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方法文章

通过共聚焦显微镜评估分离肺泡巨噬细胞的抗真菌活性

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DOI：

10.3791/51678

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2014年7月9日

 ,  , 
1Department of Medicine, Roswell Park Cancer Institute, 2Department of Medicine, School of Medicine and Biomedical Sciences, University of Buffalo

本文内容

摘要

一种通过共聚焦显微镜评估分离的小鼠肺泡巨噬细胞控制吞噬的Aspergillus孢子生长能力的方法。

摘要

肺是宿主细胞经常暴露于微生物及其产物的界面。肺泡巨噬细胞是接触吸入性真菌及其他微生物的第一道吞噬性细胞。巨噬细胞和其他免疫细胞能够识别 曲霉属 病原体识别受体识别病原相关分子模式并启动下游炎症反应。吞噬细胞NADPH氧化酶可产生活性氧中间产物（ROIs），在宿主防御中发挥关键作用。尽管NADPH氧化酶对中性粒细胞介导的宿主防御至关重要1-3，NADPH 氧化酶在巨噬细胞中的重要性尚不明确。本研究旨在阐明 NADPH 氧化酶在巨噬细胞中介导宿主防御反应中的特定作用 A. fumigatus我们发现肺泡巨噬细胞中的NADPH氧化酶可调控被吞噬细菌的生长 A. fumigatus 孢子4. 此处，我们描述一种评估小鼠肺泡巨噬细胞（AMs）控制被吞噬细菌生长能力的方法 曲霉属 分生孢子（分生孢子）。肺泡巨噬细胞被染色 体内 10 天后通过支气管肺泡灌洗（BAL）从小鼠中分离。将巨噬细胞接种于玻璃盖玻片上，随后接种表达绿色荧光蛋白（GFP）的 A. fumigatus 孢子。在指定时间点固定细胞，并通过共聚焦显微镜评估吞噬孢子的完整巨噬细胞数量。

引言

肺泡巨噬细胞是接触吸入性微生物的第一道吞噬细胞防线。巨噬细胞通过病原体识别受体识别曲霉菌的分子模式，吞噬并限制吸入孢子（分生孢子）的生长，同时启动炎症反应。吞噬细胞NADPH氧化酶将分子氧转化为超氧阴离子及其下游的活性氧中间产物（ROIs）。慢性肉芽肿病（CGD）是一种遗传性NADPH氧化酶功能障碍疾病，其特征为严重的细菌和真菌感染以及过度的炎症反应。

尽管NADPH氧化酶在中性粒细胞介导的宿主防御中至关重要1-3，但其在巨噬细胞中的作用尚不明确。先前的研究表明，肺泡巨噬细胞能够吞噬并杀灭Aspergillus孢子，而中性粒细胞主要针对菌丝阶段5。然而，关于NADPH氧化酶在巨噬细胞控制A. fumigatus孢子生长中的作用，已有研究结果存在争议6,7。

该方法旨在阐明NADPH氧化酶在巨噬细胞中介导宿主防御反应的特定作用 A. fumigatus 孢子。我们发现肺泡巨噬细胞中的NADPH氧化酶可调控被吞噬孢子的生长 A. fumigatus 孢子4为了最接近地模拟宿主对吸入性真菌的免疫应答，我们采用未受刺激的小鼠在处死后立即通过支气管肺泡灌洗获取的肺泡巨噬细胞。使用分离的肺泡巨噬细胞使我们能够在无其他免疫细胞干扰的情况下，专注于研究其抗真菌活性例如, 招募的中性粒细胞）可防御 曲霉菌体内研究在此方法中，肺泡巨噬细胞被染色 体内 收获前进行，以尽量减少收获后的操作步骤。

该方案的另一个优势在于使用了表达绿色荧光蛋白（GFP）的A. fumigatus菌株。该真菌从分生孢子阶段到菌丝阶段均表达GFP，无需额外染色。为了获得更详细的图像，我们选择了共聚焦显微镜，该技术能够从获取的图像中重建三维结构。三维重建使得我们能够区分在巨噬细胞周围生长而非进入或穿过巨噬细胞内部的菌丝，同时也能准确区分分生孢子位于细胞内还是细胞外。

