Entamoeba histolytica 感染所致上皮损伤的分析

摘要

Entamoeba histolytica 感染人类会导致阿米巴病，这是热带国家腹泻的主要病因之一。该病原体与肠道上皮细胞相互作用，引发细胞间连接的开放，从而导致腹泻，有时继发肝脏感染。本文提供了一种用于评估宿主与病原体早期相互作用的模型，以增进对阿米巴病发病机制的理解。

摘要

Entamoeba histolytica 是人阿米巴病的致病原，该病是热带国家腹泻和肝脓肿的主要病因之一。感染始于病原体与肠道上皮细胞的相互作用。这种相互作用会导致细胞间结构（如紧密连接，TJ）的破坏。紧密连接可密封上皮层，将宿主组织与肠腔分隔开来。最近的研究表明，寄生虫蛋白 EhCPADH112 破坏紧密连接是 E. histolytica 入侵的前提，且伴随上皮屏障功能障碍。因此，分析 E. histolytica 入侵过程中紧密连接解体的分子机制，对于深入理解阿米巴病的发病机制至关重要。本文介绍了一种简便的模型，可用于评估宿主-病原体的初始相互作用及寄生虫的侵袭潜力。待分析的参数包括跨上皮电阻、EhCPADH112 与上皮细胞表面受体的相互作用、上皮连接标志物表达与定位的变化，以及寄生虫分子在上皮细胞内的定位。

引言

Entamoeba histolytica 是一种单细胞原虫，可引起人类阿米巴病，这是一种导致肠道炎症和腹泻的肠道感染。每年约有 5000 万人感染 E. histolytica，但仅有约 10% 的感染者会出现与阿米巴病相关的症状¹。感染通常因摄入被 E. histolytica 包囊污染的食物或水而发生。在肠道内，包囊释放出具有活性的滋养体，滋养体可黏附于结肠黏液并进行增殖²。滋养体通常会转化为包囊，并随粪便排出体外。在其他情况下，由于尚不明确的原因，滋养体会破坏肠上皮层并侵入深层组织。在严重情况下，它们可进入血液并影响肝脏等其他器官³。

破坏上皮屏障需要破坏维持细胞连接的上皮跨膜结构。上皮细胞间的连接由顶端连接复合体构成，包括紧密连接（TJ）和黏附连接（AJ），以及桥粒⁴。其中最顶端的连接是紧密连接（TJ），因此在宿主入侵过程中，它们是E. histolytica及其他一些病原体首先遇到的屏障。紧密连接由跨膜黏附受体组成，如claudin、occludin和连接黏附分子（JAM），这些受体通过与相邻细胞上的同源或异源受体发生相互作用而连接。在细胞内，这些黏附受体与zonula occludens（ZO）家族的支架蛋白结合，后者将黏附受体与肌动蛋白细胞骨架相连，从而为上皮提供额外的机械强度。紧密连接的功能是封闭肠道组织与肠腔之间的通路，防止水分和溶质过度泄漏。因此，当寄生虫破坏了紧密连接后，组织即被侵入。E. histolytica分泌多种分子，包括：（i）参与阿米巴与靶细胞黏附的分子⁵；（ii）参与通过胞吐作用杀伤宿主细胞的膜活性因子，例如形成离子通道的多肽——阿米巴孔蛋白（amoebapores）^6,7；以及（iii）降解细胞外基质蛋白并介导组织崩解的蛋白酶^5,8,9。

半胱氨酸蛋白酶EhCP112与黏附分子EhADH112共同组成EhCPADH112复合物，是E. histolytica的两种主要毒力蛋白，在紧密连接（TJ）的解体过程中发挥关键作用¹⁰。活的滋养体、其全裂解液及分泌产物均可诱导紧密连接复合物发生分子水平的改变，并导致上皮屏障功能紊乱。本研究表明，EhCP112和EhADH112可与闭合蛋白（occludin）和claudin-1蛋白相互作用，导致细胞蛋白的内化和降解，从而促进E. histolytica通过细胞旁路途径侵入组织。

