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方法文章

使用共聚焦旋转盘显微镜对腺病毒和慢病毒感染后的大鼠原代新生心肌细胞进行活细胞成像

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DOI：

10.3791/51666

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2014年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用慢病毒和腺病毒转导后，通过共聚焦转盘显微镜对原代大鼠新生心肌细胞进行活细胞成像的方法。该方法可实现对活体心肌细胞中细胞过程的详细观察。

摘要

原代新生大鼠心肌细胞在基础研究中具有重要应用价值 体外 心血管研究中，原代新生大鼠心肌细胞因其可在单次操作中大量分离而被广泛应用。随着显微镜技术的进步，研究人员能够以较低光毒性风险实时捕获活细胞图像，便于动态观察细胞事件。本实验方案描述了在利用慢病毒和腺病毒转导以调控细胞特性的基础上，使用共聚焦转盘显微镜对原代新生大鼠心肌细胞进行活细胞延时成像的方法。采用两种不同类型的病毒有助于实现两个不同基因的适宜转导效率与表达水平。借助显微镜的自动对焦系统，可在长时间内维持稳定的焦平面，从而获得清晰聚焦的活细胞图像。应用该方法可分析在培养的原代细胞中外源性表达的工程化蛋白的功能。此外，该系统也可用于通过siRNA或化学调节剂研究基因功能。

引言

原代新生大鼠心肌细胞长期以来被用于体外研究心肌细胞功能in vitro1。可通过多种成熟的方法从小鼠幼崽中轻松分离这些细胞2-4。最常用的方法是使用胶原酶或胰蛋白酶在细胞分离前消化心脏的结缔组织。研究人员还开发了从成年啮齿类动物5-8以及新生小鼠9,10中分离心肌细胞的方法。

本方案描述了一种从新生大鼠幼崽中分离心肌细胞的方法，采用两步酶消化法。首先在4 °C条件下使用胰蛋白酶过夜消化，随后在37 °C条件下使用纯化的胶原酶进行消化。与在温热酶溶液中进行连续孵育的方法相比，在4 °C条件下用胰蛋白酶过夜孵育心脏组织 可减少收获细胞所需的步骤2。此外，通过使用纯化的胶原酶而非粗制酶制剂，可消除批间差异，从而提高实验的可重复性。

对特定蛋白质的功能研究通常采用腺病毒11-13和/或慢病毒14-16表达系统。[注意事项] 病毒的制备与操作应遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则。

腺病毒不会整合到宿主基因组中。它在大多数细胞类型中都具有很高的转导效率，包括分裂细胞和非分裂细胞，以及原代细胞和已建立的细胞系。这使得腺病毒成为基因表达的可靠载体。在转导后48小时内，腺病毒载体编码的蛋白水平即可达到较高水平，并可持续数周17。然而，使用腺病毒进行蛋白表达的一个缺点是，构建重组腺病毒的过程既复杂又耗时。这一缺点部分解释了为何许多研究人员已转向使用慢病毒进行重组基因表达。与腺病毒载体不同，构建慢病毒载体快速且简便。尽管慢病毒在分裂细胞和非分裂细胞中的转导效率通常低于腺病毒，但它们能够整合到宿主基因组中。因此，慢病毒介导的转导基因表达比腺病毒更稳定。

由于显微技术的进步，现在更容易获取表达重组蛋白的活细胞图像，即使在视频采集速率下也能实现。这使得研究人员能够实时确定目标蛋白的特定改变对细胞功能的影响。共聚焦转盘显微镜具有多个关键特性，使其成为活细胞成像的理想技术18,19。Yokogawa 转盘可实现更快的图像采集速度，同时相比点扫描共聚焦显微镜所需激光功率显著降低。这两种优势均源于转盘结构，该转盘上分布有大量共聚焦小孔，激光可同时穿过这些小孔照射到样品上。在图像采集过程中，转盘本身持续高速旋转18-20。通过使用显微镜的自动对焦系统，可在长时间内保持稳定的焦距，从而使研究人员能够获得清晰对焦的活细胞图像。所采集的图像可回放为视频文件，并利用 ImageJ21,22、FIJI23 或其他商业图像分析软件进行分析。

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方案

1. 大鼠新生心肌细胞的分离 

  1. 使用添加了胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）和最低必需培养基（MEM）作为培养液。在分离后的前2天，在培养液中加入5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），以抑制成纤维细胞的生长。
基础培养基FBSBrdU (mM)P/S (U/ml)
筛选阶段DMEM10%020
第一天DMEM10%0.110
第二天DMEM/MEM5%0.110
后续培养DMEM/MEM5%010

