使用共聚焦旋转盘显微镜对腺病毒和慢病毒感染后的大鼠原代新生心肌细胞进行活细胞成像

摘要

本方案描述了一种利用慢病毒和腺病毒转导后，通过共聚焦转盘显微镜对原代大鼠新生心肌细胞进行活细胞成像的方法。该方法可实现对活体心肌细胞中细胞过程的详细观察。

摘要

原代新生大鼠心肌细胞在基础研究中具有重要应用价值 体外 心血管研究中，原代新生大鼠心肌细胞因其可在单次操作中大量分离而被广泛应用。随着显微镜技术的进步，研究人员能够以较低光毒性风险实时捕获活细胞图像，便于动态观察细胞事件。本实验方案描述了在利用慢病毒和腺病毒转导以调控细胞特性的基础上，使用共聚焦转盘显微镜对原代新生大鼠心肌细胞进行活细胞延时成像的方法。采用两种不同类型的病毒有助于实现两个不同基因的适宜转导效率与表达水平。借助显微镜的自动对焦系统，可在长时间内维持稳定的焦平面，从而获得清晰聚焦的活细胞图像。应用该方法可分析在培养的原代细胞中外源性表达的工程化蛋白的功能。此外，该系统也可用于通过siRNA或化学调节剂研究基因功能。

引言

原代新生大鼠心肌细胞长期以来被用于体外研究心肌细胞功能in vitro¹。可通过多种成熟的方法从小鼠幼崽中轻松分离这些细胞^2-4。最常用的方法是使用胶原酶或胰蛋白酶在细胞分离前消化心脏的结缔组织。研究人员还开发了从成年啮齿类动物^5-8以及新生小鼠^9,10中分离心肌细胞的方法。

本方案描述了一种从新生大鼠幼崽中分离心肌细胞的方法，采用两步酶消化法。首先在4 °C条件下使用胰蛋白酶过夜消化，随后在37 °C条件下使用纯化的胶原酶进行消化。与在温热酶溶液中进行连续孵育的方法相比，在4 °C条件下用胰蛋白酶过夜孵育心脏组织 可减少收获细胞所需的步骤²。此外，通过使用纯化的胶原酶而非粗制酶制剂，可消除批间差异，从而提高实验的可重复性。

对特定蛋白质的功能研究通常采用腺病毒^11-13和/或慢病毒^14-16表达系统。[注意事项] 病毒的制备与操作应遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则。

腺病毒不会整合到宿主基因组中。它在大多数细胞类型中都具有很高的转导效率，包括分裂细胞和非分裂细胞，以及原代细胞和已建立的细胞系。这使得腺病毒成为基因表达的可靠载体。在转导后48小时内，腺病毒载体编码的蛋白水平即可....

方案

1. 大鼠新生心肌细胞的分离 

1. 使用添加了胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）和最低必需培养基（MEM）作为培养液。在分离后的前2天，在培养液中加入5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），以抑制成纤维细胞的生长。

	基础培养基	FBS	BrdU (mM)	P/S (U/ml)
筛选阶段	DMEM	10%	0	20
第一天	DMEM	10%	0.1	10
第二天	DMEM/MEM	5%	0.1	10
后续培养	DMEM/MEM	5%	0....

结果

为了演示该技术，使用编码EGFP（增强型绿色荧光蛋白）标记的Cx43（连接蛋白43）或突变型Cx43³²的慢病毒在细胞中表达EGFP标记的蛋白，同时使用编码FGFR1DN（成纤维细胞生长因子受体1显性负性突变体）的腺病毒来抑制细胞内的FGF信号通路^33-35。在心肌细胞分离后的第3天，将分离的心肌细胞用慢病毒感染，以在细胞中表达EGFP标记的蛋白。慢病毒感染3天后，再用编码FGFR1DN的腺病毒进一步感染分离的心肌细胞，以消除细胞内的FGF信号。在给予足够时间使细胞表达被转导的外源基因后，采用共聚焦转盘显微镜采集活细胞图像。所获得的图像以视频文件形式回放，并使用图像分析软件进行分析。更多详细的代表性结果请参见Sakurai et al³²。

慢病毒感染后72小时，通过共聚焦转盘显微镜确认了EGFP标记蛋白的表达图1A-B。腺病毒感染24小时后，通过WB和ICC验证了FGFR1DN的表达图1C-D。将腺病毒加入3.5 cm培养皿的时间.......