我们的数据以及其他研究团队的数据^11-17均强烈提示，特定的宿主-病原体相互作用是寄生虫入侵所必需的。阐明这些相互作用的分子基础，对于深入理解阿米巴病的发病机制至关重要。滋养体选择性破坏紧密连接（TJ），表现为细胞旁通透性增加，可通过跨上皮电阻（TER）的下降进行测定。通过免疫荧光染色和共聚焦激光显微镜可检测寄生虫蛋白向宿主上皮细胞的转移，该方法还可揭示阿米巴毒力因子与上皮连接标志物的共定位，提示可能存在直接相互作用。本文详细描述了如何培养、收获和处理上皮细胞与滋养体，以研究宿主-病原体相互作用及其后果。

方案

1. 溶组织内阿米巴（E. histolytica）培养物的建立与维持

1. 在无菌条件下（完全不含任何其他污染生物）培养 1 x 10⁵ 滋养体的 溶组织内阿米巴 HMl:IMSS 菌株 A 克隆¹⁸ 在带有聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的16 x 125 mm培养管中（或1 x 10⁶ 滋养体置于一次性T-25培养瓶中）加入15 ml（或T-25培养瓶中加50 ml）TYI-S-33培养基（TYI肉汤添加3% Diamond维生素混合液、10%热灭活的成年牛血清、0.5 IU/ml青霉素和35 µg/ml链霉素）¹⁹ 在37 °C的培养箱中。
2. 在对数生长期收获滋养体，通常间隔48–96小时（图 1通过将培养管置于冰水浴中冷却 5–10 分钟，使附着在玻璃培养管上的滋养体释放。
3. 将培养物转移至锥形管中，反复倒置数次以分散细胞。使用血细胞计数板（Neubauer计数室）测定细胞数量，并将接种物转移至含有新鲜TYI-S-33培养基的培养管中。
   1. 使用较少数量的阿米巴原虫进行较长时间的孵育（约 3 x 10⁵ 细胞约5天）以及更短时间内的更高数量（约1 x 10⁶ 细胞培养约1天）。尽管使用计数后的接种物更理想，但已建立的培养体系具有可预测性，因此可采用估算的接种物体积。
   2. 滴定滋养体数量，以优化每次实验的细胞数目。
   3. 保留平行的重复培养物，以防意外污染或试管破裂。
4. 盖紧管盖，于37 °C、5°倾斜的水平角度下孵育。
5. 定期通过肉眼观察检查培养物，因为过度生长的培养物可能含有大量裂解的细胞。

2. MDCK 细胞培养的建立与维持

1. 在一次性 T-75 培养瓶中培养 MDCK（Madin Darby 犬肾）I 型（高电阻）细胞，加入 10 ml DMEM 培养基，培养基中添加青霉素（100 IU/ml）、链霉素（100 mg/ml）、胰岛素（0.08 U/ml）和 10% 新生小牛血清，在含 5% CO₂ 和 95% 空气的湿润环境中，37 °C 培养。
2. 传代细胞时，在倒置显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到约 85–100% 时进行传代。
3. 在无菌操作台中使用真空吸管和无菌玻璃巴斯德吸管移除培养液。为避免刮伤细胞，将培养瓶倒置，从瓶底角落吸除培养液。
4. 向 T-75 培养瓶中加入 10 ml 预热的 PBS（140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4）（T-25 培养瓶加 5 ml），轻轻晃动培养瓶以洗涤细胞，然后用真空负压吸除 PBS。由于血清会抑制胰蛋白酶活性，因此需要充分洗涤。
5. 向 T-75 培养瓶中加入 1.5 ml 0.05% 胰蛋白酶（T-25 培养瓶加 0.5 ml），轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶均匀覆盖细胞层。
6. 在培养箱中孵育 5–10 分钟（具体时间取决于胰蛋白酶活性）。
7. 将培养瓶对着光源观察，查看是否有细胞流动，以判断细胞是否脱落。也可使用显微镜观察细胞是否变圆脱落。通常，轻轻敲击培养瓶侧面可加速细胞脱落。
8. 向 T-75 培养瓶中加入 15 ml 添加了补充物的 DMEM 培养基（T-25 培养瓶加 5 ml），用移液器吹打 4 至 5 次，使细胞充分重悬。
9. 如需扩增细胞，用新鲜的完全 DMEM 培养基按 1:5 比例稀释细胞悬液。此时也可使用血细胞计数板测定细胞数量，但通常仅在将细胞分种至特定实验格式时才需要计数。