表1：大鼠新生心肌细胞培养基。 使用该培养基培养大鼠新生心肌细胞。DMEM/MEM 是指 DMEM 与 MEM 培养基按 1:1 比例混合。

1.1）心肌细胞分离，第1天（预计所需时间约1小时）

注意：进行新生啮齿类动物实验时，应参照所在大学的指导方针及动物护理项目制定的规章制度，并遵守机构批准的动物实验方案。本方案中描述的所有方法均已获得耶鲁大学动物资源中心机构动物护理和使用委员会的批准。

  1. 准备试剂和工具：无钙无镁的 Hank's 平衡盐溶液（CMF HBSS），30 ml × 2 份，10 ml × 2 份，置于冰上；1 mg 胰蛋白酶，用 2 ml CMF HBSS 重悬，置于冰上；经高压灭菌的器械；250 ml 烧杯中的 70% 乙醇（EtOH）；四个灭菌的 10 cm 塑料培养皿，其中三个用于心脏分离，一个用于胰蛋白酶消化。
  2. 从实验动物供应商处订购一窝出生 1 至 2 天的大鼠幼崽（约 10 只）及其母鼠。
  3. 第1天，将幼崽转移至小鼠笼中，并通过过量注射氯胺酮/赛拉嗪混合液（氯胺酮 200 ml/10 g，赛拉嗪 20 ml/10 g）对母鼠实施安乐死。
  4. 取一只幼崽，用 70% 乙醇对其整个身体进行消毒。在远离其他幼崽的操作区域，使用保持锋利的无菌手术剪，在灭菌的 10 cm 塑料培养皿上将其头部剪下。
    注意：为了尽快收集样本，应采用最快速且高效的方法终止啮齿动物的生命。当由熟练专业人员使用良好维护的设备正确操作时，断头法可能使动物恐惧和焦虑更少，且比其他安乐死方式更迅速、更实用。该方法符合美国兽医医学协会《动物安乐死指南》的建议。
  5. 使用无菌器械取出跳动的心脏，并将心脏放入装有 30 ml 冰冷 CMF HBSS 的 50 ml 锥形管中。注意：应尽快取出心脏并立即置于冰上。心脏离体后，所有操作均需在冰上进行。
  6. 将 5 个心脏收集于 30 ml 冰冷 CMF HBSS 中，其余 5 个心脏放入另一份 30 ml 冰冷 CMF HBSS 中。轻轻旋转管子以冲洗心脏。注意：此步骤之后，所有操作均应在超净工作台内进行。
  7. 弃去上清液，将心脏转移至一个新的、置于冰上的灭菌 10 cm 塑料培养皿中。注意：使用移液器吸液时需小心，避免将心脏一并吸出。
  8. 去除大血管和/或不需要的组织。向培养皿中加入 10 ml 冰冷 CMF HBSS 以冲洗心脏。
  9. 将所有心脏转移至另一个新的、置于冰上的灭菌 10 cm 塑料培养皿中。在冰上用剪刀将心脏剪碎至小于 1 mm3。
  10. 加入 9 ml 冰冷 CMF HBSS。再加入 1 ml 用 CMF HBSS 重悬的冰冷胰蛋白酶（终浓度 50 µg/ml）。
  11. 用封口膜密封培养皿，并用铝箔包裹，然后置于 4 ˚C 冷室中过夜。