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方案

本研究中对动物进行的所有操作均经罗斯威尔公园癌症研究所动物护理与使用委员会批准，并符合所有州级、联邦及美国国立卫生研究院的相关规定。

1. 体内 巨噬细胞标记

注意：PHK26 是一种脂溶性染料，静脉注射（i.v.）后可被循环系统及组织中的吞噬细胞摄取。PHK26 已被用于 体内 通过标记以尽量减少巨噬细胞收获后的操作。PKH-26 的优势在于可在肺泡巨噬细胞中长期稳定积累。给予标记后等待10天，可使循环中所有标记细胞被清除，仅留下稳定标记PKH26的肺泡巨噬细胞。8,9PKH26 是一种红色荧光染料，其激发波长为 551 nm，发射波长为 567 nm，适用于罗丹明或藻红蛋白检测系统。任何标记方法均可能引入人为假象，包括细胞活力的降低。然而，由于我们在不同小鼠基因型的巨噬细胞标记中采用相同的方法（例如，野生型与NADPH氧化酶缺陷型，这些伪影的影响将是均匀的。

  1. 将PKH26储备液（1 × 10-3 M，溶于乙醇）用厂家提供的稀释液C按1:5比例稀释。
  2. 每只小鼠取100 µl稀释后的PKH26溶液，装入1/2 ml胰岛素注射器（29 G × 1/2”）中。
  3. 通过静脉注射（尾静脉或眶后静脉）给予小鼠，注射时间至少在处死取材前10天进行。

2. 通过支气管肺泡灌洗（BAL）收获肺泡巨噬细胞

实验所需小鼠的数量可能有所不同。一只未受刺激的小鼠通常可获得约 3-5 × 105 个肺泡巨噬细胞，但该数量会因小鼠体型、执行灌洗操作人员的经验，以及灌洗液灌注次数和从肺部回收液体的体积等因素而有较大差异。本方案中，肺灌洗是在胸腔闭合的情况下进行的，结合多次 1 ml 的灌洗操作，有助于提高细胞收获量。

  1. 在无菌条件下，通过腹腔注射（i.p.）给予小鼠致死剂量的戊巴比妥麻醉剂（12.5 mg），实施安乐死，以保持溶液无菌。
  2. 用70%乙醇彻底喷洒小鼠全身。
  3. 从动物颅端开始剥离皮肤，暴露胸腔（图1A）。
    1. 在膈膜下方的皮肤处做一个小切口。
    2. 将手指插入切口，从动物颅端方向将皮肤向后拉离（图1A）。
    3. 轻轻向上推动头部，使颈部腹侧伸展（图1A）。
  4. 在肋骨笼上切一个小孔，穿入胸腔右侧，以使肺部放气，并在后续步骤中便于观察肺组织。
  5. 定位气管，并小心剥离周围组织。
    1. 使用弯头镊子移除唾液腺、胸骨舌骨肌和喉部等结构。
    2. 用弯头镊子轻轻提起气管表面覆盖的薄层组织（外膜），并用剪刀剪除，暴露出下方环状软骨结构。
  6. 将导管插入气管。
    1. 使用弯头镊子，在气管后方（背侧）穿入缝合线，并将约10 cm长的缝线从开口处拉出。
    2. 从环状软骨上方（增厚的软骨环）开始，小心地将22 G导管沿气管向下引导，直至气管隐没于胸骨后方的位置。
    3. 将缝线在气管和导管周围牢固打结，确保紧密固定。随后从导管中取出针芯。
  7. 组装四通旋塞阀。
    1. 取一支6 ml注射器，装入含1% FBS的DPBS溶液，并按图1B所示连接至四通旋塞阀。
    2. 在四通旋塞阀指定位置连接另一支空的6 ml注射器（图1B）。
    3. 将四通旋塞阀的开放端口连接至导管（图1B）。注意避免导管从气管中脱出。
  8. 收集肺泡灌洗液。
    注意：研究者可选择使用较低体积的灌洗液，以尽量减少对组织的损伤风险。所有小鼠组应一致采用相同的操作方式。
    1. 旋转旋塞阀手柄，使空注射器处于关闭状态，然后缓慢注入约1 ml含1% FBS的DPBS，使肺部膨胀。通过第2.4步所开的孔观察肺部膨胀情况。
    2. 注意切勿过度膨胀肺部。
    3. 旋转旋塞阀手柄，使已注满的注射器关闭，然后小心从肺部回抽液体。
    4. 通过第1.4步所开的孔观察肺部回缩情况。可轻微前后移动导管以获得良好的回吸效果。务必特别注意保持导管位于气管内。
    5. 重复步骤2.8.1–2.8.4共5–6次，直至所有含1% FBS的DPBS均已注入并回抽完毕。注意：肺灌洗液的回收率不会达到注入液体的100%。
  9. 将含有灌洗液的注射器内容物排入50 ml锥形离心管中。细胞样本置于室温保存。
  10. 在室温下以300 × g离心5分钟，沉淀细胞，倾去上清液。若需要，上清液可保留用于细胞因子分析。
  11. 用1–5 ml含10% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，使用血细胞计数板进行细胞计数。在未刺激的小鼠中，经支气管肺泡灌洗（BAL）获取的细胞中预计有>95%为巨噬细胞，可通过细胞学分析确认。