3. 滋养体总裂解液的制备

1. 将培养管置于冰水浴中冷却 5-10 分钟，使滋养体从培养管壁脱离。无菌操作将培养物转移至锥形管中，在 4 °C 条件下以 360 × g 离心 10 分钟。小心倾倒弃去上清液，向沉淀中加入冰冷的 PBS，反复倒置混匀以分散细胞，再在 360 × g 条件下离心 10 分钟。重复此步骤两次，以彻底去除 TYI-S-33 培养基残留。
2. 使用血细胞计数板测定滋养体数量。
3. 通过冻融循环裂解滋养体。取定量接种的滋养体（600,000 个滋养体/ml），用冰冷的 PBS 稀释后，迅速在液氮中速冻 1 分钟。在 4 °C 下解冻样品，并剧烈涡旋振荡。重复冻融过程 3 次，以完成细胞裂解。
4. 使用 0.02% β-巯基乙醇激活裂解物中存在的蛋白酶。

4. 滋养体分泌产物的制备

1. 执行步骤 3.1 至 3.2。
2. 使用血细胞计数板并通过台盼蓝排斥法²⁰测定此时的细胞数量和活力：
   1. 将 9 × 10⁶ 个滋养体悬浮于 3 ml 冰冷的 PBS 中，并转移至 50 ml 锥形管中。取 10 µl 该悬浮液，加入 1 µl pH 7.2 的 0.4% 台盼蓝储备液。
   2. 在低倍镜下使用牛鲍尔计数室（Neubauer chamber）进行细胞计数。
   3. 计数所有细胞，并区分蓝色细胞的数量，因为摄取染料而呈蓝色的细胞视为已死亡。
   4. 通过将活细胞数除以总细胞数再乘以 100，计算活细胞百分比。
3. 将含有滋养体悬浮液的锥形管置于 37 °C 培养箱中，以 5° 倾斜的水平角度孵育 2 小时。
4. 为收集分泌产物，以 360 × g 离心 10 分钟。使用一次性无菌注射器小心吸取上清液，避免沉淀中的滋养体污染样品。通过 0.22 μm 醋酸纤维素膜过滤上清液以去除任何残留细胞。加入 0.02% β-巯基乙醇以激活蛋白酶。
5. 为排除可能由死细胞释放分子造成的污染，需再次进行台盼蓝排斥法检测细胞活力。活细胞数与总细胞数应与步骤 4.2 中获得的结果一致。若不一致，则所收集的上清液可能不仅含有分泌蛋白，应予以弃用。

5. MDCK 细胞与滋养体、滋养体裂解物或分泌产物的相互作用

1. 将融合的 MDCK 细胞单层与活滋养体（MDCK 细胞与阿米巴的比例为 1:1）、滋养体裂解物（MDCK 细胞与阿米巴的比例为 1:2）或分泌产物（MDCK 细胞与阿米巴的比例为 1:10）在 37 °C 下共孵育 2 分钟和 30 分钟（图 2A）。
2. 用预冷的 PBS 洗涤上皮细胞五次，以去除未结合的分子或滋养体。