1.2）心肌细胞分离，第2天（预计所需时间约4小时）

  1. 准备试剂与工具：50 ml 锥形管 × 2；2 mg 胰蛋白酶抑制剂，用 1 ml 无钙镁 HBSS（CMF HBSS）重悬，置于冰上；1500 单位胶原酶，用 5 ml Leibovitz L-15 培养基重悬，室温（RT）保存；Leibovitz L-15 培养基，用 1 升灭菌水配制，经 0.22 微米滤膜过滤，取 8 ml 置于室温；10 mg/ml（32.6 mM）BrdU 溶于水；P/S；DMEM + 10% FBS；MEM；10 cm 塑料细胞培养皿 × 2；3.5 cm 玻璃底培养皿 × 2。
  2. 第2天， 制备明胶包被培养皿。向3.5 cm玻璃底培养皿中加入1 ml 0.1%明胶溶液，用于成像实验的包被。将培养皿在37℃孵育 ˚4°C孵育数小时，使用前吸除并弃去明胶溶液。
    注意：3.5 cm 玻璃底培养皿适用于使用荧光显微镜进行的成像实验。若需从原代心肌细胞中提取蛋白质，以通过蛋白质印迹法（WB）检测蛋白质表达水平，可使用经 0.1% 明胶包被的塑料细胞培养皿。
  3. 在无菌操作台中，将经胰蛋白酶过夜消化的心脏组织连同缓冲液一并转移至冰上预冷的50 ml锥形管中。加入1 ml CMF HBSS中的胰蛋白酶抑制剂（终浓度182 ug/ml）。拧紧50 ml锥形管管盖，防止污染。
  4. 在37℃下孵育试管约30分钟 ˚C 恒温培养箱中将组织和缓冲液预热至 30-37 ˚C. 加入5 ml胶原酶（终浓度为94单位/ml）至Leibovitz L-15培养基中，37℃孵育 ˚C，轻轻振荡孵育45分钟（37℃，170–200 rpm） ˚C 培养箱）
    注意：此步骤可在超净工作台外进行。所有后续步骤均应在室温下进行。
  5. 用70%乙醇消毒50 ml锥形管外表面，然后将其放入无菌操作台中。
  6. 使用移液器以每秒3 ml的速度吹打组织20次。静置组织残渣3分钟，用70 μm细胞滤网过滤上清液。
    注意：可使用标准的10 ml移液管进行吹打混悬。
  7. 向剩余的组织块中加入 5 ml Leibovitz L-15，再次吹打并过滤上清液。用 2 ml Leibovitz L-15 冲洗细胞滤网。
  8. 将过滤后的细胞溶液置于通风橱中 20–60 分钟，使胶原酶消化部分降解的胶原蛋白。
  9. 以100 × 离心收集沉淀细胞 g 5 分钟后，用含有 10% FBS 和高浓度青霉素-链霉素（20 U/ml）的 20 ml DMEM 重悬细胞。
  10. 在两个10 cm塑料细胞培养皿中预铺细胞，在CO₂培养箱中孵育1小时2 37℃培养箱 ˚C 用于心肌细胞筛选。注意：成纤维细胞比心肌细胞更容易贴附于培养皿底部。
  11. 等待期间，配制含10% FBS、青霉素/链霉素（P/S，10 U/ml）和0.1 mM BrdU的DMEM培养基。将1 ml 10 mg/ml BrdU加入325 ml含10% FBS和P/S的DMEM中。
  12. 轻轻混匀培养皿，收集两个10 cm培养皿中含有心肌细胞的上清液。
    注意：大多数心肌细胞在孵育1小时后仍会悬浮在上清液中。为了避免收集到轻度贴壁于培养皿的成纤维细胞，不要用移液器吸取上清液进行收集。
  13. 可选> 用或不用0.2%台盼蓝对上清液中的细胞进行计数，以检测细胞活力。
  14. 以100 × 离心收集沉淀细胞 g 5分钟。将细胞重悬于含有10% FBS、P/S（10 U/mL）和0.1 mM BrdU的DMEM培养基中。以2 × 10⁵细胞/孔的密度接种细胞5 细胞/皿置于经明胶包被的3.5 cm玻璃底培养皿中，用于显微镜观察。注意：接种后至少24小时内勿扰动细胞，置于CO₂培养箱中培养。2 37℃培养箱 ˚C.
  15. 第3天， 接种后24小时更换培养基为含5% FBS、P/S和0.1 mM BrdU的DMEM/MEM。
  16. 第4天， 铺板48小时后，更换为含5% FBS和P/S的DMEM/MEM培养基。
    注意：每隔2-3天更换一次培养基，使用含5% FBS和P/S的DMEM/MEM。

2. 慢病毒转导

2.1）慢病毒质粒的包装

注意：有关本主题的更深入信息，请参考其他资料来源24-26。制备慢病毒溶液大约需要3天时间。为获得更高的转导效率，建议使用新鲜的慢病毒溶液。慢病毒质粒的包装与新生大鼠心肌细胞的分离应同时开始。包装慢病毒质粒时，除聚乙烯亚胺（PEI）27外，也可使用商品化的转染试剂，请遵循生产商的使用说明。

