1 (Build 65) 和 FlexControl 3.3 (Build 99) 软件 |
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