6. 免疫荧光样品的制备

1. 将 MDCK 细胞培养在置于 24 孔细胞培养板内的无菌玻璃盖玻片上。在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞达到 100% 汇合度。随后，更换为 1 ml 新鲜的含补充物的 DMEM 培养基，并将培养板转移至 37 °C 培养箱中继续培养 24 小时。
2. 使用真空抽吸装置和无菌玻璃巴斯德吸管移除培养基，每孔加入 1 ml 预热的 PBS。移除 PBS 后，用新鲜 PBS 重复洗涤一次。操作时注意避免玻璃吸管刮伤孔底的细胞。
3. 在各孔中加入用 1 ml 预热 PBS 稀释的不同处理条件的滋养体：活滋养体（T）、滋养体全裂解液（TL）和分泌产物（SP）。
   1. 将培养板放入培养箱中孵育 2 或 30 分钟。
   2. 设置两个对照组：一个为“0 分钟时间点”对照，即 MDCK 细胞不与E. histolytica共孵育，仅加入 1 ml 预热 PBS；另一个为二抗对照，在此条件下将 MDCK 细胞与 T、TL 或 SP 孵育 2 或 30 分钟，但在后续步骤中省略一抗孵育。
4. 用冷 PBS 对上皮细胞洗涤五次，以去除未结合的分子或滋养体。
5. 用 1 ml 96% 乙醇在 -20 °C 下固定并透化细胞，孵育 30 分钟。
6. 为去除乙醇，用 1 ml 室温 PBS 快速洗涤三次。
7. 以下步骤均需在湿盒中进行，以防止样品干燥：
   1. 使用任何可密闭的平底盒，在盒内放置湿润的纸巾，并将样品安全置于其上。例如，空的移液枪头盒即可满足此用途。
   2. 在湿盒内均匀铺一张 Parafilm 膜，每张盖玻片滴加 25 μl 封闭液（0.5% BSA）。
   3. 用精细镊子将盖玻片从孔中取出，用滤纸小心吸去边缘多余液体，然后将细胞面朝下放入含有封闭液（0.5% BSA）的液滴中。室温孵育 1 小时。
8. 在 PBS 中配制一抗混合液：小鼠 IgM 抗 EhCPADH112 抗体（mα-EhCPADH112；1:10 稀释）和兔 IgG 抗 ZO-1 抗体（pα-ZO-1；1:100 稀释）。
9. 在湿盒内放置一张新的 Parafilm 膜，每张盖玻片滴加 25 μl 抗体溶液。
10. 将盖玻片从封闭液中取出，用滤纸吸干边缘多余液体，细胞面朝下放入含抗体溶液的液滴中。4 °C 过夜孵育。
11. 将每张盖玻片放回 24 孔板的一个孔中（细胞面朝上），每孔加入 1 ml PBS。
    1. 用 1 ml PBS 洗涤五次，以去除未结合的抗体。
12. 在 PBS 中配制荧光二抗混合液：FITC 标记的山羊抗小鼠 IgM 抗体（1:100 稀释）和 TRITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体（1:50 稀释）。
13. 在湿盒内放置一张新的 Parafilm 膜，每张盖玻片滴加 25 µl 二抗溶液。
14. 参照步骤 6.10 转移样品，在避光条件下室温孵育 1 小时，以防止荧光染料漂白。重复步骤 6.11.1。
15. 进行细胞核染色时，在避光条件下室温用 200 μl 0.05 mM DAPI 溶液孵育 3 分钟。重复步骤 6.11.1。
16. 为保护荧光信号，将盖玻片（细胞面朝下）置于载玻片上的 5 μl Vecta Shield 抗荧光淬灭封片液中。用指甲油封边，防止样品干燥。
17. 长期保存时，将载玻片置于显微镜载玻片盒中，于 -20 °C 保存。
18. 通过共聚焦显微镜进行 Z 轴层扫和 xz 平面成像分析样品（图 2A）。

7. 用蛋白酶抑制剂或特异性抗体孵育滋养体

1. 重复步骤 3.1 至 3.2。针对每种实验条件，将 1 × 10⁵ 个滋养体（重悬于 50 μl PBS 中）与蛋白酶抑制剂（1 mM Complete 和 40 µg/ml E-64）或 30 µg 针对 EhCPADH112 的单克隆抗体（mαEhCPADH112）²¹ 在 4 °C 下孵育 20 分钟（图 2B）。将这些样品用于步骤 8.5 中所述的共孵育实验。