  1. 准备试剂和工具：HEK 293T 细胞、10 cm 塑料细胞培养皿、慢病毒质粒溶液（pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G、慢病毒转移载体，各 1.0 mg/ml）、1 g/l PEI、无血清培养基、20 mM 氯喹水溶液、10% 漂白剂、70% 乙醇中的 1% SDS
  2. 第 0 天，转染前一天，每 10 cm 培养皿接种 2–2.5 × 106 个 HEK 293T 细胞。
    注意：转染时细胞融合度以 30–60% 为最佳。
  3. 第 1 天，配制 PEI 转染溶液。在 1.5 ml 离心管中，将 30 µl 1 g/l PEI 加入 960 µl 无血清培养基中。随后将 4 种质粒加入该 PEI 转染溶液中，通过轻弹管壁混匀。
质粒名称备注大小 (kbp)添加体积  (ml)10 cm 培养皿中的终量 (mg)10 cm 培养皿中的终浓度 (pM)
Lentiviral transfer vector编码待包装的基因9-133.6-5.23.6-5.260
pMDLg/pRRE表达 HIV-1 GAG/POL8.81.761.7630
pRSV-Rev表达 HIV-1 REV4.10.820.8230
pMD2.G表达 VSV G5.81.161.1630

表2：慢病毒包装所需的质粒用量。 使用这些质粒用量转染10 cm培养皿中的HEK293细胞。每皿慢病毒转移载体的最终用量可能因其大小而异，需保持每皿终浓度为60 pM。双链DNA每个碱基对的平均分子量为660道尔顿。

  1. 弃去10 cm培养皿中HEK 293T细胞的旧培养基，轻轻加入9 ml新鲜培养基（DMEM + 10% FBS，不含P/S）。
  2. 将PEI-DNA混合物轻轻逐滴加入培养板中，并轻柔摇晃以与培养基混匀。向10 ml培养基中加入10 μl 20 mM氯喹（终浓度20 μM）。注意：氯喹可通过部分中和溶酶体区室内的pH，减少含质粒的转染复合物的降解。 28.
  3. 在 CO₂ 培养箱中孵育2 37℃培养箱 ˚在37°C下孵育6小时。然后，移除含有PEI-DNA混合物的培养基，并加入10 ml新鲜培养基（DMEM + 10% FBS + 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 7.4 + P/S）。注意：孵育后，病毒将在培养基中产生。用于吸取的巴斯德吸管和/或吸头必须用10%次氯酸钠溶液进行去污处理。无论上清液是否发生溢出，均须使用70%乙醇对生物安全柜表面及可能被污染的设备进行去污。若发生溢出，则必须使用含1%十二烷基硫酸钠（SDS）的70%乙醇进行彻底去污。
  4. 第2-3天，于CO₂培养箱中孵育2 37℃培养箱 ˚48–72 小时，温度为 C 第4天，收集慢病毒溶液（继续 第2.2节).
    注意：转染后48小时可更换培养基。分别在转染后48小时和72小时收集两次病毒上清，可能获得更高滴度的病毒溶液。

2.2）慢病毒溶液的收集与转导

  1. 准备试剂和工具：15 ml 圆底离心管、1 M HEPES（pH 7.4，0.22 μm 过滤）
  2. 第4天用10 ml无菌鲁尔锁扣注射器收集含有慢病毒颗粒的上清液（慢病毒溶液），然后通过0.45 μm滤器将上清液过滤至15 ml锥形管中。向过滤后的慢病毒溶液中加入1/100体积的1 M HEPES（pH 7.4）（终浓度为10 mM）。
    注意：过滤时仅使用醋酸纤维素或聚醚砜（PES）（低蛋白结合）滤膜。请勿使用硝酸纤维素滤膜，因为硝酸纤维素会结合慢病毒包膜表面的蛋白质，从而破坏病毒。
  3. 从上一步获得的3.5 cm培养皿中取出大鼠新生心肌细胞的培养基 第1.2节，向3.5 cm培养皿中加入1 ml过滤后的慢病毒溶液。
  4. <可选> 加入六亚甲基溴化铵（终浓度 4–6 ug/ml）。
    注意：六甲溴铵可能提高慢病毒转导效率。六甲溴铵的浓度应进行优化。
  5. 将培养皿在 CO₂ 培养箱中孵育 6 小时2 37℃培养箱 ˚C 用于慢病毒转导，然后更换为含 5% FBS 和 P/S 的新鲜 DMEM/MEM。将培养皿置于 CO2 37℃培养箱 ˚37°C 培养 3 天。
    注意：外源基因通过慢病毒整合到宿主基因组的过程通常在72小时后完成。
  6. 第7天使用2.2.5步骤中的细胞进行下一步操作。注意：在转导后48–72小时，可通过蛋白质印迹（WB）或免疫细胞化学（ICH）检测慢病毒质粒的蛋白表达，以确定相对表达水平（图1a和1b）。