3. 真菌的培养与收获

Aspergillus fumigatus 在本实验方案中表达绿色荧光蛋白（GFP），在其生命周期的所有阶段（包括孢子、萌发菌丝和菌丝）均表达。该真菌菌株由加拿大不列颠哥伦比亚省本拿比市西蒙弗雷泽大学的 Margo Moore 博士提供。

  1. 在含有氯霉素（0.05 g/L）和庆大霉素（0.5 g/L）的沙氏脑心浸液（BHI）琼脂斜面上接种表达绿色荧光蛋白（GFP）的Aspergillus fumigatus分生孢子。
  2. 室温下避光孵育，瓶盖松开，培养7至10天。
  3. 用10 ml含0.01% Tween 20的DPBS冲洗斜面以收集分生孢子。用移液器轻轻刮擦菌体以使孢子脱落。多次冲洗斜面以提高收获量。
  4. 将分生孢子悬液通过100 µm细胞滤网过滤至50 ml锥形离心管中。
  5. 以400 × g离心10分钟，收集分生孢子沉淀。
  6. 用50 ml DPBS重悬分生孢子，并使用血细胞计数板进行计数。
  7. 用DPBS洗涤两次，并稀释至所需浓度。

4. 真菌攻击与共聚焦显微镜观察

为了研究巨噬细胞NADPH氧化酶在宿主防御中的作用，评估了来自三种基因型小鼠的分离肺泡巨噬细胞控制吞噬的Aspergillus孢子生长的能力。本研究中使用的基因型包括：1）野生型小鼠；2）Ncf1*/* Mn- 小鼠，其携带一种天然发生的Ncf1突变（Ncf1编码p47phox，即吞噬细胞NADPH氧化酶所需的组分），导致NADPH氧化酶功能缺陷；3）Ncf1*/* Mn+ 转基因小鼠（MN表示在人CD68启动子调控下携带野生型Ncf1的转基因），在此小鼠中单核细胞/巨噬细胞群体的NADPH氧化酶活性得以重建10,11。

由于载玻片上存在未被吞噬的分生孢子并会继续生长，因此共聚焦显微镜最适合用于本实验。共聚焦显微镜可实现Z轴方向上各个层面的单独成像，从而能够区分在巨噬细胞外部生长而非内部生长的真菌。所有共聚焦图像均使用63倍油镜采集。Z轴层扫图像的电子放大倍数为2.5倍。Z轴层扫的厚度通过DAPI染色和明场图像确定，以定位视野的顶部和底部。Z轴层扫厚度范围为14至24 µm，每个切片厚度约为1 µm。在对巨噬细胞进行定量时，每种基因型选取10个视野，以1倍电子放大倍数进行单次扫描。完整巨噬细胞根据PKH26标记细胞膜和DAPI标记细胞核的情况进行识别。分生孢子则根据FITC荧光信号和明场图像进行识别。

  1. 准备无菌盖玻片和培养板
    1. 在生物安全柜内，将 22 × 22 mm 玻璃盖玻片浸入 70% 乙醇中 5–10 分钟。
    2. 用无菌 PBS 清洗盖玻片。
    3. 使用无菌镊子，将单个盖玻片轻轻放入无菌单层包装 6 孔板每个孔的底部。
  2. 将约 1 × 106 个收获的、PKH26 标记的肺泡巨噬细胞重悬于 300 µl RPMI 1640（含 10% FBS）中，接种至每张盖玻片上。具体细胞数量可根据收获产量适当调整。
  3. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜，使巨噬细胞贴附。
  4. 次日上午，向每孔中加入约 1 × 107 个表达 GFP 的 A. fumigatus 分生孢子，悬浮于 100 µl 预热（37 °C）的 RPMI 1640（含 10% FBS）中。
  5. 将培养板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中继续孵育。
  6. 细胞固定时间至少为室温下 2 小时或 4 °C 过夜。在 3、7 和 14 小时时，向每孔加入等体积的 2% 甲醛（最终浓度为 1% 甲醛）进行固定。早期时间点的培养板置于 4 °C 过夜；最终时间点（14 小时）的细胞在室温下固定 2 小时。
  7. 固定后，用镊子小心取出盖玻片，并用 DPBS 冲洗。
  8. 将盖玻片边缘轻靠折叠的 Kimwipe 纸巾以去除多余液体。
  9. 在载玻片上滴加 6 µl 含 DAPI 的荧光封片剂。
  10. 将盖玻片一侧边缘接触载玻片，然后轻轻放下，使细胞面朝下浸入封片剂中。封片剂将自动扩散并在盖玻片下形成均匀薄层，无需按压盖玻片。
  11. 用透明指甲油密封盖玻片边缘，并静置晾干。
  12. 将制备好的载玻片存放在载玻片盒中（避光），于室温保存，直至进行共聚焦显微镜分析。