8. 跨上皮电阻（TER）的测量

1. 在无菌的 transwell 可渗透支持膜（0.4 μm 孔径）上培养 MDCK 细胞。在上室中加入 100 μl 细胞悬液，在下室中加入 600 μl 添加补充物的 DMEM 培养基。
   1. 定期检查培养基液面，根据需要添加新鲜培养基。
   2. 在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞达到 100% 汇合度。每 2–3 天更换一次培养基。
   3. 为增强细胞贴壁（如需要），可在加入细胞悬液前，将 transwell 滤膜在 DMEM 中于 37 °C 下平衡过夜。
2. 在生物安全柜中，将 STX2 电极依次浸入乙醇和无菌 PBS 中各 15 分钟进行灭菌处理，期间保持紫外灯照射。将电极连接至 EVOM 上皮细胞伏特-欧姆计，并选择电阻模式。
3. 收集每个 transwell 上室中的培养基并混合。取 50 μl 该混合培养基，与 50 μl 滋养体悬液（含 1 × 10⁵ 个滋养体的 PBS 悬液）混合，或仅与 PBS 混合（对照组）。每个 transwell 使用相同的混合液。
4. 将上述混合液加入含有 MDCK 细胞的 transwell 上室中。实验条件包括：不含滋养体的 MDCK 细胞（对照组）、与滋养体共培养，或与经蛋白酶抑制剂或 mαEhCPADH112 预孵育的滋养体共培养。为消除滤膜本身带来的电阻，使用仅含培养基的 transwell 作为空白对照。每种实验条件至少使用三个 transwell。
5. 立即使用 STX2 电极插入每个 transwell 中测量 TER（跨上皮电阻）。
   1. 确保较长的电极接触下室底部，较短的电极被上室中的液体完全浸没（见 图 2B）。
   2. 每次测量时务必保持电极垂直，这将显著提高实验重复性。测量过程中避免移动或倾斜电极，以免引起数据波动。
6. 该时间点的测量值视为初始 TER 值。随后，在接下来的 30 分钟内持续监测 TER 变化。
7. 计算最终 TER 值时，需减去仅滤膜的 TER 值。为比较不同实验的结果，将每个数据点相对于初始值进行归一化处理，以初始值为 100%（图 2B）。

结果

要成功培养E. histolytica，必须满足两个重要条件：无菌条件下培养以及在对数生长期收获。过去，E. histolytica的培养通常依赖于某些细菌或锥虫科原虫的共存²²。然而，如今普遍采用无菌培养方法，即在无代谢性细菌、真菌、原生动物或后生动物细胞的环境中对阿米巴进行无限次传代培养。此外，在生长的晚期对数期至早期稳定期收获滋养体，对于获得具有活力并能持续增殖的细胞至关重要²³。因此，必须通过连续数天对滋养体数量进行定量，并结合观察其完整的形态结构和快速运动能力来准确判断该生长阶段（图 1）。

在进行相互作用研究时，上皮细胞需要形成融合的单层，以模拟溶组织内阿米巴在体内通常会遇到的生理条件。目前已有多种易于培养的上皮细胞系可供使用。尽管来源于肠道（如Caco-2或T84细胞系）的细胞模型更具生理相关性，但这些细胞系生长较慢。相比之下，MDCK细胞是一种生长迅速且已被广泛研究的细胞系²⁴。这类上皮细胞来源于肾脏，具有高跨上皮电阻（TER）、紧...

讨论

为了研究 体外 上皮感染过程中宿主与病原体的相互作用 E. histolytica，必须使用已建立良好的上皮细胞和滋养体培养物。例如，以前， E. histolytica 培养物通常与某些种类的细菌或锥虫动质体（trypanosomatids）共同建立^22,23。然而，共培养 E. histolytica 共培养对于宿主-病原体相互作用的研究是适得其反的，因为观察到的宿主细胞效应无法明确归因于阿米巴原虫，而可能是共培养细胞所导致的效应。因此，一种无菌培养的 E. histolytica 有利于特定宿主-病原体相互作用的研究。本方案描述了如何进行这种无菌培养 E. histolytica 可实现对这些培养物的特异性利用，以开展感染研究。此外，收获的时机 E. histolytica 也至关重要。 E. histolytica 建议在指数生长后期进行收获，以确保获得高产量且高活力的细胞。