2.3）慢病毒溶液的浓缩

注意：为了获得最高的转导效率，最好使用新鲜的慢病毒溶液；如果 慢病毒溶液的滴度不够高，可通过聚乙二醇（PEG）沉淀法对慢病毒溶液进行浓缩29。

2.3.1）4倍PEG溶液（32% PEG6000、400 mM 氯化钠（NaCl）、40 mM HEPES，pH 7.4）的配制

  1. 配制125 ml 4倍PEG溶液：称取40 g PEG6000，溶于60 ml水中。
    注意：PEG 后面的数字表示平均分子量（即 PEG6000 的平均分子量为 6,000。
  2. 缓慢加入10 ml 5 M NaCl。缓慢加入5 ml 1 M HEPES（pH 7.4）。使用2 M氢氧化钠调节pH至7.4。
  3. 加水至125 ml。使用0.22 μm滤膜对4倍浓度PEG溶液进行膜过滤除菌，并于4 ℃保存 ˚C. 

2.3.2）慢病毒浓缩

  1. 使用0.45 μm滤器将慢病毒转导的上清液过滤至新的50 ml离心管中。
  2. 加入4倍体积的PEG溶液，比例为1:3（PEG溶液:上清液 = 1:3）。4℃保存 ˚16–48 小时，温度为 C
  3. 以 2,600 x g 在 4 ˚C 下孵育 30 分钟。弃去上清液，在 2,600 x g 4 ℃时 ˚5 分钟，C
  4. 小心弃去上清液，避免扰动沉淀。用相当于原始上清液体积1/2至1/25的无血清培养基重悬沉淀。
  5. 直接使用，或用液氮冷冻后于 -80 ℃ 保存 ˚C  

3. 腺病毒转导

注意：有关腺病毒载体的构建与扩增方法，请参考其他文献来源13。用于吸取液体的巴斯德吸管和/或吸头必须使用10%次氯酸钠溶液进行去污处理。无论上清液是否发生溢出，均须使用70%乙醇对生物安全柜表面及可能被污染的设备进行去污。若发生溢出，则需使用含1%十二烷基硫酸钠（SDS）的70%乙醇溶液进行彻底去污。

  1. 通过50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）测定腺病毒滴度50)
    注意：在转导之前，必须对腺病毒储存液进行滴定。TCID50 是滴定病毒溶液的最佳方法之一。由于该方法通过测定病毒对HEK 293T细胞的感染能力来计算滴度，所得结果为TCID50 反映了腺病毒储备液的实际感染能力。PFU（噬斑形成单位）与TCID50 约为 0.56 的因子 30.
    1. 准备细胞和工具：HEK 293T 细胞、10 cm 细胞培养皿、96 孔平底细胞培养板、8 通道多通道移液器
    2. 在1个10 cm培养皿中培养HEK 293T细胞，使其融合度达到70–90%。
    3. 进行1/10的预稀释4 病毒原液。向96孔平底细胞培养板的每孔中加入50 μl DMEM + 10% FBS。将预稀释的病毒原液25 μl加入第一行A至H孔中。
    4. 充分混匀后，使用八通道多道移液器将第一排孔中的25 μl转移至第二排孔中。重复进行1/3倍病毒溶液稀释，依次至第11排孔，并弃去最后一排的25 μl。
    5. 将HEK 293T细胞重悬于10 ml DMEM + 10% FBS中，每孔加入50 μl细胞悬液至第1至第12行各孔。
    6. 在37℃下孵育细胞 ˚在CO2培养箱中于37°C培养11-13天。接种后第4-5天和第7-8天，各加入50 μl DMEM + 10% FBS。
    7. 在感染后11至13天测定每个孔的细胞病变效应。
泳道123456789101112
第 A 行ddddddddd　　　
第 B 行ddddddddd　　　
第 C 行ddddddddd　　　
第 D 行ddddddd　　　　　
第 E 行ddddddddddd　
第 F 行ddddddd　　　　　
第 G 行dddddddd　　　　
第 H 行ddddddddddd　
每行阳性孔的数量888888865220
每行阳性孔的比例11111110.750.630.250.250