讨论

从新生大鼠分离的原代心肌细胞长期以来被用于研究心肌细胞功能 体外本方案描述了一种采用两步酶消化法从新生大鼠幼崽中分离心肌细胞的方法，首先在4 °C条件下用胰蛋白酶过夜消化，随后使用纯化的胶原酶进行消化。采用纯化胶原酶步骤的一个优势在于，所有分离实验均使用同一级别的酶，从而确保每次实验所获得细胞的质量和数量具有一致性。

鉴于腺病毒具有较高的转导效率，如果特定实验需要对细胞培养物实现高效转导，则最好使用腺病毒。然而，如果不需要高水平的转导，可以使用慢病毒载体。能够选择使用腺病毒或慢病毒载体，有助于针对不同类型的基因实现适当的转导和表达水平。如果在慢病毒转导后，通过共聚焦旋转盘显微镜进行活细胞成像或免疫细胞化学（ICC）检测到的荧光强度非常低，更换为另一种使用不同启动子表达目的基因的慢病毒转移载体可能解决此问题。对于腺病毒载体，如果腺病毒转导后通过蛋白质印迹（WB）检测到的条带较弱，可能表明病毒原液滴度较低。在此情况下，最好在继续实验前通过细胞扩增制备更高滴度的腺病毒溶液。

该技术的一个局限性在于，即使使用纯化的胶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 用于断头的剪刀	WPI	501749	使用前请高压灭菌
1 用于心脏分离和切碎的精细剪刀	WPI	14393	使用前需高压灭菌
2 把精细镊子（Dumont No. 5）	Sigma	F6521	使用前需高压灭菌
3 个无菌的 10 cm 塑料培养皿	Sigma	CLS430165	用于心脏分离
3.5 cm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-20-C	用于心肌细胞的最终铺板，以便后续活细胞成像。ibidi品牌的Micro-Dishes可作为可接受的替代产品。
3.5 cm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0.17-14-C	用于TIRF或高分辨率成像
70% (v/v) 乙醇水溶液	Sigma	E7148
2% 明胶	Sigma	G1393
1 个无菌 10 cm 塑料培养皿	Sigma	CLS430165	用于胰蛋白酶消化
铝箔	任何品牌
Parafilm	Sigma	P7543
两个10 cm塑料细胞培养皿	Sigma	CLS430165	用于筛选
自动移液器	Drummond Scientific	4-000-300	用于吹打
细胞计数仪
Cellometer，自动细胞计数仪	nexcelom		检测并计数细胞
显微镜和血细胞计数板	任何品牌		检测并计数细胞
0.4% 台盼蓝溶液	invitrogen	15250-061
CO2 培养箱	Sanyo	MCO-19AIC
旋转振荡培养箱	Sigma	Z673129	37℃下用胶原酶振荡心脏组织 °170-200 转/分钟，C
10 mg/ml BrdU 溶液	BD Pharmingen	550891
DMEM，高糖	invitrogen	41965039	按照方案中指示混合培养基，并在使用前预热
MEM	invitrogen	31095029	根据方案指示混合培养基，并在使用前预热
胎牛血清	invitrogen	26140079
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	invitrogen	15140-122
第2节 慢病毒转导
3 种包装质粒
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
pRSV-Rev	Addgene	12253
pMD2.G	Addgene	12259
慢病毒转移载体 pLVX-IRES-Puro	Clontech	632183
Opti-MEM（无血清培养基）	invitrogen	31985070
转染试剂
聚乙烯亚胺“Max”，（分子量 40,000）— 高效线性聚乙烯亚胺（相当于游离碱形式下分子量 25,000）	Polysciences	24765-2	可替换为罗氏的X-tremeGENE 9
X-tremeGENE 9	罗氏	6365779001	转染试剂中替代PEI的方法
氯喹	Sigma	C6628	溶于水，配制100 mM储存液。通过10–100 mM处理可抑制内体酸化。 μM 氯喹
HEPES	Sigma	H3375
10 ml 鲁尔锁型注射器，已灭菌	BD	309604
0.45 μm 滤膜	Sigma	F8677	仅使用醋酸纤维素或聚醚砜（PES）（低蛋白结合）滤膜。请勿使用硝酸纤维素滤膜，因为硝酸纤维素会结合慢病毒包膜表面的蛋白质，从而破坏病毒。
六亚甲基溴化物	Sigma	H9268	溶于水，配制成8 mg/ml的储备液，然后过滤除菌。
聚乙二醇 6,000	Sigma	81260
氯化钠	Sigma	S9888
氢氧化钠	Sigma	S5881
第3节 腺病毒转导
HEK 293T 细胞	ATCC	CRL-11268
若干个10 cm细胞培养皿	Sigma	CLS430165
96孔微孔板，带盖，平底，组织培养用，无菌	BD Falcon	353072	用于滴定
多通道移液器，10-100 μl，8通道	Eppendorf	3122 000.035
第4节 活细胞成像
转盘共聚焦显微镜	PerkinElmer	L7267000
一个温度可控的腔室	任何品牌		保持温度在 37 °C
一氧化碳2 环境系统	任何品牌		可选，用于维持 CO2 浓度最佳
CO2 不含谷氨酰胺的独立培养基	invitrogen	18045-054	长时间延时成像
DMEM，高糖，HEPES，无酚红	invitrogen	21063-029	长时间延时成像