另一方面，获得可重复实验结果的前提...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶组织内阿米巴 HM1:IMSS，克隆A	墨西哥 IMSS 医院	无/编号	致病性滋养体18
TYI 肉汤	Becton, Dickinson and Company 默克 默克 默克 J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate 蛋白胨 58 mM 葡萄糖 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2人类表型本体4 16.3 mM 抗坏血酸 8.1 mM L-半胱氨酸 0.1 mM 柠檬酸铁铵，调节 pH 至 6.819
牛血清成年	Microlab，Labs.，墨西哥	SU146	使用浓度为10%，并在56℃下灭活 °30 分钟，4 °C
戴蒙德  维生素  混合物- Tween 80	体外	SR-07	使用浓度为3%
青霉素	湖畔，  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
链霉素	湖畔，  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml 螺口培养管，配有聚四氟乙烯衬垫酚醛树脂盖	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm，容量 15 ml，瓶盖由耐温度变化的特殊配方材料制成
细胞培养板，6孔	Corning-Costar	3516	无菌培养板，孔径 34.8 mm，生长面积 9.5 cm2.  盖子上的环可防止交叉污染
25 cm2 细胞培养瓶	康宁-科斯特	430168	斜颈烧瓶
MDCK（Madin Darby 犬肾）I 型	美国典型培养物保藏中心	CCL34	60 之间的肾上皮细胞th 和 90th 传代
DMEM 培养基	Gibco	12800-017	高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基
新生小牛血清	体外	S-02	使用浓度为10%。
青霉素/链霉素混合液	体外	A-01	储存液 10,000 U/µg/ml
胰岛素	AMSA	398MJ94SSA IV	储存液 100 IU/ml
胰蛋白酶溶液	体外	EN-005	不含钙和镁的0.05%酶溶液
75 cm2 细胞培养瓶	Corning-Costar	430720	斜颈培养瓶用于TYI-S-33培养基中滋养体的培养
Transwell 可渗透支持膜	Corning-Costar	3470	0.4 µm 多孔聚酯膜，6.5 mm 插入式培养小室，24 孔板，生长面积 0.3 cm²2
24孔细胞培养板	康宁-科斯特	3524	透明聚苯乙烯，经处理以促进细胞最佳贴附，经γ射线灭菌，并经认证为无热原
完整迷你装	罗氏	11836 153 001	蛋白酶抑制剂混合物可抑制多种丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。终浓度为 1 mM
反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰胺基(4-胍基)丁烷（E-64）	SIGMA-Aldrich	E3132	半胱氨酸蛋白酶抑制剂，终浓度 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	兔多克隆IgG  抗体  对抗  人ZO-1蛋白中部区域的合成肽
mαEhCPADH112	自制抗体	无/编号	小鼠单克隆IgM抗体  对抗  位于 EhCPADH112 C 末端的 444-601 表位21,27
FITC-山羊抗小鼠IgM	Zymed	62-6811	异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗小鼠二抗  抗体
TRITC-山羊抗兔IgG（H+L）	Zymed	816114	四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）标记的  山羊抗兔 IgG  二抗
STX2 电极	World Precision Instruments	102711	由一对固定的双电极组成，电极宽4 mm，厚1 mm。每根电极棒包含一个用于测量电压的银/氯化银 pellet 和一个用于通电流的银电极。适用于EVOM
EVOM 上皮伏欧计	世界精密仪器	12111	使用电阻模式，并在测量 TER 期间保持未插入状态
血细胞计数板	MEARIENFELD	610610	血细胞计数板
Leica TCS_SP5_MO	Leica	无/编号	激光共聚焦显微镜，使用 Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN 软件
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	荧光封片剂
4',6-二氨基-2-苯基吲哚（Dapi）	SIGMA	D-9542	0.05 mM 终浓度
牛血清白蛋白（BSA）	US Biological	A-1310	0.5%  封闭液的终浓度