d　表现出超过 50% 的细胞病变效应
表现出低于 50% 或无细胞病变效应

第1泳道，稀释度 31x104；第2泳道，稀释度 32x104；…；第11泳道，稀释度 32x1011；第12泳道，对照。
S = 每行阳性孔比例之和
= 1+1+1+1+1+1+1+0.75+0.63+0.25+0.25+0 = 8.875
TCID50 = 3 x 104 x 3 x (8.875-0.5) = 2.97 x 108
TCID50/ml = 5.94 x 109

表3：接种后10天的96孔板感染示例。 测定每个孔中的细胞病变效应，并计算每行中阳性孔的比例之和。

  1. 根据 Kaerber 公式31计算滴度。
    TCID50 = （第一列的稀释倍数）×（稀释倍数）(S-0.5)
    S = 每行阳性孔比例的总和
    注：本实验方案中，TCID50 = (30000) × (3)(S-0.5)。由于本方案使用 50 µl 病毒溶液，需将 TCID50 除以 0.05，以计算 TCID50/ml。

3.2）腺病毒转导

公式示例
MOI = 病毒原液的PFU数 / 细胞数量100 (MOI) = 6 (ml) × 5.94 × 106 (TCID50/ml) × 0.56 /
2 × 105 (细胞)

PFU 与 TCID50 成正比，比例系数约为 0.56。
病毒原液滴度示例 = 5.94 × 10⁹ (TCID50/ml) = 5.94 × 10⁶ (TCID50/µl)
示例：将 6 ml 滴度为 5.94 × 10⁹ (TCID50/ml) 的病毒原液加入含有 2 × 10⁵ 个细胞的培养皿中，以达到 100 的感染复数（MOI）。

表4

  1. 根据腺病毒溶液的滴度（PFU/ml、病毒颗粒数/ml 或 TCID50/ml）计算所需病毒溶液体积。使用公式计算感染复数（MOI）。
  2. 将计算所得体积的病毒溶液加入无血清培养基中（见表5）。充分混匀，室温孵育20分钟。
感染复数（MOI）从原液中取用的体积（ml）需加入无血清培养基的体积（ml）需加入培养皿的体积（ml）
131972
331976
10319720
30319760
1006194200

表5

  1. 第7天，取上一步骤中获得的培养皿 第2.2节，弃去原培养基，加入750 μl含5% FBS和P/S的新鲜DMEM/MEM。
    注意：在转导过程中，将培养基体积减少至原始体积的约50%对于实现高转导效率至关重要。
  2. 加入稀释后的病毒溶液至培养皿中。将培养皿在CO₂培养箱中孵育4–8小时。2 37℃培养箱 ˚C. 随后，更换为新鲜培养基。
  3. 在 CO₂ 培养箱中孵育培养皿 24–48 小时2 37℃培养箱 ˚C. 第几天 8-9，将细胞用于活细胞成像实验。注：转导后24-48小时，可通过WB或ICH检测腺病毒质粒的蛋白表达，以确定相对蛋白表达水平（图1c和1d）。