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结果

通过支气管肺泡灌洗（BAL）从未受刺激的小鼠中收集肺泡巨噬细胞，根据细胞学分析可获得 > 95% 纯度的细胞群体。3 小时和 7 小时（图 2）的时间点处于真菌生长的菌丝阶段之前，可用于比较不同基因型对分生孢子的吞噬效率。14 小时时间点可用于评估不同基因型抑制被吞噬分生孢子向组织侵袭性菌丝阶段转化的能力（图 3）。通过共聚焦显微镜观察，可根据细胞膜和细胞核分别经 PKH26 和 DAPI 染色来识别完整的巨噬细胞（图 2 和 图 3）。分生孢子和菌丝则根据其 GFP 表达进行识别（图 2 和 图 3）。

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讨论

使用这种方法进行 离体 巨噬细胞抗真菌活性的分析 体内 真菌攻击，我们先前已证明，巨噬细胞中的NADPH氧化酶在抵御过程中发挥重要作用 A. fumigatus4使用分离的肺泡巨噬细胞可使我们在无其他免疫细胞干扰的情况下，专注于研究其抗真菌活性例如, 招募的中性粒细胞）可防御 曲霉菌体内实验.

已采用多种可视化策略来评估巨噬细胞的抗真菌活性 体内 和 离体Luther 等人利用共聚焦显微镜研究了吞噬作用 曲霉属 人（来自肺移植受者）和小鼠肺泡巨噬细胞对分生孢子的吞噬12. Geunes-Boyer 等人表征了以下两者之间的相互作用 Candida krusei 吞噬作用后的小鼠巨噬细胞。他们使用了巨噬细胞系RAW264.7以及来自腹膜的原代巨噬细胞13Garcia-Rodas 等人研究表明，表面活性蛋白 D 可结合并促进吞噬作用及...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国过敏与传染病研究所资助项目R01AI079253（资助给B.H.S.）以及美国国家癌症研究所癌症中心支持资助项目CA016056（资助给罗斯韦尔公园癌症研究所）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
通用细胞膜标记用 PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒SigmaPKH26GL-1KT
2,2,2-三溴乙醇SigmaT48402用于配制 Avertin 麻醉剂
2-甲基-2-丁醇SigmaA-1685用于配制 Avertin 麻醉剂
Dulbecco's 磷酸盐缓冲液（不含钙和镁）Corning21-031-CV
NH4ClSigmaA0171用于配制 ACK 红细胞裂解缓冲液
KHCO3SigmaP91444用于配制 ACK 红细胞裂解缓冲液
EDTASigmaE6758用于配制 ACK 红细胞裂解缓冲液
22 G × 1.00 英寸静脉留置导管BD381523Insyte Autoguard 带翼型
胰岛素注射器
6 ml 注射器
四通止流阀Fisher Scientific50-700-077
缝合线
50 ml 圆锥形离心管
纱布海绵（4 英寸正方形）
含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基Corning10-040-CV
胎牛血清HycloneSH30396.03经热灭活处理
Hema 3 染色试剂盒Fisher Scientific22-122-911
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-4
含氯霉素和庆大霉素的沙氏脑心浸液琼脂斜面BD297252
Aspergillus fumigatous 菌株（表达绿色荧光蛋白）由加拿大不列颠哥伦比亚省本纳比市西蒙弗雷泽大学 Margo Moore 博士提供
100 μm 细胞筛BD Falcon64753-00
剪刀
镊子
II 级生物安全柜
配备摆动桶转子的 Sorval ST40 离心机
Leica DM1000 光学显微镜
血细胞计数板
Cytospin 2 离心机Thermo Scientific
细胞培养孵箱37 °C，5%  CO2
22 × 22 mm 显微盖玻片VWR48366-227玻璃盖玻片
6 孔细胞培养板Corning3506
10% 中性缓冲福尔马林VWRBDH0502-1LP
含 DAPI 的 Vectashield 封片剂Vector LaboratoriesH-1200
搭载激光点扫描仪的 Leica TCS SP2 系统安装于 DMIRE2 荧光显微镜上

参考文献

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