4. 活细胞成像

4.1）使用配备温控培养室和CO2环境系统的共聚焦转盘显微镜进行图像采集（可选）

  1. 在数据采集前至少1小时开启温度控制系统，以使所有设备平衡至37 ˚在开始采集之前，将 C 置于初始状态。开启共聚焦转盘显微镜系统（用于操作的计算机、显微镜、转盘单元、CCD 相机、激光器、荧光光源、透射光光源、电动载物台和自动快门）。
    注意：所有设备需超过 1 小时才能达到完全的温度平衡。
  2. 必要时，将3.5 cm玻璃底培养皿中的培养基更换为成像所需的培养基。将培养皿置于共聚焦转盘显微镜的载物台上，并放入温度控制腔室中。
    注意：由于球面像差的影响，显微观察时使用底部为玻璃、直径3.5 cm、盖玻片规格为1.5号（厚度约0.16–0.19 mm）的培养皿最为理想。若所用物镜配有校正环，则可对使用厚度超过0.17 mm盖玻片所获得的图像进行校正。此外，酚红具有轻微荧光，在某些情况下建议使用不含酚红的培养基，例如不含酚红的DMEM。若无CO₂控制装置2 浓度对显微镜载物台的影响，最好使用 CO2 独立培养基或用 HEPES 缓冲的培养基，用于长期延时成像。
  3. 选择光路至目镜。
  4. 打开明场光源的快门。通过目镜调节显微镜下细胞的焦距。关闭明场光源的快门。
  5. 打开荧光光源的快门。通过目镜在显微镜下寻找表达荧光蛋白的细胞。关闭荧光光源的快门。
  6. 可选> 按下显微镜前方的完美聚焦系统激活按钮，以开启完美聚焦系统，从而在延时成像过程中保持焦距稳定。
  7. 切换至转盘共聚焦显微镜的光路。使用操作软件适当调整采集参数，并观察屏幕显示的图像进行确认。例如 焦点、激光功率、曝光时间、CCD相机增益和偏移
  8. 使用操作软件设置荧光图像采集参数。示例：选择“通过光路切换通道”和“通道1：EGFP”，以在通道一中采集EGFP的荧光信号。
  9. 通过在操作软件中设置延时成像参数，设定时间点之间的采集频率，以获取延时图像。示例：若每5分钟采集一个时间点，从下拉菜单中选择“每时间点分钟数”，并在文本框中输入5。  
    注意：选择“最大速度”以实际速度生成视频。如果荧光蛋白表达水平较低，在延时成像过程中荧光可能迅速淬灭。在此情况下，最好减少采集时间点的数量。
  10. 开始延时成像采集 通过单击“开始”按钮来获取图像序列。
    注意：最好不要使用多点采集功能。在延时成像过程中，该功能可能导致失焦或成像视野移动。 

4.2）获取图像的分析

注意：采集的图像可以作为视频文件回放，并使用分析软件进行分析。

  1. 选择要包含在视频中的采集图像。如有必要，使用操作软件从图像中裁剪出感兴趣区域，并选取关键时间点，以减小视频文件大小。
  2. 将图像导出为 AVI 或 MOV 格式的视频文件。在“格式”下拉菜单中选择视频格式，并设置所需播放速度，然后点击“导出”。注意：每隔 5 分钟采集一个时间点的时间序列图像，可以以每秒 10 帧的速度播放，相当于实际速度的 3,000 倍。 

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结果

为了演示该技术，使用编码EGFP（增强型绿色荧光蛋白）标记的Cx43（连接蛋白43）或突变型Cx4332的慢病毒在细胞中表达EGFP标记的蛋白，同时使用编码FGFR1DN（成纤维细胞生长因子受体1显性负性突变体）的腺病毒来抑制细胞内的FGF信号通路33-35。在心肌细胞分离后的第3天，将分离的心肌细胞用慢病毒感染，以在细胞中表达EGFP标记的蛋白。慢病毒感染3天后，再用编码FGFR1DN的腺病毒进一步感染分离的心肌细胞，以消除细胞内的FGF信号。在给予足够时间使细胞表达被转导的外源基因后，采用共聚焦转盘显微镜采集活细胞图像。所获得的图像以视频文件形式回放，并使用图像分析软件进行分析。更多详细的代表性结果请参见Sakurai et al32。

慢病毒感染后72小时，通过共聚焦转盘显微镜确认了EGFP标记蛋白的表达图1A-B。腺病毒感染24小时后，通过WB和ICC验证了FGFR1DN的表达图1C-D。将腺病毒加入3.5 cm培养皿的时间...

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讨论

从新生大鼠分离的原代心肌细胞长期以来被用于研究心肌细胞功能 体外本方案描述了一种采用两步酶消化法从新生大鼠幼崽中分离心肌细胞的方法，首先在4 °C条件下用胰蛋白酶过夜消化，随后使用纯化的胶原酶进行消化。采用纯化胶原酶步骤的一个优势在于，所有分离实验均使用同一级别的酶，从而确保每次实验所获得细胞的质量和数量具有一致性。

鉴于腺病毒具有较高的转导效率，如果特定实验需要对细胞培养物实现高效转导，则最好使用腺病毒。然而，如果不需要高水平的转导，可以使用慢病毒载体。能够选择使用腺病毒或慢病毒载体，有助于针对不同类型的基因实现适当的转导和表达水平。如果在慢病毒转导后，通过共聚焦旋转盘显微镜进行活细胞成像或免疫细胞化学（ICC）检测到的荧光强度非常低，更换为另一种使用不同启动子表达目的基因的慢病毒转移载体可能解决此问题。对于腺病毒载体，如果腺病毒转导后通过蛋白质印迹（WB）检测到的条带较弱，可能表明病毒原液滴度较低。在此情况下，最好在继续实验前通过细胞扩增制备更高滴度的腺病毒溶液。

该技术的一个局限性在于，即使使用纯化的胶...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Alengo Nyamay'antu 博士和 Ilse Timmerman 博士在慢病毒包装方面的建议。本研究由美国心脏协会科学家发展资助项目（10SDG4170137）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 用于断头的剪刀WPI501749使用前请高压灭菌
1 用于心脏分离和切碎的精细剪刀WPI14393使用前需高压灭菌
2 把精细镊子（Dumont No. 5）SigmaF6521使用前需高压灭菌
3 个无菌的 10 cm 塑料培养皿SigmaCLS430165用于心脏分离
3.5 cm 玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-20-C用于心肌细胞的最终铺板，以便后续活细胞成像。ibidi品牌的Micro-Dishes可作为可接受的替代产品。
3.5 cm 玻璃底培养皿MatTekP35G-0.17-14-C用于TIRF或高分辨率成像
70% (v/v) 乙醇水溶液SigmaE7148
2% 明胶SigmaG1393
1 个无菌 10 cm 塑料培养皿SigmaCLS430165用于胰蛋白酶消化
铝箔任何品牌
ParafilmSigmaP7543
两个10 cm塑料细胞培养皿SigmaCLS430165用于筛选
自动移液器Drummond Scientific4-000-300用于吹打
细胞计数仪
Cellometer，自动细胞计数仪nexcelom检测并计数细胞
显微镜和血细胞计数板任何品牌检测并计数细胞
0.4% 台盼蓝溶液invitrogen15250-061
CO2 培养箱SanyoMCO-19AIC
旋转振荡培养箱SigmaZ67312937℃下用胶原酶振荡心脏组织 °170-200 转/分钟，C
10 mg/ml BrdU 溶液BD Pharmingen550891
DMEM，高糖invitrogen41965039按照方案中指示混合培养基，并在使用前预热
MEMinvitrogen31095029根据方案指示混合培养基，并在使用前预热
胎牛血清invitrogen26140079
青霉素-链霉素（10,000 U/ml） invitrogen15140-122
第2节 慢病毒转导
3 种包装质粒
pMDLg/pRREAddgene12251
pRSV-RevAddgene12253
pMD2.GAddgene12259
慢病毒转移载体 pLVX-IRES-PuroClontech632183
Opti-MEM（无血清培养基）invitrogen31985070
转染试剂
聚乙烯亚胺“Max”，（分子量 40,000）— 高效线性聚乙烯亚胺（相当于游离碱形式下分子量 25,000） Polysciences24765-2可替换为罗氏的X-tremeGENE 9
X-tremeGENE 9罗氏6365779001转染试剂中替代PEI的方法
氯喹SigmaC6628溶于水，配制100 mM储存液。通过10–100 mM处理可抑制内体酸化。 μM 氯喹
HEPESSigmaH3375
10 ml 鲁尔锁型注射器，已灭菌BD309604
0.45 μm 滤膜SigmaF8677仅使用醋酸纤维素或聚醚砜（PES）（低蛋白结合）滤膜。请勿使用硝酸纤维素滤膜，因为硝酸纤维素会结合慢病毒包膜表面的蛋白质，从而破坏病毒。
六亚甲基溴化物SigmaH9268溶于水，配制成8 mg/ml的储备液，然后过滤除菌。
聚乙二醇 6,000Sigma81260
氯化钠SigmaS9888
氢氧化钠SigmaS5881
第3节 腺病毒转导
HEK 293T 细胞ATCCCRL-11268
若干个10 cm细胞培养皿SigmaCLS430165
96孔微孔板，带盖，平底，组织培养用，无菌BD Falcon353072用于滴定
多通道移液器，10-100 μl，8通道Eppendorf3122 000.035
第4节 活细胞成像
转盘共聚焦显微镜PerkinElmerL7267000
一个温度可控的腔室任何品牌保持温度在 37 °C
一氧化碳2 环境系统任何品牌可选，用于维持 CO2 浓度最佳
CO2 不含谷氨酰胺的独立培养基invitrogen18045-054  长时间延时成像
DMEM，高糖，HEPES，无酚红invitrogen21063-029长时间延时成像

参考文献

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